胡愛萍 吳貴愷 吳艷杰 鄭榮娟 周 蕾

(唐山市工人醫(yī)院消化內(nèi)科，唐山063000)

胃癌是臨床常見惡性腫瘤之一，具有較高的并發(fā)率與死亡率且患者預(yù)后較差，研究顯示影響胃癌治療效果的主要原因?yàn)槲赴┘?xì)胞增殖及遷移[1]。目前關(guān)于胃癌細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制研究較多，但臨床胃癌患者治療效果仍高居不下，因而進(jìn)一步分析胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。以往研究表明信號通路紊亂、癌基因及抑癌基因表達(dá)水平的變化均可導(dǎo)致胃癌的發(fā)生及發(fā)展[2]。Wnt/β-catenin信號通路可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT及轉(zhuǎn)移，研究表明Wnt/β-catenin信號通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及遷移[3]。相關(guān)研究表明性別決定區(qū)Y框蛋白1(Sex determining region Y-box 1，SOX1)是高遷移率族蛋白(HMG)DNA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其可在胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用，同時還可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[4]。研究顯示SOX1可直接抑制β-catenin表達(dá)并抑制Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生，但其具體作用機(jī)制有待深究[5]。關(guān)于SOX1與胃癌的相關(guān)研究相對較少，因此本研究通過上調(diào)SOX1表達(dá)，觀察其對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響以及對β-catenin信號通路的調(diào)控作用，以期為胃癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1與胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8檢測試劑盒均購自美國ThermoFisher公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；MTT、RIPA裂解液、PVDF膜、Matrigel基質(zhì)膠均購自北京索萊寶科技有限公司；Wnt/β-catenin通路激活劑SKL2001購自美國Sigma公司；β-catenin抗體購自美國Santa Cruz公司；上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)抗體均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔、兔抗羊IgG購自美國Santa Cruz公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；miRNA提取試劑盒、RT-PCR檢測試劑盒購自南京vazyme生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CFX96PCR儀、蛋白凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存GES-1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞，常溫條件下復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清的RPMI1640進(jìn)行培養(yǎng)，加入鏈霉素(100 μg/ml)、青霉素(100 U/ml)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃、5%CO2)，待細(xì)胞生長至90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定2～3代后，收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備單細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板(1×105個/孔)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80%左右，更換為不含胎牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，將SOX1陰性對照質(zhì)粒、SOX1 mimis質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞，分別命名為陰性轉(zhuǎn)染組、SOX1過表達(dá)組，未經(jīng)處理的細(xì)胞命名為空白對照組。β-catenin激活劑組：SOX1 mimis轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞前30 min，向培養(yǎng)基加入Wnt/β-catenin通路激活劑SKL2001(終濃度為10 μmol/L)進(jìn)行預(yù)處理。聯(lián)合組：SOX1 mimis轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后，加入Wnt/β-catenin通路激活劑SKL2001。轉(zhuǎn)染后將其置于培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2)培養(yǎng)6 h，更換含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清待測。

1.2.3實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測SOX1及β-catenin mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照qRT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 305 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共循環(huán)35次。均以磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GADPH)為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOX1、β-catenin mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.4CCK-8法檢測SGC-7901細(xì)胞增殖 收集各組SGC-7901細(xì)胞并接種96孔，5 000個/孔，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h，參照CCK-8檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別檢測450 nm波長時各孔細(xì)胞光密度(OD)，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/空白組吸光度×100%。

1.2.5平板細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測SGC-7901細(xì)胞增殖 收集各組SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化并制備單細(xì)胞懸液，接種于RPMI1640(6 ml)培養(yǎng)皿，1 000 個/皿，混勻，放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況(間隔12 h/次)。肉眼觀察細(xì)胞克隆形成時，取出培養(yǎng)皿，統(tǒng)計(jì)克隆形成細(xì)胞數(shù)量，克隆形成率=(克隆形成細(xì)胞數(shù)量/1 000)×100%。

1.2.6Transwell法檢測SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：收集各組SGC-7901細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，Transwell小室置于24孔板，將單細(xì)胞懸浮液接種于小室上層(10 000個/孔)，小室下層加入含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基(700 μl)，CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，清洗風(fēng)干后采用95%乙醇固定，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，去除小室濾膜上層未遷移細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)遷移至濾膜下層細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠(50 μl 2.0 mg/ml)加入小室上層底部，后續(xù)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)情況 收集轉(zhuǎn)染后各組SGC-7901細(xì)胞，蛋白裂解液反應(yīng)30 min，采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用8%～10% SDS-聚丙烯(PAGE)膠分離不同分子量的蛋白質(zhì)。蛋白樣品與Loading buffer 1∶4 混勻后上樣，電泳結(jié)束后，蛋白凝膠移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)(4℃)，轉(zhuǎn)膜時間為90 min，結(jié)束后采用TBST溶液清洗，5%脫脂牛奶封閉90 min，加入一抗，4℃過夜，次日加入二抗，室溫下孵育90 min，加入ECL顯色，將其置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1GES-1、SGC-7901細(xì)胞中SOX1表達(dá)水平比較 胃癌細(xì)胞SGC-7901中SOX1表達(dá)水平顯著低于正常細(xì)胞GES-1(P<0.01)，詳見表1。

2.2各組轉(zhuǎn)染效果檢測 轉(zhuǎn)染后，SOX1過表達(dá)組SOX1表達(dá)水平顯著高于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，而β-catenin表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與聯(lián)合組相比，SOX1過表達(dá)組SOX1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而β-catenin表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；β-catenin激活劑組SOX1表達(dá)水平顯著低于聯(lián)合組(P<0.01)，而β-catenin表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，詳見圖1、2。

GroupsnSOX1Normal group61.00±0.18Gastric cancer group60.53±0.09t-5.721P-0.000

2.3SOX1過表達(dá)抑制SGC-7901細(xì)胞增殖 隨著培養(yǎng)時間的延長，SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.01)，且不同時間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；與聯(lián)合組相比，SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.01)，而β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.01)，詳見圖3。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組SOX1 mRNA表達(dá)水平Fig.1 SOX1 mRNA expression levels in each group after transfectionNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

圖2 轉(zhuǎn)染后各組β-catenin mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of β-catenin mRNA in each group after transfectionNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

2.4平板克隆形成情況 SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞平板克隆形成率顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；與聯(lián)合組比較，SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞平板克隆形成率顯著降低(P<0.01)，而β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞平板克隆形成率升高(P<0.01)，詳見表2。

2.5細(xì)胞遷移及侵襲情況 SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、聯(lián)合組(P<0.01)；β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均顯著高于聯(lián)合組(P<0.01)，詳見圖4、表3。

2.6細(xì)胞中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)情況 SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞中β-catenin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)量均顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、聯(lián)合組(P<0.01)，而E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞β-catenin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)量均顯著高于聯(lián)合組(P<0.01)，而E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，詳見圖5、表4。

圖3 SOX1過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of SOX1 overexpression on proliferation of SGC-7901 cellsNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

表2 SOX1過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞平板克隆形成率的影響

Tab.2 Effect of SOX1 overexpression on formation rate of SGC-7901 cell plate clone

GroupsnClonal formation rate(%)Blank control group655.32±9.22Negative transfection group656.47±9.41SOX1 overexpression group6 35.19±5.871)2)β-catenin activator group6 77.38±12.892)Joint group652.18±8.70F-15.056P-0.000

Note：1)P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；2)P<0.01 compared with the Joint group.

圖4 SOX1過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響(×100)Fig.4 Effect of SOX1 overexpression on migration and invasion of SGC-7901 cells (×100)

表3 細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量比較

Tab.3 Comparison of cell migration and invasion

GroupsnNumber ofmigrated cellsNumber ofinvading cellsBlank control group6132.15±22.03112.47±18.75Negative transfection group6128.46±21.41120.36±20.06SOX1 overexpression group685.19±14.201)2)83.65±13.941)2)β-catenin activator group6213.15±35.532)215.16±35.862)Joint group6136.49±22.75145.37±24.23F-21.94126.294P-0.0000.000

Note：1)P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；2)P<0.01 compared with the Joint group.

圖5 細(xì)胞中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of β-catenin,E-cadherin,N-cadherin and MMP-9 proteins in cellsNote: 1.Blank control group；2.Negative transfection group；3.SOX1 overexpression group；4.β-catenin activator group；5.Joint group.

Groupsnβ-cateninE-cadherinN-cadherinMMP-9Blank control group61.23±0.210.68±0.111.34±0.221.51±0.25Negative transfection group61.26±0.220.67±0.121.41±0.241.49±0.25SOX1 overexpression group60.52±0.091)2)2.56±0.431)2)0.58±0.121)2)0.55±0.151)2)β-catenin activator group62.35±0.392)0.63±0.112)2.47±0.422)2.69±0.522)Joint group61.38±0.231.58±0.271.64±0.271.58±0.26F-42.02372.55437.32535.603P-0.0000.0000.0000.000

Note：1)P< 0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group; 2)P<0.01 compared with the Joint group.

3 討論

胃癌患者術(shù)后生存時間較短，其主要原因?yàn)榘┘?xì)胞增殖、遷移及侵襲[6]。因此，鑒定胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)分子，并探究其分子作用機(jī)制對胃癌靶向治療具有重要意義SOX家族成員可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展，其中SOX1可發(fā)揮抑癌作用[7]。相關(guān)研究表明微小RNA-155-5p可通過抑制SOX1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲[8]。肺癌細(xì)胞中SOX1表達(dá)降低并上調(diào)ECT2表達(dá)，同時SOX1還可通過影響相關(guān)通路表達(dá)進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖及遷移[9,10]。本研究結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞中SOX1表達(dá)水平顯著低于胃黏膜上皮細(xì)胞，說明SOX1可能參與胃癌發(fā)生過程。正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞核中β-catenin表達(dá)較低，Wnt信號通路激活后導(dǎo)致大量β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[11]。相關(guān)研究表明胃癌組織中β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高并可促進(jìn)該病發(fā)生、發(fā)展，但具體作用機(jī)制尚未完全闡明[12]。楊肖軍等[13]研究表明成纖維細(xì)胞激活蛋白可激活Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及遷移。近來相關(guān)研究顯示SOX1表達(dá)水平上調(diào)可抑制β-catenin作用進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[14]。為了探究SOX1抑癌作用與Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)性，本研究在SOX1過表達(dá)胃癌細(xì)胞中加入Wnt/β-catenin信號通路激活劑SKL2001，結(jié)果顯示SOX1過表達(dá)組SOX1表達(dá)水平顯著升高，而β-catenin表達(dá)水平顯著降低，β-catenin激活劑組SOX1表達(dá)水平顯著降低，而β-catenin表達(dá)水平顯著升高，說明胃癌細(xì)胞中SOX1過表達(dá)后其表達(dá)水平升高進(jìn)而抑制β-catenin表達(dá)。同時本研究進(jìn)一步分析各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，而β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率顯著降低，說明SOX1過表達(dá)后可抑制β-catenin促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用。提示SOX1可通過Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖。

乳腺癌組織中SOX1呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力[15]。Rad等[16]研究表明SOX1過表達(dá)后可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力。SOX家族中SOX2在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)后可下調(diào)細(xì)胞周期素D1及多聚ADP核糖聚合酶表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示SOX1過表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均顯著降低，β-catenin激活劑組SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量均顯著升高，說明SOX1過表達(dá)后可抑制β-catenin對胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的促進(jìn)作用。為探討其具體作用機(jī)制，本研究分析Wnt通路中β-catenin等相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示SOX1過表達(dá)組β-catenin、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低，而加入β-catenin激活劑后其蛋白表達(dá)均顯著升高，其中MMP-9還可降解細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲[18，19]。提示SOX1可通過抑制β-catenin、MMP-9蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲。相關(guān)研究表明EMT過程中E-cadherin可抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲，而N-cadherin作用相反[20]。本研究SOX1過表達(dá)E-cadherin表達(dá)升高而N-cadherin表達(dá)降低，提示SOX1可通過調(diào)控β-catenin、MMP-9、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲。

綜上所述，SOX1可通過抑制β-catenin通路進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，有助于為臨床治療胃癌提供新的理論依據(jù)。本研究存在不足之處，關(guān)于SOX1與β-catenin通路在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制有待深入研究。