吳儀，仇欣，張燕，周婧文，李慈，趙傳祥，高鳳威，劉爍，姚雪，夏圣

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

植物山茱萸屬（Cornus）根據(jù)地理分布和形態(tài)學(xué)等可以細(xì)分為65種［1］，大約在2 200年前，中草藥山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc）就被記錄在《神農(nóng)本草》中［2］，其與中藥板藍(lán)根有相似的植物來(lái)源，具有抗炎、抗高血壓以及增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能［3］。研究表明，屬于環(huán)烯醚萜苷類的莫諾苷和馬錢苷是中草藥山茱萸中主要的活性物質(zhì)［4］。研究表明莫諾苷可以調(diào)控細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖和不對(duì)稱細(xì)胞分裂的控制等［5］。因此，通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路，莫諾苷具有防脫發(fā)［6］、抗心肌細(xì)胞凋亡［7］、促進(jìn)細(xì)胞增殖、組織再生等廣泛的藥理作用。但是，目前這些研究大多局限于成骨細(xì)胞［8］、心肌細(xì)胞等組織細(xì)胞。

T細(xì)胞在發(fā)育、分化成熟的過程中伴隨著細(xì)胞增殖、歸巢等事件，Wnt信號(hào)在其中扮演著重要的角色。特異性敲除T細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白，可導(dǎo)致其發(fā)育過程中細(xì)胞表面受體前體形成受損，細(xì)胞發(fā)育障礙［9］。但有關(guān)莫諾苷是否也會(huì)通過Wnt信號(hào)通路影響T細(xì)胞分化，尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)中擬利用莫諾苷與抗原受體信號(hào)活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)，探討山茱萸提取物莫諾苷對(duì)T細(xì)胞功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)C57BL/6小鼠（JAX 000664），同窩雌性，6～12周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自江蘇大學(xué)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：No.201907363。

1.1.2 主要試劑 山茱萸莫諾苷提取物（成都普瑞法公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；48、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（丹麥 Nunc公司）；總RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料（日本TaKaRa公司）；總蛋白提取RIPA裂解液、牛血清白蛋白（上海碧云天公司）；AnnexinV、Th1、Th2流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒、IL-4試劑盒、TGF-βELISA試劑盒、抗小鼠IgG-HRP抗體、小鼠內(nèi)參蛋白-HRP（杭州聯(lián)科公司）；IFN-γELISA試劑盒、BCA試劑盒、蛋白指示條帶（美國(guó)Thermo公司）；紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞刺激阻斷劑、功能性抗CD3抗體、功能性抗CD28抗體、抗小鼠Ki67 PercPCy5.5、抗小鼠CD25 PE、抗小鼠CD69 FITC、抗小鼠Foxp3 APC（美國(guó) eBioscience公司）；抗小鼠CD4 APC、抗小鼠CD8 APC、抗小鼠CD4 PE（美國(guó)Biolegend公司）；小鼠β-連環(huán)蛋白抗體（美國(guó)CST公司）；Tbx21、Gata3、淋巴樣增強(qiáng)因子 1（lymphoid enhance factor 1，LEF1）引物序列由上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化廠）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；蛋白質(zhì)免疫印跡系列設(shè)備、PCR儀、CFX96定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置式生物顯微鏡（日本Nikon公司）；BD FACSCanto10C流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備與計(jì)數(shù)

取適齡雌性C57BL/6小鼠，采用斷頸法處死，用手術(shù)剪和彎鑷無(wú)菌分離脾臟；置于預(yù)冷PBS中，將其剪碎至細(xì)小顆粒狀；并于300目篩網(wǎng)上過濾至無(wú)明顯紅色，即獲得脾臟單細(xì)胞懸液。將所獲懸液于4℃行1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入4 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫靜置10 min；加入3倍體積的PBS終止反應(yīng)；按上述條件再次離心、棄上清液；最后用1 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。用改良牛鮑氏計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。

1.3 T細(xì)胞的活化及分組

抗CD3抗體包被：用無(wú)菌PBS將功能性抗CD3抗體原液（1 mg/mL）稀釋至5μg/mL，48孔板每孔加入200μL（96孔板每孔加入100μL），4℃包被過夜（＞12 h）；棄板中液體，預(yù)冷無(wú)菌PBS洗滌2遍；接種“1.2”中脾臟混合淋巴細(xì)胞，1×106/孔；用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)至400μL/孔（96孔板補(bǔ)至200μL/孔）；加入功能性抗CD28抗體原液（1 mg/mL），計(jì)算加入體積，保證終濃度為2μg/mL。鋪板完成后，將細(xì)胞分為2組，對(duì)照組和莫諾苷組。對(duì)照組不做任何處理培養(yǎng)96 h；莫諾苷組加入終濃度為10μmol/L的莫諾苷，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h；再次加入10μmol/L莫諾苷，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群的細(xì)胞，需要在實(shí)驗(yàn)前加入1×細(xì)胞刺激阻斷劑（原液500×）處理4～5 h，再收集檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞活化、凋亡、增殖和分化的相應(yīng)標(biāo)志

收集“1.3”中T細(xì)胞，加入適量PBS洗滌2次；于4℃行1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入相應(yīng)檢測(cè)不同表面標(biāo)志的熒光抗體，1μL/管，4℃避光孵育30 min；PBS洗去游離抗體，加入適量PBS重懸細(xì)胞。用流式分析儀檢測(cè)對(duì)照組和莫諾苷組細(xì)胞相應(yīng)表面熒光信號(hào)。

用于凋亡、增殖和細(xì)胞亞群檢測(cè)的細(xì)胞需在上述表面標(biāo)志染好后，按照試劑盒說(shuō)明書再加入相應(yīng)破核、破膜試劑和熒光抗體，最后用相應(yīng)緩沖液重懸細(xì)胞，用流式分析儀檢測(cè)細(xì)胞比例。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)T細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白表達(dá)

收集“1.3”中2組T細(xì)胞，于4℃行1 000 r/min離心5 min；棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍；加入RIPA裂解液提取蛋白；用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；行10%SDS-PAGE分離蛋白；120 V濕轉(zhuǎn)2 h，將所有目的蛋白和內(nèi)參條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%牛血清白蛋白封閉1 h；剪下對(duì)應(yīng)分子量的條帶，分別加入目的蛋白小鼠β-連環(huán)蛋白（1∶1 000）和內(nèi)參蛋白抗體（1∶10 000），4℃孵育過夜；次日用TBST洗滌條帶3次，每次10 min；內(nèi)參蛋白攜帶HRP基團(tuán)可以直接進(jìn)行暗室曝光，而 β-連環(huán)蛋白則需加入1∶10 000稀釋的抗小鼠IgG-HRP，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次10 min，行暗室曝光顯影。

1.6 ELISA檢測(cè)T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中相關(guān)細(xì)胞因子的水平

收集“1.3”中2組T細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書的要求，分別檢測(cè)上清液中IFN-γ、IL-4和TGF-β的含量。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)

收集“1.3”中2組T細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS洗2遍；分別加入1 mL Trizol提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將500 ng mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，cDNA為模板，定量檢測(cè)Th1、Th2轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子Tbx21、Gata3和Wnt信號(hào)通路下游分子LEF1 mRNA水平。小鼠內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白序列：上游5′-TGGCGCTTTTGACTCAGGAT-3′，下游5′-GGGATGTTTGCTCCAACCAA-3′；小鼠Tbx21序列：上游5′-TGTGGATGTGGTCTTGGTGG-3′，下游5′-ATAAGCGGTTCCCTGGCAT-3′；小鼠Gata3序列：上游5′-GTCATCCCTGAGCCACATCT-3′，下游5′-AGGGCTCTGCCTCTCTAACC-3′；小鼠LEF1序列：上游5′-TCACTGTCAGGCGACACTTC-3′，下游5′-TGAGGCTTCACGTGCATTAG-3′；qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green 5μL、雙蒸水3.6μL、上下游引物各0.2μL、cDNA 1μL，總反應(yīng)體系 10μL。擴(kuò)增條件為95℃ 5 s，57.8℃ 20 s（LEF1為56.5℃），72℃ 30 s，39次循環(huán)，用 2-ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Flowjo 10.0進(jìn)行分析處理，其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件處理，各組樣本n均≥3，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對(duì)T細(xì)胞增殖和活化的影響

如圖1所示，莫諾苷組與對(duì)照組細(xì)胞鏡下均可見細(xì)胞活化形成的集落，但集落大小和數(shù)量無(wú)顯著差異。莫諾苷組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖較對(duì)照組均有所上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。由圖3可見，對(duì)照組和莫諾苷組間T細(xì)胞早期活化標(biāo)志 CD69無(wú)明顯差異，但莫諾苷組 CD4+T和CD8+T細(xì)胞的晚期活化標(biāo)志CD25熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（t=4.214，P=0.006；t=2.521，P=0.045）。

圖1 顯微鏡下觀察小鼠脾臟源T細(xì)胞形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖比例

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化情況

2.2 莫諾苷對(duì)T細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，莫諾苷組CD4+AnnexinV+和CD8+AnnexinV+細(xì)胞比例降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.470，P=0.655；t=0.215，P=0.841）。見圖4。

2.3 莫諾苷對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群體外分化的影響

與對(duì)照組相比，莫諾苷組T細(xì)胞分化功能明顯增強(qiáng)，分化的Th1、Th2和Treg亞群比例和細(xì)胞數(shù)均明顯升高（P均＜0.05）。見圖5。

2.4 莫諾苷對(duì)T細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子分泌水平的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，莫諾苷組Th1和Th2細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄起始因子Tbx21 mRNA和Gata3 mRNA表達(dá)量均顯著增加（t=3.47，P=0.040；t=14.78，P=0.005）。與對(duì)照組相比，莫諾苷組T細(xì)胞分泌的IL-4水平明顯增加（t=3.402，P=0.009），但 IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞的凋亡比例

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析各組小鼠脾臟T細(xì)胞分化為Th1、Th2和Th17的情況

圖6 qRT-PCR法檢測(cè)各組小鼠脾臟T細(xì)胞Tbx21 m RNA和Gata3 m RNA的表達(dá)

圖7 ELISA法檢測(cè)兩組T細(xì)胞IFN-γ和IL-4水平

2.5 莫諾苷對(duì)T細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，莫諾苷組T細(xì)胞β-連環(huán)蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加（t=16.47，P=0.004）；LEF1 mRNA表達(dá)水平增強(qiáng)（t=2.605，P=0.048）；同時(shí)細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)水平顯著上調(diào)（t=2.664，P=0.029）。見圖8和圖9。

3 討論

圖8 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)各組小鼠脾臟T細(xì)胞β-連環(huán)蛋白水平

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)因其在慢性疾病中突出的優(yōu)勢(shì)、穩(wěn)定的療效且較西藥毒性低，受到了越來(lái)越多的關(guān)注［10］。山茱萸活性物質(zhì)莫諾苷可通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路，具有治療糖尿?。?1］、抗炎鎮(zhèn)痛［12］等作用。Wnt信號(hào)通路主要由4條通路構(gòu)成：β-連環(huán)蛋白、T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞-增強(qiáng)子-結(jié)合因子通路、細(xì)胞極性通路和Wnt-Ca2+通路［13］。已有文獻(xiàn)表明，Wnt信號(hào)通路對(duì)于T細(xì)胞的發(fā)育也必不可少［14］。因此本研究通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在小鼠脾臟來(lái)源的T細(xì)胞中加入功能性CD3/CD28抗體，體外誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖和分化以評(píng)估山茱萸提取物莫諾苷是否能夠通過調(diào)控Wnt信號(hào)影響T細(xì)胞功能。

根據(jù)前期關(guān)于莫諾苷研究的文獻(xiàn)結(jié)果［15］，本實(shí)驗(yàn)選擇莫諾苷的處理濃度為5μmol/L和10μmol/L。在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)5μmol/L對(duì)于T細(xì)胞作用并不明顯，所以最終確定使用10μmol/L莫諾苷進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，莫諾苷組T細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路下游分子β-連環(huán)蛋白和LEF1 mRNA表達(dá)量上調(diào)，活化的Wnt通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子TGF-β分泌量增加，Treg細(xì)胞比例增加。同時(shí)莫諾苷組T細(xì)胞晚期活化標(biāo)志CD25表達(dá)增加，T細(xì)胞分化為Th1、Th2功能增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)錄起始因子Tbx21、Gata3等mRNA水平和細(xì)胞因子IL-4分泌增加也驗(yàn)證T細(xì)胞分化能力增強(qiáng)。Wnt家族中Wnt5a能夠通過上調(diào)IL-12分泌從而促進(jìn)Th1細(xì)胞的表達(dá)［16］，但又有研究表明，Wnt信號(hào)通路中 T細(xì)胞因子能夠通過誘導(dǎo)Gata3表達(dá)，從而促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化［17］。由于Wnt信號(hào)通路的不同下游分子活化后本身就具有促進(jìn)炎癥發(fā)生或者抑制炎癥反應(yīng)的不同作用，這就可以解釋本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入莫諾苷后，多種Wnt信號(hào)通路下游分子被激活，導(dǎo)致Th1和Th2亞群分化比例和細(xì)胞數(shù)均升高。

本研究通過模擬外周T細(xì)胞活化的抗原刺激信號(hào)，驗(yàn)證山茱萸提取物莫諾苷可促進(jìn)T細(xì)胞活化與分化。但是由于莫諾苷對(duì)Wnt信號(hào)的多條通路均有影響，T細(xì)胞分化的各個(gè)亞群方向也受其影響，具體是何種機(jī)制在莫諾苷對(duì)T細(xì)胞功能調(diào)控中起主導(dǎo)作用，需要后續(xù)增加不同Wnt信號(hào)通路的抑制劑與莫諾苷共同處理培養(yǎng)T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。