陶舒悅,梁萬(wàn)徽,汪 杰,張?jiān)旗o,3,方 玲,彭 燦,3,5,6

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012;3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012;4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230012;5.安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所,安徽 合肥 230012;6.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致血管堵塞,從而引起的以心肌細(xì)胞缺血低氧為主要特征的一類(lèi)心血管疾病[1-2]。研究[3]表明,AMI是全球死亡、殘疾和痛苦的一大原因,給人類(lèi)帶來(lái)極大的健康危害和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用藥物干預(yù)和手術(shù)治療的方法,使阻塞的冠狀動(dòng)脈血管恢復(fù)供血[4],但這也對(duì)患者造成再灌注損傷和微循環(huán)障礙等新的問(wèn)題[5-6]。因此,在當(dāng)前全球心血管類(lèi)疾病危害依舊居高不下的情況下,人們迫切需要發(fā)現(xiàn)新的治療方法。

中醫(yī)藥作為中華民族的瑰寶,對(duì)治療AMI具有作用多靶點(diǎn)和整體性治療的優(yōu)勢(shì),更符合心血管疾病長(zhǎng)期用藥的特點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為AMI屬于“胸痹”“心痛”的范疇,主要治則為活血化瘀、理氣止痛[7]。心通口服液是一種傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑,由黃芪、黨參、麥冬、何首烏、丹參、當(dāng)歸、葛根等多種中藥組成。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn),心通口服液具有活血化瘀、化痰通絡(luò)的作用,能夠明顯改善患者心功能,起到保護(hù)心臟的作用[8]。然而,由于心通口服液化學(xué)成分多且復(fù)雜,目前對(duì)于其治療AMI的作用機(jī)制并不明確。

代謝組學(xué)作為一個(gè)從具象到整體的研究手段,能夠敏銳聚焦到小分子化合物的代謝產(chǎn)物變化,從而分析機(jī)體的整個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制,這與中醫(yī)的整體觀、系統(tǒng)觀不謀而合,目前在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用也很成熟[9-10]。因此,本研究利用代謝組學(xué)手段,篩選得到心通口服液治療AMI的差異代謝物,預(yù)測(cè)發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分以及可能的代謝通路,探索其治療機(jī)制,為后續(xù)研究提供思路。

1 材料

1.1 藥品與試劑 乙腈(質(zhì)譜純,批號(hào) F0RQRRQS)、甲醇(質(zhì)譜純,批號(hào) T3R8RRXS):安耐吉化學(xué);心通口服液(批號(hào) 317210032):魯南厚普制藥有限公司;0.5%～1%伊紅乙醇溶液(批號(hào) 0496202201)、蘇木精染液(批號(hào) 0648202110):凱基生物;羧甲基纖維素鈉(批號(hào) 20210601):天津市大茂化學(xué)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與軟件 Vanquish UPLC超高效液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Compound Discoverer 3.1化合物分析鑒定軟件、H3-18KR高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Thermo Fisher Scientific Corporation;East Laboratory Epic C18(1.8 μm,120 A,100 mm×2.1 mm)色譜柱:北京東方朗銳科技有限公司;MetaboAnalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca);AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;Cascada超純水儀:美國(guó)PALL公司;Vortex4渦旋儀:德國(guó)IKA;MPA200生物信號(hào)分析系統(tǒng):成都泰盟軟件有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar健康大鼠40只,體質(zhì)量200～220 g,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(魯)2019-0003,動(dòng)物自由飲食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,并保證飼養(yǎng)環(huán)境12 h明暗循環(huán),在確保動(dòng)物狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行分組給藥實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審定,符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定,審批號(hào)為AHUCM-rats-2021105。

2 方法

2.1 AMI大鼠模型的復(fù)制 采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制AMI大鼠模型。正常大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,使用20%的烏拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上,剃除大鼠胸口的毛后使用碘伏和75%乙醇進(jìn)行無(wú)菌操作,然后剪開(kāi)大鼠胸口皮膚,于左側(cè)第4、5肋間的切口撕開(kāi)心包,使心臟暴露,用手輕壓大鼠胸廓擠出心臟。用6-0號(hào)帶線縫合針(心臟用)立即結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎完成后迅速將心臟送回胸腔,同時(shí)把胸腔中存在的血液和氣體擠出,可避免血液在胸腔中凝固,影響肺功能,以保證胸腔的負(fù)壓狀態(tài)。最后迅速關(guān)閉胸腔,使用4-0號(hào)非吸收性縫合線縫合大鼠皮膚。縫合后使用碘伏對(duì)傷口再次進(jìn)行無(wú)菌操作。實(shí)行假手術(shù)的大鼠只開(kāi)胸不結(jié)扎[11]。模型復(fù)制后6 h,采用MPA200生物信號(hào)分析系統(tǒng)對(duì)每只大鼠進(jìn)行心電圖測(cè)定,觀察心電圖ST段是否抬高,以評(píng)價(jià)模型復(fù)制是否成功。

2.2 分組、給藥和樣品采集 從40只實(shí)驗(yàn)大鼠中選取8只進(jìn)行假手術(shù)操作,剩下的32只進(jìn)行AMI模型復(fù)制,隨后將模型復(fù)制成功的16只大鼠分為模型組(n=8)和治療組(n=8),將經(jīng)過(guò)假手術(shù)操作的大鼠作為假手術(shù)對(duì)照組(n=8)。心通口服液的臨床劑量為60 mL,以成年人60 kg體質(zhì)量為參照,按照體表面積法計(jì)算得到大鼠給藥劑量為6.3 mL/kg。假手術(shù)對(duì)照組、模型組大鼠連續(xù)14 d給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,治療組連續(xù)14 d給予6.3 mL/kg心通口服液原液。20%烏拉坦腹腔注射麻醉后,用不含肝素鈉的一次性真空采血管腹主動(dòng)脈取血,靜置1 h后,3 000 r/min 離心15 min,取上清液于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?取血后立即留取心臟樣品,放入4%多聚甲醛溶液固定。

2.3 樣品前處理 精密吸取血清樣品120 μL,加入300 μL乙腈,渦旋混勻5 min,12 000 r/min、4 ℃高速離心10 min,取上清液,37 ℃ 氮?dú)饬飨麓蹈?加入140 μL復(fù)溶液V(水)∶V(甲醇)=1∶3,渦旋混勻10 min,用注射器吸取處理好的溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,濾液裝入進(jìn)樣小瓶中,用于色譜質(zhì)譜分析。將所有樣品各取10 μL混合作為質(zhì)控(quality control,QC)樣品。

2.4 病理組織評(píng)價(jià) 取部分4%多聚甲醛溶液固定和石蠟包埋后的心臟左心室心肌進(jìn)行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,將染色后的切片置于顯微鏡下觀察,拍照。

2.5 樣品測(cè)定

2.5.1 色譜條件 所有樣品均使用同一根色譜柱。柱溫保持在40 ℃,樣品室溫度保持在6 ℃。流動(dòng)相由A相[純水(含0.1%甲酸,0.1%甲酸銨)]、B相(甲醇)組成。梯度洗脫程序:0～1.0 min,98% A;1.0～10.0 min,98%→5% A;10.0～16.0 min,5% A;16.0～16.1 min,5%→98% A;16.1～20 min,98% A。流速為0.2 mL/min,進(jìn)樣容積為2 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源:ESI源;噴霧電壓:3 800/3 200 V(+/-);離子化模式:ESI+、ESI-;鞘氣:40 arb;輔助氣:10 arb;毛細(xì)管溫度:360 ℃;掃面范圍:100～1 500m/z;分辨率:17 500 FWHW。所使用的各種氣路均為氮?dú)狻?/p>

2.6 數(shù)據(jù)分析 將原始圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1軟件,對(duì)代謝物進(jìn)行初步鑒定,將結(jié)果導(dǎo)出為CSV格式,利用在線網(wǎng)站MetaboAnalyst 5.0構(gòu)建主成分分析(principal component analysis,PCA),通過(guò)SIMCA 14.0構(gòu)建正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)以及999次置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?鑒別并篩選出潛在的差異代謝物。將差異代謝物導(dǎo)入在線網(wǎng)站 MetaboAnalyst 5.0可以得到相關(guān)代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 病理學(xué)評(píng)價(jià) 各組大鼠心臟組織病理切片如圖1所示,假手術(shù)對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊緊密,并無(wú)病理性損傷。相較于假手術(shù)對(duì)照組,模型組心臟受損嚴(yán)重,出現(xiàn)不同程度的間質(zhì)水腫、心肌纖維破壞、細(xì)胞核固縮等損傷,治療組能夠明顯看到梗死面積減少,心肌細(xì)胞受損較模型組有所逆轉(zhuǎn)。

圖1 各組大鼠心肌組織切片(HE染色,10×20倍)

3.2 PCA PCA圖可以很好地反映組間的分離趨勢(shì)。圖2為樣品正負(fù)離子PCA圖,由圖可以得出假手術(shù)對(duì)照組與模型組有明顯分離趨勢(shì),說(shuō)明構(gòu)建AMI模型成功;模型組與治療組之間區(qū)分明顯,說(shuō)明在心通口服液的作用下AMI大鼠的代謝輪廓發(fā)生了異常。圖中QC樣本聚集程度較高,說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程中儀器穩(wěn)定,采集的數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。

注:A.假手術(shù)對(duì)照組;B.模型組;C.治療組;D.QC

注:A.假手術(shù)對(duì)照組;B.模型組;C.治療組

3.4 差異代謝物篩選 通過(guò)構(gòu)建假手術(shù)對(duì)照組與模型組,以及模型組與治療組之間的OPLS-DA模型,設(shè)置變量投影重要性>1,結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果,對(duì)P<0.05的樣本認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn),確定兩組模型的差異代謝物,最終取兩組差異代謝物的交集作為心通口服液治療AMI的差異代謝物,共有16個(gè)。其中模型組與假手術(shù)對(duì)照組相比,具有上調(diào)作用的代謝物有11個(gè),具有下調(diào)作用的代謝物有5個(gè);治療組與模型組相比,具有上調(diào)作用的代謝物有4個(gè),具有下調(diào)作用的代謝物有12個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 差異代謝物鑒定結(jié)果

3.5 代謝通路分析 差異代謝物參與的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甘油磷脂代謝,亞油酸代謝,α-亞麻酸代謝,類(lèi)固醇激素生物合成,花生四烯酸代謝,脂肪酸伸長(zhǎng),脂肪酸降解,嘧啶代謝,脂肪酸生物合成,見(jiàn)表2。以代謝通路富集分析數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)作代謝通路圖(見(jiàn)圖4),其中橫坐標(biāo)為影響值,縱坐標(biāo)為-lg(P),氣泡大小代表該通路的富集程度,由圖4可知,差異代謝物對(duì)甘油磷脂代謝和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路影響較大,且這些通路富集程度較高。

表2 代謝通路鑒定結(jié)果

圖4 代謝通路富集氣泡圖

4 討論

本研究采用超高效液相色譜—四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜代謝組學(xué)的方法,探討心通口服液治療AMI的治療機(jī)制。研究結(jié)果確定了心通口服液治療AMI的生物標(biāo)志物,包括硬脂酸、棕櫚酸、膽堿、磷脂酰膽堿等16個(gè)代謝物,主要涉及不飽和脂肪酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甘油磷脂代謝,亞油酸代謝等代謝通路,下面將對(duì)一些關(guān)鍵代謝物及代謝通路進(jìn)行討論。

4.1 脂質(zhì)代謝 脂肪酸作為心肌組織的主要能量提供單位,其主要的代謝途徑為β-氧化,主要在線粒體中進(jìn)行,在低氧的情況下,脂肪酸的β-氧化減少,從而導(dǎo)致脂肪酸的積累[11-12]。與模型組比較,治療組血清硬脂酸、棕櫚酸等脂肪酸下調(diào),因此可認(rèn)為心通口服液通過(guò)增加脂肪酸的β-氧化從而減輕心肌缺血低氧[13-15]。硬脂酸、棕櫚酸為飽和脂肪酸,在體內(nèi)分布較廣,在供能的同時(shí)也參與不飽和脂肪酸的生成,如亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、磷脂[16]。

亞油酸和α-亞麻酸為體內(nèi)必需脂肪酸[17],亞油酸具有軟化血管的作用,AMI大鼠由于體內(nèi)血瘀、動(dòng)脈粥樣硬化等情況,機(jī)體會(huì)增加亞油酸的生成,從而起到疏通血管、抗血栓的作用[18]。亞油酸在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為α-亞麻酸,進(jìn)而通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)生成花生四烯酸[19],花生四烯酸代謝可以生成白三烯B4和前列腺素E2,具有抗炎的作用,對(duì)血管彈性、血小板活化等具有一定的調(diào)節(jié)作用[20-21]。本研究結(jié)果顯示,治療組亞油酸、α-亞麻酸相對(duì)于模型組都有一定的回調(diào),說(shuō)明心通口服液可以通過(guò)調(diào)節(jié)亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝以及花生四烯酸代謝達(dá)到治療AMI的作用。

二十碳五烯酸是α-亞麻酸的代謝產(chǎn)物,可以調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇及三酰甘油含量,二者通過(guò)降血脂、降低血管內(nèi)血液黏度達(dá)到抗血栓,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用[22]。磷脂酰膽堿是甘油磷脂的一種,主要參與細(xì)胞膜的組成,是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一,可以在體內(nèi)分解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿,可參與調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)傳遞、炎癥反應(yīng)等生物過(guò)程[23]。

4.2 氨基酸代謝 研究結(jié)果表明:心通口服液通過(guò)調(diào)控膽堿和甜菜堿參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,甜菜堿可由膽堿氧化生成,具有抗氧化和抗炎作用[24];膽堿可通過(guò)氧化和脫甲基生成甘氨酸,與炎癥反應(yīng)有關(guān)[25]。體內(nèi)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸為生糖氨基酸,可通過(guò)乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán),代謝可產(chǎn)生一碳單位,如膽堿。絲氨酸和蘇氨酸可以和甘氨酸相互轉(zhuǎn)化,蘇氨酸具有保護(hù)細(xì)胞膜、促進(jìn)脂肪酸氧化的作用[26]。甘氨酸是抗氧化物谷胱甘肽的組成之一,同時(shí)抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6的生成[27]。而絲氨酸與免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)[28]。因此,心通口服液可通過(guò)參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和抗氧化作用經(jīng)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路對(duì)心臟起到保護(hù)作用。

綜上,本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)的研究方法,探究了心通口服液治療AMI的相關(guān)特征代謝物以及代謝通路。結(jié)果表明,心通口服液對(duì)脂肪酸代謝,花生四烯酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等代謝通路具有明顯的調(diào)節(jié)作用,表明其治療的關(guān)鍵在于脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝,為后續(xù)藥理機(jī)制的深入研究提供了一定方向。