鐘 文,謝玉華,邢馨玉,王含笑,崔 帥

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,安徽 合肥 230012;3.經(jīng)脈臟腑相關(guān)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是由異乎尋常的威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和(或)長期持續(xù)的一種精神障礙[1]。流行病學(xué)研究[2]顯示,全球一半以上的人口經(jīng)歷過創(chuàng)傷事件,PTSD的終生發(fā)病率和平均發(fā)病率分別為6.8%和8%。隨著自然災(zāi)害、醫(yī)學(xué)事件、暴力犯罪、情感虐待等創(chuàng)傷性事件的增多,PTSD的發(fā)病率正在逐年上升[3]。臨床研究[4]表明,PTSD的嚴(yán)重程度與焦慮、抑郁狀態(tài)和情緒失調(diào)等負(fù)面影響密切相關(guān)。針灸治療作為情志疾病常用的臨床治療手段,對(duì)于改善PTSD以及焦慮、抑郁癥狀起到了較好的療效,但其潛在機(jī)制仍不清楚[5-6]。

研究[7-8]表明,前額葉皮質(zhì)(medical prefrontal cortex,mPFC)與PTSD的發(fā)病及焦慮、抑郁癥狀密切相關(guān)。FKBP5作為應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因,在mPFC中具有較高的表達(dá)水平,并能夠調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體的敏感性,從而影響PTSD發(fā)病[9-10]。Ryu等[10]研究發(fā)現(xiàn),FKBP5表達(dá)缺乏會(huì)導(dǎo)致mPFC對(duì)糖皮質(zhì)激素受體激活不敏感,且FKBP5基因敲除小鼠對(duì)壓力表現(xiàn)出彈性。同時(shí),mPFC參與針刺治療PTSD。Hou等[11]研究發(fā)現(xiàn),針刺治療PTSD是通過修復(fù)mPFC的病理變化來實(shí)現(xiàn)的?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果,筆者推測電針效應(yīng)可能影響mPFC中FKBP5表達(dá),以改善PTSD焦慮、抑郁樣行為。因此,本研究以PTSD小鼠模型為研究對(duì)象,通過檢測mPFC內(nèi)FKPB5及其mRNA的表達(dá),并觀察小鼠在曠場和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)變化,從而揭示電針“神門”穴改善PTSD焦慮、抑郁癥狀的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性C57BL/6J小鼠(月齡2個(gè)月,體質(zhì)量20～25 g)購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(浙)2019-0004]。將4只小鼠飼養(yǎng)在同一籠具中,在溫度(25±2)℃、相對(duì)濕度45%～65%的環(huán)境中進(jìn)行12 h的光、暗循環(huán)飼養(yǎng),小鼠自由攝食和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組,每組6 只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(證明號(hào): 2022038)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 小動(dòng)物麻醉機(jī)(R500):深圳瑞沃德生命科技有限公司;一次性針灸針(0.16 mm×7 mm):吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司;電針儀(SDZ-Ⅱ型):蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;化學(xué)發(fā)光儀(6300):天能;超微量分光光度計(jì)(OneDrop):五義科技股份有限公司;熒光定量PCR儀(7300):ABI;SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件、曠場箱(400 mm×400 mm×400 mm)、高架十字迷宮(50 mm×250 mm×50 mm):上海欣軟信息科技有限公司。

1.2.2 主要試劑 異氟烷(R510-22):深圳瑞沃德生命科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(89900):Thermo ScientificTM;qPCR SYBR Green試劑盒(11203ES03):翌圣生物;FKBP5(14155-1-AP):Proteintech;β-actin(R23613):CST;羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(L3012):SAB。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 按照文獻(xiàn)[12]方法復(fù)制PTSD小鼠模型。將小鼠放在限制管中固定2 h,隨后立即在一個(gè)透明的丙烯酸圓柱形容器中強(qiáng)制游泳20 min,水溫22～24 ℃,同時(shí)放置5～7只小鼠。將小鼠干燥并置入籠中15 min后,將其暴露于含5%異氟烷的密封容器中麻醉,直至其失去知覺(<1 min),重復(fù)3次。休息15 min后,小鼠在電擊箱內(nèi)接受單次電擊(2 mA)2 s。最后,將小鼠放回籠中安靜飼養(yǎng),允許單一延長壓力加電刺激(single prolonged stress and electrical stimulation,SPS&S)模型小鼠休息7 d。所有SPS&S模型復(fù)制程序均于下午2:00—5:00進(jìn)行。

2.2 干預(yù)方法 模型復(fù)制7 d后,對(duì)電針組進(jìn)行電針干預(yù)。電針組小鼠穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13],按照文獻(xiàn)[14]方法取單側(cè)“神門”穴,直刺2～3 mm,連續(xù)波,頻率2 Hz,電流強(qiáng)度2 mA,電針15 min,每日1次,連續(xù)14 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 曠場實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí),將小鼠放置在一個(gè)立方體的中心,允許其自由移動(dòng)5 min,采用SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件記錄小鼠在中心區(qū)域的持續(xù)時(shí)間、活動(dòng)距離、總距離。

2.3.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。該裝置包括兩個(gè)相對(duì)的張開臂,兩個(gè)相對(duì)的閉合臂和一個(gè)中心區(qū)域,距離地面50 cm。在測試開始時(shí),每只小鼠被放置在面對(duì)閉合手臂的中心區(qū)域,使用SuperMaze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件跟蹤其5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng),觀察開臂時(shí)間和開臂次數(shù),計(jì)算開臂時(shí)間比[開臂時(shí)間/(開臂時(shí)間+閉臂時(shí)間)×100%]和開臂次數(shù)比[開臂次數(shù)/(開臂次數(shù)+閉臂次數(shù))×100%],作為焦慮狀態(tài)的指標(biāo)。

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測前額葉組織FKBP5 mRNA表達(dá)水平 每組取3只小鼠mPFC,立即置于液氮中冷凍,然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。首先用TRIzol提取組織中RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系包括1×SYBR Green mixture 25 μL、上下游引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、無RNA酶的水50 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,55～60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法分析FKBP5 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。FKBP5 mRNA的PCR引物序列見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

2.3.4 Western blot法檢測前額葉組織FKBP5表達(dá)水平 取出-80 ℃凍存的前額葉組織,加入500 μL裂解緩沖液,4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為總蛋白溶液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度,將蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×還原型蛋白上樣緩沖液,沸水浴變性15 min,置入-20 ℃冰箱保存。取出上述組織,依次加入上樣緩沖液煮沸、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉;加入配置好的一抗(1∶1 000),4 ℃孵育搖床過夜,洗膜后加入二抗稀釋液(1∶5 000),室溫孵育30 min,再次洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測,顯影定影。采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào)Tanon-5200)和Image J(Wayne Rasband,lmage J 1.46r Java 1.6.0 20)分析膠片,以FKPB5與β-actin吸光度的比值作為FKPB5的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 3組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與正常組比較,模型組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間、跨格次數(shù)、總移動(dòng)距離顯著減少(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間、跨格次數(shù)明顯增加(P<0.05),總移動(dòng)距離有增加趨勢(shì)(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 3組小鼠高架十字迷宮行為學(xué)參數(shù)比較 與正常組比較,模型組小鼠開臂時(shí)間、開臂次數(shù)明顯減少(P<0.05),開臂時(shí)間比、開臂次數(shù)比顯著降低(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠開臂時(shí)間、開臂次數(shù)明顯增加(P<0.05),開臂時(shí)間比、開臂次數(shù)比顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注:A.3組小鼠在高架十字迷宮中活動(dòng)軌跡示意圖;B.3組小鼠開臂時(shí)間比較;C.3組小鼠開臂次數(shù)比較;D.3組小鼠開臂時(shí)間比比較;E.3組小鼠開臂次數(shù)比比較;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 3組小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較,模型組小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,電針組小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組小鼠mPFC中FKBP5蛋白及其mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

PTSD可歸屬于中醫(yī)學(xué)“情志病”范疇,主要由于“腦神失養(yǎng),氣血陰陽失調(diào)”所致[16]。針灸調(diào)神具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。近年來,針灸因操作簡便、價(jià)格低廉、無明顯不良反應(yīng),已經(jīng)成為治療PTSD的常用方法之一[17]?！靶恼?君主之官”,《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》提到“心腦息息相通,其神明自湛然長醒”,故PTSD可從心論治。心為五臟六腑之主,主血脈而藏神,七情致病,首傷心神,任何一種情志失調(diào)都會(huì)傷及心神。并且,外來之極驚擾亂心神而致心氣虛是PTSD發(fā)生的首要病機(jī)[18]。故調(diào)心神即可調(diào)神、暢氣血,改善心神失常、氣機(jī)紊亂、氣血失調(diào)所致的心神不寧、驚恐不安。神門為心經(jīng)原穴、心經(jīng)氣血輸注之處,針刺治療情志病常選取該穴。《靈樞·九針十二原》載:“五臟有疾也,當(dāng)取之十二原?！贬槾淘苁怪苌須鈾C(jī)通達(dá),從而發(fā)揮調(diào)暢氣機(jī)的功效。因此,本研究選取神門穴以通調(diào)氣血,醒腦開竅,神調(diào)則氣血和、情志暢。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,PTSD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要與下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPAA)功能失調(diào)、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能障礙、谷氨酸系統(tǒng)失衡以及其他相關(guān)基因和蛋白表達(dá)異常有關(guān)[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素受體FKBP5的基因變異與PTSD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。FKBP5基因多態(tài)性強(qiáng)烈預(yù)示中國人PTSD的進(jìn)一步發(fā)展,并且其相關(guān)的miRNA的表觀遺傳調(diào)控可能會(huì)增加PTSD的患病風(fēng)險(xiǎn)[21]。作為與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的HPAA,在PTSD發(fā)病中起重要作用[22],FKBP5基因能夠通過調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體活性來調(diào)節(jié)壓力應(yīng)激所致的HPAA紊亂,改善不良應(yīng)激反應(yīng)[23]。有研究表明,針灸能夠通過調(diào)節(jié)HPAA的功能[24],發(fā)揮抗焦慮、抗抑郁的作用,以達(dá)到治療PTSD的目的[25]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),電針“神門”穴能夠有效下調(diào)FKBP5及其mRNA表達(dá)水平,并改善PTSD小鼠的焦慮樣行為,提示電針改善PTSD焦慮抑郁樣行為可能是通過影響基因FKBP5表達(dá)、調(diào)節(jié)HPAA實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),SPS&S可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,并引起mPFC應(yīng)激相關(guān)基因FKBP5表達(dá)水平降低。在曠場行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,水平運(yùn)動(dòng)總距離反映小鼠的運(yùn)動(dòng)情況,模型組小鼠水平運(yùn)動(dòng)距離明顯減少,提示模型小鼠處于一定的抑郁狀態(tài)。既往研究[10]報(bào)道,恐懼條件反射能夠增加FKPB5在mPFC中表達(dá)水平,而抑制mPFC的邊緣下皮質(zhì)中FKBP5基因表達(dá)可以阻斷恐懼條件反射后的凍結(jié)反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),電針能夠下調(diào)FKBP5的表達(dá)水平并改善PTSD小鼠焦慮樣行為,提示電針抗PTSD的效應(yīng)可能是通過調(diào)節(jié)小鼠mPFC中基因FKBP5實(shí)現(xiàn)的。本研究僅針對(duì)前額葉中糖皮質(zhì)激素基因FKBP5進(jìn)行研究,FKBP5是否參與針刺治療PTSD的相關(guān)信號(hào)通路,仍需深入研究。