郝曉妍 彭勛 任光輝

【摘要】 目的 研究對比乳腺癌組織及外周血纖維連接蛋白（FN）蛋白結(jié)構(gòu)域A（EDA）片段基因拷貝數(shù)變異對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。方法 100例手術(shù)切除的乳腺癌改良根治術(shù)標(biāo)本， 其中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為轉(zhuǎn)移組， 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為無轉(zhuǎn)移組;另選取同期進行乳腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本癌旁乳腺組織（正常組織）50例作為對照組。對三組血纖維連接蛋白EDA片段基因進行分析， 觀察并對比三組標(biāo)本細(xì)胞株中FN基因EDA蛋白的表達及EDA片段FN mRNA相對表達量情況。結(jié)果 轉(zhuǎn)移組陽性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對照組的（5.4±1.1）%， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)移組mRNA相對表達量（2.75±0.70）高于無轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對照組的（1.00±0.02）， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 FN基因EDA片段在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用， 其與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;外周血纖維連接蛋白;乳腺癌轉(zhuǎn)移;蛋白結(jié)構(gòu)域A片段

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.107

纖維連接蛋白是一種單基因編碼組成的多功能糖蛋白， 其主要分布于體液及血漿中， 在細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞膜中也有少量分布[1]。有研究表明[2]， 其在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲的過程中起到了非常重要的作用。隨著研究的不斷深入， 近年來醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)含有EDA片段的FN在腫瘤組織中呈現(xiàn)異常的高表達情況， 因此對于FN基因EDA的片段已經(jīng)變成現(xiàn)如今腫瘤醫(yī)學(xué)熱議的問題[3]。本研究旨在探究對比乳腺癌組織及外周血FN EDA片段基因拷貝數(shù)變異對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年1月～2017年1月手術(shù)切除的乳腺癌改良根治術(shù)標(biāo)本100例， 其中出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為轉(zhuǎn)移組， 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例作為無轉(zhuǎn)移組;另選取同期進行乳腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本癌旁乳腺組織（正常組織）50例作為對照組。

1. 2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 2. 1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者的預(yù)期生存期≥3個月;②無精神疾病， 有良好的治療依從性;③患者經(jīng)組織學(xué)確診， 且符合國際抗癌聯(lián)盟對于乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)。

1. 2. 2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①存在腦部轉(zhuǎn)移的患者;②妊娠、哺乳等特殊生理時期的患者。

1. 3 方法

1. 3. 1 標(biāo)本采集 采集研究對象組織標(biāo)本以及患者外周血3 ml。

1. 3. 2 脫氧核糖核酸（DNA）提取 采用美國Qiagen基因組DNA提取試劑盒， 嚴(yán)格按照試劑盒的說明進行DNA的提取。

1. 3. 3 DNA鑒定、定量 提取DNA樣品后， 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 預(yù)估濃度和DNA降解程度。對于濃度過低或者講解程度過高的樣本， 重新提取DNA。用微量紫外分光光度計對所有DNA樣本進行濃度測定， 并標(biāo)記至10 ng/μl， 備用。

1. 3. 4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增 采用AeeuCopyTM多重基因拷貝數(shù)檢測試劑盒進行PCR擴增。取2 μl DNA模板與2 μl內(nèi)對照DNA混合液混勻后， 加入10 μl 2×PCR Master Mix， 1 μl多重PCR引物混合液以及5 μl雙蒸水（ddH2O）。

1. 3. 5 纖維連接蛋白EDA片段基因拷貝數(shù)變異檢測 取1 μl PCR產(chǎn)物稀釋20倍后， 取1 μl與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD， 8.5 μl HI-DI混勻， 95℃變形5 min后上AABI 3130XL DNA測序儀。根據(jù)每個基因的樣本DNA/內(nèi)對照DNA擴增產(chǎn)物長度及熒光標(biāo)記信息， 利用GeneMapper 4.0對ABI3130XL測序儀生成的數(shù)據(jù)文件進行分析， 輸出每個產(chǎn)物峰的峰高以及峰面積。輸出結(jié)果采用Excel進行整理、統(tǒng)計和分析。

1. 4 觀察指標(biāo) 觀察并對比三組標(biāo)本細(xì)胞株中FN基因EDA蛋白的表達及EDA片段FN mRNA相對表達量情況。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)移組陽性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對照組的（5.4±1.1）%， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。轉(zhuǎn)移組mRNA相對表達量（2.75±0.70）高于無轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對照組的（1.00±0.02）， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一， 占女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位， 其不只是局部腫瘤， 也是一種全身性疾病， 其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。血行轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一個主要途徑， 通過血液循環(huán)的作用， 腫瘤細(xì)胞很容易轉(zhuǎn)移到全身到達其他組織和器官。纖維粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分之一， 其廣泛分布于血漿以及細(xì)胞外基質(zhì)中?，F(xiàn)代研究表明， 大多數(shù)正常組織細(xì)胞外基質(zhì)中并不存在EDA-FN的表達， 且良性腫瘤中EDA-FN的表達也不明顯。但通過增生旺盛的組織研究發(fā)現(xiàn)， 這類組織中EDA片段呈現(xiàn)異常高表達， 陽性表達的EDA-FN及其mRNA在惡性腫瘤周圍反應(yīng)區(qū)的間質(zhì)中和腫瘤細(xì)胞內(nèi)普遍呈現(xiàn)高表達， 說明該片段與細(xì)胞的遷移和增殖關(guān)系密切[4-6]。

國內(nèi)外目前普遍認(rèn)為， 惡性腫瘤中EDA-FN以及其mRNA存在明顯的高表達， 但在良性腫瘤中并不明顯， 且某些惡性腫瘤中的EDA-FN的表達程度與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力以及預(yù)后情況存在明顯的相關(guān)性[7]。相關(guān)研究結(jié)果顯示， 乳腺癌患者癌細(xì)胞核基質(zhì)中的EDA+FN表達率分別為45%和69%。本研究結(jié)果顯示， 乳腺癌無轉(zhuǎn)移的患者表達率為（71.9±4.8）%， 大致與同類研究相符。此外， 在正常的乳腺組織中極少表達EDA-FN， 與之相反， 在分化不良或者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中EDA-FN的表達率更高。廣義而言， 細(xì)胞的遷移是指細(xì)胞從其原本的位置遷移到另外一個位置， 而轉(zhuǎn)移則指的是癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶， 移動到其他的組織或器官， 并在所到處增殖形成另外一個腫瘤的過程。EDA能夠促進腫瘤細(xì)胞的黏附以及轉(zhuǎn)移， EDA-FN在淋巴管形成與發(fā)育中也起到了至關(guān)重要的作用， 且在胚胎的發(fā)生期間， EDA可以促進淋巴管生成中一些關(guān)鍵的因子比如轉(zhuǎn)錄因子Proxl、纖維狀激動蛋白等， 從而促進淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽、遷移[8]。

本研究結(jié)果顯示， 轉(zhuǎn)移組陽性細(xì)胞率（93.3±2.4）%高于無轉(zhuǎn)移組的（71.9±4.8）%和對照組的（5.4±1.1）%， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著轉(zhuǎn)移程度的逐漸加深， FN基因中EDA蛋白表達情況也越來越高。轉(zhuǎn)移組mRNA相對表達量（2.75±0.70）高于無轉(zhuǎn)移組的（1.74±0.44）和對照組的（1.00±0.02）， 且無轉(zhuǎn)移組高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。三組標(biāo)本EDA片段FN mRNA的表達量均有差異， 且隨著轉(zhuǎn)移程度的加深， 表達量也明顯增加。

綜上所述， FN基因EDA片段在乳腺癌的轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用， 其與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)， 對于EDA的深入研究有望打開治療腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的新篇章。

參考文獻

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[收稿日期：2019-02-25]