丁和國， 徐玥△， 王近瑜， 劉順林

1湖州市第三人民醫(yī)院呼吸科(浙江湖州 313000)； 2湖州市中心醫(yī)院呼吸科(浙江湖州 313000)； 3蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科(江蘇蘇州 215600)

盡管目前在非小細胞肺癌的診斷和治療上有了很大進步，但它仍然是全球因腫瘤引起死亡的主要病因之一，嚴重威脅著人類健康[1-2]。肺癌是一種由多個階段和步驟參與發(fā)生、發(fā)展的惡性腫瘤，在不同階段可能有不同基因起作用[3]。研究表明，長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)主要參與基因表達的表觀遺傳調(diào)控，通過將核糖核蛋白復合物引入特定的基因組位點來啟動組蛋白甲基化[4-5]，在腫瘤的生長、發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移等生物學過程中起著非常重要作用。Lnc00673作為癌基因，屬于一種長鏈非編碼RNAs，有可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著顯著作用[6-8]。本研究通過檢測Lnc00673蛋白在肺腺癌組織中的表達，觀察Lnc00673蛋白與臨床病理資料的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標本 84例肺腺癌標本(肺腺癌組)收集于2008年6月至2017年1月在湖州市第三人民醫(yī)院及湖州市中心醫(yī)院經(jīng)穿刺活檢或手術(shù)切除、并通過病理檢查確診的組織標本，所有實驗標本獲取前未采取包括化療的任何治療，其中男48例，女36例，年齡38～75歲，平均60.54歲；對所有患者手術(shù)之前都給予胸腹部CT、頭顱CT及骨掃描等檢查，按照肺癌TNM臨床分期：84例肺腺癌組織中Ⅰ、Ⅱ期52例，Ⅲ、Ⅳ期32例；并通過淋巴結(jié)穿刺或術(shù)前淋巴結(jié)切除活檢經(jīng)病理證實，44例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，30例對照組標本為肺癌旁組織(所有組織取材位于病變組織距離>2 cm，并通過病理檢查確定為肺正常組織)。

1.2 試劑與方法 實驗所用的蠟塊厚度為4 μm，經(jīng)過連續(xù)切片后進行免疫組化染色，實驗所用的SP免疫組化試劑盒及兔抗人Lnc00673單克隆抗體均從北京中山金橋生物有限公司購得。免疫組化(SP)方法檢測Lnc00673蛋白在肺癌組織中表達。采用抗體稀釋液代替作為陰性對照。檢測癌胚抗原(CFA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酯(NSE)、細胞角蛋白19片段(CYFRA211)水平。

1.3 結(jié)果判斷[9]判斷組織標本的具體著色程度則通過光學顯微鏡觀察。Lnc00673蛋白陽性表達主要為細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕褐色顆粒。通過高倍鏡下觀察4個不同的視野，均為隨機采取，計數(shù)表達陽性的細胞總數(shù)，采用百分比計分：表達陽性細胞的百分比≤10%計1分，表達陽性細胞百分比>10%而且≤50%計2分，表達陽性細胞百分比>50%且≤75%計3分，表達陽性細胞百分比>75%計4分；同時，根據(jù)細胞染色不同程度計分：表達為陰性計1分，表達為弱染色計2分，表達為中等染色計3分，表達為強染色計4分。陽性細胞數(shù)計分與細胞染色程度計分的乘積作為判斷結(jié)果：積分≤6分判斷為低表達，>6分則判斷為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc00673在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達情況 肺腺癌組Lnc00673高表達54例(64.3%)，低表達30例(35.7%)；癌旁組高表達0例(0%)，低表達30例(100%)。Lnc00673高表達率在肺腺癌組顯著高于癌旁組(2=18.55,P<0.000 1)。免疫組織染色結(jié)果圖1。

A：Lnc00673在肺腺癌組織中高表達；B：Lnc00673在肺腺癌組織中低表達；C：Lnc00673在肺癌旁組織中低表達圖1 Lnc00673蛋白在肺腺癌及肺癌旁組織中的表達情況(SP,×400)

2.2 Lnc00673在肺腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 在肺腺癌組織中檢測Lnc00673表達情況，其分期比較，Ⅲ、Ⅳ期較Ⅰ、Ⅱ期差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移上比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在發(fā)病年齡、性別、原發(fā)部位、分化程度以及腫瘤大小方面等臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 Lnc00673的表達與部分常用腫瘤指標檢測的關(guān)系 Lnc00673在肺腺癌表達與CEA升高與否比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與NSE、CYFRA211值高低差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

盡管當前對肺癌的治療手段，包括手術(shù)、放射治療及抗腫瘤藥物使用等方法不斷發(fā)展，但肺癌仍然是全球與腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[10]。作為肺癌的主要病理類型的非小細胞肺癌，主要包括腺癌和鱗癌2個亞型[11]。肺癌有非常高的病死率，這與其腫瘤細胞的不斷增殖及具有侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[12]。不容置疑，明白腫瘤惡性增殖的分子機制對腫瘤的有效治療至關(guān)重要。

近年來，非編碼RNAs(non-coding RNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用受到廣泛關(guān)注，非編碼RNAs主要有微小RNAs(microRNAs)和長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)。LncRNAs 的大小一般超過200個核苷酸，其存在于各種組織和細胞中，而且在機體的各個階段，如細胞分化、胚胎形成及腫瘤產(chǎn)生等方面都起著重要作用[13-14]。一些研究顯示，下調(diào)LncRNAs基因表達后，很多惡性腫瘤的生長增殖均受到明顯抑制。Lnc00673屬于LncRNAs中一種，其定位在17q25.1染色體上，長度約為2 275 nt[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)Lnc00673在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在非小細胞肺癌中Lnc00673可以通過下調(diào)NCALD基因(人類神經(jīng)鈣調(diào)素δ蛋白基因)的表達來促進腫瘤細胞的增殖[17]。

表1Lnc00673的表達與臨床病理特征的關(guān)系例(%)

表2 Lnc00673的表達與部分常用腫瘤指標檢測的關(guān)系

惡性腫瘤具有明顯的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，約90%的惡性腫瘤患者因為轉(zhuǎn)移導致死亡，但侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個相當復雜的臨床病理問題，目前對其相關(guān)機制尚不完全明了。許多諸如鱗狀細胞癌相關(guān)抗原(SCC)[18-19]、癌胚抗原(CEA)[20-21]、神經(jīng)元特異烯醇化酯(NSE)[22-23]等分子標志物在臨床上常常被用作惡性腫瘤包括肺癌的臨床診斷，但此類標志物在對早期診斷肺癌和對預后進行評估均缺乏足夠的特異性和敏感性。為了研究Lnc00673基因與肺腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，我們收集了84例肺腺癌與30例癌旁組織，通過免疫組化方法檢測Lnc00673蛋白的表達情況，并分析與其臨床病理因素之間的相關(guān)性。我們通過分析發(fā)現(xiàn)，Lnc00673蛋白在肺腺癌組織較肺癌旁組織表達明顯升高，而且Lnc00673蛋白的表達程度與肺腺癌的臨床分期、有無發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與性別、年齡、分化程度、原發(fā)部位及腫瘤大小無關(guān)。值得注意的是，已有相關(guān)學者從肺癌的細胞生物學角度研究發(fā)現(xiàn)干擾Lnc00673基因表達后可抑制肺腺癌細胞的增殖，但對于其具體作用機制尚待進一步研究[24-25]。由此我們認為，Lnc00673基因可能在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展等機制上起重要作用。CEA、NSE、CYFRA211是目前在臨床上作為腫瘤檢查的常用指標，通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)CEA在Lnc00673蛋白高表達組升高較低表達組比較有明顯差異，所以我們認為在臨床上可以通過聯(lián)合檢測Lnc00673蛋白和CEA來診斷肺腺癌，以提高對肺腺癌診斷的敏感性。

綜上所述，Lnc00673在肺腺癌組織中呈現(xiàn)高表達，并與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，其有可能在肺腺癌的發(fā)生中起著一定的作用。