王璐璐 吳子建 蔡榮林 胡玲 劉磊 余情 何璐

〔摘要〕 目的 探究電針經(jīng)穴效應(yīng)、后效應(yīng)，比較電針心經(jīng)原穴“神門”與肺經(jīng)原穴“太淵”后在急性心肌缺血（AMI）模型大鼠心肌組織內(nèi)超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道4（HCN 4）mRNA與蛋白表達(dá)的影響。方法 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針“神1”組、電針“神2”組、電針“太1”組、電針“太2”組，每組10只。模型組、電針組復(fù)制AMI模型，電針組在模型復(fù)制后1 d予以7 d的治療，電針最后一次即刻和次日同等時間分別取材，每組6只。以RT-qPCR、western-blot法分析心肌組織HCN4 mRNA相對表達(dá)量及蛋白平均相對表達(dá)量。結(jié)果 HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)量：與正常組比較，模型組表達(dá)量二者顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，“神1”“神2”和“太1”組二者表達(dá)量顯著增多（P<0.01）;與“神1”組比較，“神2”“太1”和“太2”組二者表達(dá)量顯著減少（P<0.01）;與“神2”組比較，HCN4 mRNA 相對表達(dá)量“太2”組顯著減少（P<0.01），HCN4蛋白表達(dá)量“太2”組顯著減少（P<0.01）;與“太1”組比較，“太2”組二者表達(dá)量顯著減少（P<0.01）。結(jié)論 電針“神1”“神2”“太1”組在治療AMI大鼠模型中，能顯著增加HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)量，電針“神1”組效果最為顯著，電針“神門”和“太淵”均具有后效應(yīng)，二者具有相對特異性差異且在一定程度上有持續(xù)的后效應(yīng)的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕 急性心肌缺血;神門穴;太淵穴;相對特異性;超極化激活;環(huán)核苷酸門控通道

〔中圖分類號〕R245 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.014

〔Abstract〕 Objective To explore the acupoint effects and the post-effect of electroacupuncture， and to compare the effects of expression on cyclic nucleotide gated channel 4 （HCN 4） mRNA and protein activated by hyperpolarization in myocardial tissue in rats with acute myocardial ischemia （AMI） after electroacupuncture at the heart channel original point Shenmen （HT7） and the lung channel original point Taiyuan （LU9）. Methods The rats were randomly divided into a normal group， a model group， an electroacupuncture "Shen1" group， an electroacupuncture "Shen2" group， an electroacupuncture "Tai1" group， and an electroacupuncture "Tai2" group， with 10 rats in each group. AMI models were replicated in the model group and the electroacupuncture group. The electroacupuncture group was treated 7 days after the model was replicated 1 day， and 6 AMI models were taken from each group immediately at the last time and at the same time the next day. The relative expression of HCN4 mRNA and the relative expression of protein in myocardial tissue were analyzed by RT-Qpcr and western-blot. Results HCN4 mRNA and protein expression levels： compared with the normal group， the expression levels in the model group were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the model group， the expression levels of "Shen1"， "Shen2" and "Tai1" groups were significantly increased （P<0.01）. Compared with "Shen1" group， the expression levels of "Shen2"， "Tai1" and "Tai2" groups were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the "Shen 2" group， the relative HCN4 mRNA expression in the "Tai2" group were significantly decreased （P<0.01）， and the HCN4 protein expression in the"Tai2" group was significantly decreased （P<0.01）. Compared with the "Tai1" group， the relative expression in the "Tai2" group was significantly reduced （P<0.01）. Conclusion The electroacupuncture "Shen1"， "Shen2" and "Tai1" groups can significantly increase the expression level of HCN4 mRNA and protein in the AMI rat model. The electroacupuncture "Shen1" group has the most significant effects. The electroacupuncture at both Shenmen （HT7） and Taiyuan （LU9） have post-effect， and the two have relatively specificity and have a sustained expression of persistence to some extent.

〔Keywords〕 acute myocardial ischemia; Shenmen （HT7）; Taiyuan （LU 9）; relatively specificity; hyperpolarization activation; cyclic nucleotide gated channel

急性心肌缺血（acute myocardial ischemic， AMI）及梗死（infarction）后引起惡性心律失常導(dǎo)致心源性猝死（sudden cardiac death， SCD）發(fā)生率越來越高，其防治目前始終是心血管疾病研究范疇的重難點。電針對保護(hù)心臟有積極治療作用，于心律失常、冠心病心絞痛和AMI均有良好效應(yīng)，故電針已在醫(yī)學(xué)臨床上得到了普及應(yīng)用[1-3]，但我們應(yīng)深入探究其作用機(jī)制。

超極化激活的電流[1]（hyperpolarization-activated current， Ih）因受自主神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控可廣泛參與對心臟的生理活動，同時其受超極化激活的環(huán)核苷酸門控（hyperpolarization-activated cyclic nucleotidegated， HCN）通道的介導(dǎo)。Ih異?？梢援a(chǎn)生心臟方面的疾病，因其可調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的同時亦影響著某些病理狀態(tài)的變化[4-6]。我們前期實驗[7-10]已證實電針擁有相對特異性且與多種神經(jīng)遞質(zhì)有相互聯(lián)系，電針心經(jīng)保護(hù)心臟即是通過自主神經(jīng)調(diào)控的。本研究在前期基礎(chǔ)上，比較電針心經(jīng)的原穴神門”和肺經(jīng)的原穴“太淵”后，在不同時間點AMI模型大鼠心肌組織HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)情況，從改善心臟自主神經(jīng)活動，電針心經(jīng)與肺經(jīng)效應(yīng)的相對特異性，以及電針后效應(yīng)的相對特異性等方面研究，為深入探討電針經(jīng)穴效應(yīng)相對特異性提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

同條件普食喂養(yǎng)60只普通健康雄性SD大鼠，購自安徽省實驗動物中心，許可證號：scxk（皖）2011-002，體質(zhì)量為（250±20）g。實驗過程嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[11]。

1.2 ?主要儀器與試劑

主要儀器：華佗牌SDZ-V型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）;Powerlab 8生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments公司）; PIKO Plate Illuminator（美國Thermo公司）;全自動凝膠成像系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）。

主要試劑：三氯甲烷（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，20151020）;快速PCR反應(yīng)試劑盒（Qiagen（凱杰）公司，151034942）;引物合成（美國英杰生命技術(shù)有限公司）;DEPC（美國Sigma公司，20150802554）; Trizol（美國英杰生命技術(shù)有限公司，批號：101002）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（第一鏈c DNA合成試劑盒，Thermo公司，00287813）;ECL超敏發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司，QE218149）;beta-Actin（北京中杉）;免抗HCN4（Bioss，bs-1691R，129kDa）。

1.3 ?模型復(fù)制及評價

將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針“神門”組（此組分為2組，電針“神門8”組簡稱為“神1”組，電針“神門9”組簡稱為“神2”組）、電針太淵組（此組分為兩組，電針“太淵8”組簡稱為“太1”組，電針“太淵9”組簡稱為“太2”組），共6組，每組10只。

據(jù)前期工作并參考文獻(xiàn)[12]采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法復(fù)制大鼠急性心肌缺血模型。具體方法：室溫條件下，將大鼠用乙醚麻醉后固定于鼠臺上，剃除胸骨左緣鼠毛后用剪刀剪開此處皮膚，用止血鉗頓性分離大鼠左側(cè)的胸大肌，暴露左側(cè)第2、3、4肋骨，可清晰地暴露出心臟暗影，用彎頭止血鉗迅速沿胸骨左緣3，4肋間分開肋骨，擠出心臟以充分暴露心臟及其表面的血管，用6/0醫(yī)用縫合線在冠狀動脈前降支掛線結(jié)扎，然后快速將心臟送回胸腔，用長嘴止血鉗把胸部皮膚和肌肉夾緊，以防氣胸，快速縫合肌肉皮膚。手術(shù)過程中，采用標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)控模型大鼠，滿足以下一項即可認(rèn)為急性心肌缺血模型復(fù)制成功：（1）T波高聳并伴有ST段移位;（2）ST段水平偏移，向上或向下偏移≥0.1 mV;（3）T波高聳，超過同導(dǎo)聯(lián)R波1/2。

1.4 ?穴位定位及經(jīng)脈段選擇干預(yù)

穴位定位參考《實驗針灸學(xué)》[13]中實驗動物的穴位及人體腧穴進(jìn)行定位，選取心經(jīng)原穴雙側(cè)的“神門”穴和肺經(jīng)原穴雙側(cè)“太淵”穴并在各自穴位前方1 mm處刺入1～2 mm深度的針灸針并接電針儀，選擇1 mA的疏密波，10 Hz的頻率，時間為15 min，1次/d。在模型復(fù)制后第2天開始電針治療，持續(xù)7 d，在電針最后一次的即刻和次日的同等時間分別取材，稱“神1”組、“神2”組、“太1”組和“太2”組，每組取6只，正常組和模型組未進(jìn)行任何干預(yù)治療。

1.5 ?檢測指標(biāo)

1.5.1 ?心電圖檢測及分析 ?采用Powerlab 8生理記錄儀連接大鼠肢體端，測出并記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電信號，處理心電信號，采用Chart 5軟件進(jìn)行分析。

1.5.2 ?RT-qPCR法測定心肌組織HCN4 mRNA表達(dá) ?實驗結(jié)束即刻隨機(jī)選取6只大鼠開胸取心，準(zhǔn)確稱取心肌左心室游離壁組織組織200 mg于冰冷生理鹽水中漂洗數(shù)次后用濾紙吸干，迅速冷凍，以便測試。以實時熒光定量PCR法（quantitative real-time PCR， RT-qPCR）檢測HCN4 mRNA表達(dá)，其中Ratβ-actin熒光定量引物序列為：Forward primer 5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3，Reverse primer 5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3，產(chǎn)物長度為150 bp;Rat HCN4熒光定量引物序列為：Forward primer 5-GTGCTGGAGGAGTATCCCA-3，Reverse primer 5-GTTGAAGACGCCTGAGTTGA-3，產(chǎn)物長度為132 bp。采用relative quantification study對RT-qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析，計算方法為 2-△△Ct。

1.5.3 ?Western-blot分析心肌組織HCN4蛋白表達(dá) ?隨機(jī)選取的6只大鼠，準(zhǔn)確稱取其100 mg左心室游離壁組織后加入內(nèi)含1 mmol/L PMSF 的RIPA細(xì)胞裂解液1 mL進(jìn)行裂解離心10 min，12 000轉(zhuǎn)/min。收集含有組織總蛋白的上清液待測。使用DS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）配制凝膠后以1∶200的比例用一抗稀釋液稀釋后4 ℃緩慢搖動，過夜孵育后分別加入洗滌液洗3次，每次10 min;用二抗稀釋液稀釋（比例為1∶10 000）辣根過氧化物酶來標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h后分別加洗滌液洗滌3次，每次10 min。以ECL發(fā)光試劑盒檢測心肌組織HCN 4蛋白表達(dá)后以凝膠成像分析系統(tǒng)做分析檢測。

1.6 ?統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以“x±s”來表示，采用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及繪制統(tǒng)計圖表。計量資料用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間比較選擇Tukey's multiple comparisons test檢驗有無統(tǒng)計學(xué)意義的P值，其中P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?模型大鼠心電圖改變

以Powerlab 8導(dǎo)生理記錄儀來觀測AMI模型復(fù)制前后心電圖的變化狀況來判斷心肌缺血模型復(fù)制是否成功。圖1為模型復(fù)制前后大鼠心電圖，模型復(fù)制前為竇性心律，復(fù)制后ST段抬高即模型復(fù)制成功。

2.2 ?各組HCN4 mRNA相對表達(dá)量與蛋白平均相對表達(dá)量的結(jié)果

HCN4 mRNA相對表達(dá)量結(jié)果：與正常組比較，模型組的表達(dá)量顯著減少（P<0.01）;與模型組比較， “神1”“神2”和“太1”組相對表達(dá)量顯著增多（P<0.01）;與“神1”組比較，“神2”“太1”和“太2”組的HCN4 mRNA相對表達(dá)量減少（P<0.01）;與“神2”組比較“太2”組HCN4 mRNA相對表達(dá)量顯著減少（P<0.01）;與“太1”組比較，“太2”組相對表達(dá)量顯著減少（P<0.01）。

HCN4蛋白平均相對表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組的相對表達(dá)顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，“神1”“神2”和“太1”組相對表達(dá)顯著增多（P<0.01）;與“神1”組比較，“神2” “太1”和“太2”組相對表達(dá)顯著減少（P<0.01）;與“神2”組比較，“太2”組相對表達(dá)顯著減少（P<0.01）;與“太1”組比較，“太2”組相對表達(dá)顯著減少（P<0.01）。詳見圖2，表1。

3 討論

在本研究中，急性心肌缺血模型是由冠狀動脈左前降支結(jié)扎法來復(fù)制的，并通過心電圖證實模型復(fù)制成功后采集缺血局部心室肌組織并進(jìn)行組織勻漿，HCN4 mRNA和蛋白在RT-qPCR法與estern blot法檢測中的情況：比較正常組和模型組大鼠后表明電針心經(jīng)原穴“神門”及肺經(jīng)原穴“太淵”均可以促進(jìn)急性心肌缺血模型大鼠心肌組織二者的表達(dá)，兩者之間存在顯著性差異。通過電針此兩穴干預(yù)結(jié)束后1 d的相同時間段，相同的方法對相同部位的心肌組織取材并進(jìn)行HCN4mRNA和蛋白表達(dá)影響的比較后發(fā)現(xiàn)電針后1 d的HCN4表達(dá)較之電針干預(yù)結(jié)束后仍然有明顯的促進(jìn)作用，雖然兩穴后效應(yīng)作用在HCN4 mRNA和蛋白量上較電針本穴最后一次的即刻取材組表達(dá)量均顯著減少，但電針原穴具有一定的后效應(yīng);而電針心經(jīng)與肺經(jīng)在調(diào)整心肌組織HCN4表達(dá)中具有相對特異性的影響則體現(xiàn)在電針“神門”穴和“太淵”穴的效應(yīng)和后效應(yīng)相對特異性差異中。本實驗證實在HCN4 mRNA和蛋白表達(dá)量上，電針心經(jīng)原穴“神門”穴及其后效應(yīng)表達(dá)上效果均顯著好于電針肺經(jīng)原穴“太淵”穴。

經(jīng)脈（穴）臟腑二者的聯(lián)系有相對特異性[14-15]，前期的工作表明電針手少陰心經(jīng)原穴“神門”可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控下，通過神經(jīng)-體液途徑有效地改善因急性心肌缺血導(dǎo)致的心肌組織缺血缺氧狀態(tài)和認(rèn)知功能障礙，并對急性心肌缺血模型動物的心率變異性有明顯的調(diào)整干預(yù)意義[16-19]。電針“神門”亦可以上調(diào)心肌缺血大鼠海馬BDNF、TrkB的表達(dá)，促進(jìn)心肌組織HCN 2mRNA和蛋白的表達(dá)，且與電針手太陰肺經(jīng)原穴“太淵穴”比較二者擁有相對特異性差異，但是對于電針的后效應(yīng)及電針對心肌組織細(xì)胞離子通道變化的研究相對較少。

HCN通道具有的作用包括鈉鉀離子通透、超極化激活、胞內(nèi)cAMP調(diào)節(jié)及微弱的單通道電導(dǎo)等，于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟等處均有表達(dá)，同時可以維持心臟自主起搏性節(jié)律活動，亦可參與神經(jīng)信號的傳導(dǎo)。HCN通道可以被超極化激活，是陽離子通道，這是與其他離子通道不同之處，神經(jīng)系統(tǒng)就是通過其被激活的陽離子通道來調(diào)節(jié)遞質(zhì)和神經(jīng)絡(luò)的發(fā)展。HCN基因主要是分部于心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，且在竇房結(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物中HCN4是占據(jù)著絕對優(yōu)勢。HCN通道故被認(rèn)為是起搏點去極化的重要離子機(jī)制和起搏活動所必須的獨特的特征[20-21]，本實驗通過電針實現(xiàn)對離子通道HCN4的刺激，初步認(rèn)為信號是由各受體與各配體介導(dǎo)的離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄盘柡髠鬏數(shù)?，HCN4是心臟自主性跳動的主要環(huán)節(jié)，參與沖動的形成亦影響其傳播，在穩(wěn)定心臟節(jié)律性上具有至關(guān)重要的作用[22]。電針治療急性心肌缺血腦損傷是否與電針調(diào)控其他離子通道有關(guān)，及電針介入治療的時機(jī)與機(jī)制，尚亟待進(jìn)一步研究。

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