劉帥陽(yáng)，廖宣宇，余戎鎮(zhèn)，楊振贇，韓 鏐，郭 瓊，施 維*

（吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·生命科學(xué)學(xué)院長(zhǎng)春·130012）

痛風(fēng)是一種嘌呤代謝紊亂所致的慢性代謝紊亂疾病。主要臨床特點(diǎn)是體內(nèi)尿酸產(chǎn)生過多或腎臟排泄尿酸減少，引起血中尿酸升高，形成高尿酸血癥以及反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石沉積、痛風(fēng)性慢性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)畸形等。痛風(fēng)常累及腎臟而引起慢性間質(zhì)性腎炎和尿酸性腎結(jié)石。原發(fā)性痛風(fēng)除少數(shù)由于遺傳原因?qū)е麦w內(nèi)某些酶缺陷外，大都病因未明，并常伴有肥胖、高脂血癥、高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化、糖尿病及甲狀腺功能亢進(jìn)等。繼發(fā)性痛風(fēng)是繼發(fā)于白血、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、溶血性貧血、真性紅細(xì)胞增多癥、惡性腫瘤、慢性腎功能不全、某些先天性代謝紊亂性疾病如糖原累積病I型等。目前臨床上治療痛風(fēng)的藥物常具有一定的毒副作用，長(zhǎng)期服用容易誘發(fā)肝腎衰竭等疾病。

桑黃又稱桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃菇等，因多寄生于桑樹上而得名，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，是一種珍貴的大型食藥兩用菌，素有“森林黃金”之稱。桑黃在我國(guó)的應(yīng)用已經(jīng)有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，古代藥典中對(duì)其治療婦科急癥、瀉血、血淋疼痛等功效進(jìn)行了詳細(xì)記載，在現(xiàn)代，因其突出的調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化活性，逐漸成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的重點(diǎn)。一系列研究表明，桑黃具有降血糖、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝、及抗肝硬化等藥理作用，而對(duì)桑黃抗尿酸活性的研究仍然很少。尿酸主要是由黃嘌呤在XO酶的作用下氧化而來，而黃嘌呤由上游次黃嘌呤轉(zhuǎn)化得到，次黃嘌呤可在HGPRT酶的作用下轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，所以說尿酸的生成量與XO酶和HGPRT酶的表達(dá)及活性密切相關(guān)。本文利用液體發(fā)酵，研究桑黃提取物對(duì)XO和HGPRT基因表達(dá)以及酶活的影響，揭示其抗尿酸的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰酶，細(xì)胞培養(yǎng)皿，離心管、槍頭等耗材，0.22 μm濾膜，測(cè)HGPRT酶活用的ELISA試劑盒，預(yù)染蛋白Marker，RIPA裂解液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，Tris緩沖液，PBS緩沖液，TransZol Up RNA提取液，Takara試劑盒，長(zhǎng)白山桑黃，LO2細(xì)胞 （培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中）。

HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，WFH-201BJ紫外可見投射反射儀，紫外分光光度計(jì)，基因擴(kuò)增儀，GF-M3000酶標(biāo)儀，78-1磁力加熱攪拌器，恒溫振蕩器，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)隔音箱，電子天平，電熱恒溫培養(yǎng)箱，TGl-16G離心機(jī)，全自動(dòng)玻璃發(fā)酵罐，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑黃的培養(yǎng)

取生長(zhǎng)于長(zhǎng)白山地區(qū)的桑黃子實(shí)體為菌種，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)（配方為土豆兩個(gè)、葡萄糖40g、純凈水3L）在5L的發(fā)酵罐中發(fā)酵5天，發(fā)酵參數(shù)為溫度28℃、轉(zhuǎn)速120 rpm/min、pH 6.5，獲得桑黃子實(shí)體和培養(yǎng)液的混合物。

1.2.2 桑黃提取物的制備

將桑黃子實(shí)體和培養(yǎng)液的混合物進(jìn)行超聲破碎并過濾，將濾液12000 r/min，4℃離心5min獲取上清液，標(biāo)記為A于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

將桑黃子實(shí)體 （破碎成粉末）96℃水浴加熱30 min中得到桑黃水提物，過濾并離心得上清液，標(biāo)記為B于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 桑黃提取液主要成分檢測(cè)

將A、B兩組樣品進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2.4 冷凍干燥制得母液

通過低溫真空凍干方法將A液凍干，得黃褐色粉末即為桑黃提取物干粉，稱取0.6 g加入10 ml去離子水制成桑黃母液，濃度為0.06 g/ml。

1.2.5 RNA的提取

將 母 液 分 別 稀 釋 成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的濃度作用于生長(zhǎng)狀況良好的人體肝臟細(xì)胞中，作用48 h后用TransZol Up提取細(xì)胞中的RNA。每 10 cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入 1 ml的TransZol Up，然后用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，8000 g，4℃離心2min棄上清，向每1×107個(gè)細(xì)胞中加入1ml的TransZol Up，吹下細(xì)胞后靜置5 min，加入0.8 ml氯仿劇烈振蕩30 s，室溫孵育3min。10000 g，4°C離心15min，此時(shí)樣品分為三層，無(wú)色的水相（上層），中間層和有機(jī)層，轉(zhuǎn)移無(wú)色的水相于新離心管中，每使用1 ml TransZol Up加入0.5 ml的異丙醇，顛倒混勻室溫孵育10min。去上清加1 ml 75%乙醇劇烈漩渦，7500 g，4°C 離心 5min。棄上清，沉淀溶于 100 μl RNA Elution Buffer中。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)XO酶和HGPRT酶基因表達(dá)量的變化

將提取的RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下，XO：Sense 為 5’-GATGGGCCAAGGCCTTCATA-3’，anti-sense 為 5’-CTGACAAGCCGCATAGACGG-3’；HGPRT：Sense為 TGACCAGTCAACAGGGGACAT，anti-sense為TTTCACCAGCAAGCTTGCGA。用Takara公司的實(shí)時(shí)熒光試劑盒進(jìn)行熒光定量法檢測(cè)，具體步驟如下。

在反應(yīng)管中按照下表1進(jìn)行配制，42°C反應(yīng)2 min，去除基因組的DNA。進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中，最后加入RNA樣品。

表1 反應(yīng)體系1Table 1 reaction system1

按下表2配制反應(yīng)體系，輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為37°C反應(yīng)15 min，85°C反應(yīng)5 s。

表2 反應(yīng)體系2Table 2 reaction system2

在冰上按下表3配制qRT-PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System進(jìn)行檢測(cè)，采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：第一步為95°C反應(yīng)30 s； 第二步為95°C反應(yīng)5 s，60°C反應(yīng)34 s，40 個(gè)循環(huán)。

表3 反應(yīng)體系3Table 3 reaction system3

1.2.7 HGPRT活性的檢測(cè)

將母液分別稀釋成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的濃度作用于生長(zhǎng)狀況良好的人體肝臟細(xì)胞中，48 h后提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)，然后利用蛋白質(zhì)試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量，按照樣品中最低濃度進(jìn)行倍比稀釋，通過人HGPRT酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定HGPRT酶的活性，具體步驟如下：先將標(biāo)準(zhǔn)品按示意圖分別稀釋為20、40、80、160、320 U/L，往 HGPRT 抗體包被的 96 孔板中加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30min。洗板5次，加入酶標(biāo)試劑37℃反應(yīng)30min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10min。加終止液，15min內(nèi)在495nm處測(cè)OD值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其討論

2.1 桑黃提取液的主要成分

查閱文獻(xiàn)資料得知桑黃主要活性成分為多糖，根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果分析桑黃提取液中主要多糖活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為800～850。

2.2 細(xì)胞毒性的檢測(cè)

如圖4所示，用藥量超過0.20 g/ml后大量貼壁細(xì)胞懸浮在液體上層，由不透光的梭形活細(xì)胞變?yōu)橥腹獾膱A形死細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)較多死亡，因此桑黃提取液濃度超過0.20 g/ml后對(duì)細(xì)胞的毒性較大。

2.3 XO基因及HGPRT基因的表達(dá)量的檢測(cè)

由圖5可以看出，在轉(zhuǎn)錄水平上XO隨著桑黃提取液用藥量的增加而逐漸減少，藥物濃度為0.005 g/ml時(shí)即對(duì)XO基因有著較強(qiáng)的抑制，因此藥物通過抑制XO基因表達(dá)對(duì)XO合成有抑制作用，進(jìn)而黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的反應(yīng)受到抑制，尿酸合成受阻；HGPRT基因的表達(dá)隨著桑黃提取液給藥量的增加而逐漸增多，藥物對(duì)HGPRT合成具有促進(jìn)作用，有利于尿酸前體物質(zhì)次黃嘌呤通過支路途徑轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，抑制了尿酸的生成。

2.4 HGPRT酶活的檢測(cè)

用ELISA酶聯(lián)免疫法測(cè)定通過BCA定量后，不同給藥濃度下的細(xì)胞蛋白提取物中HGPRT的酶活性，由圖6結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)（0.005～0.15 g/ml）HGPRT酶活性隨著給藥濃度的提高而逐漸增大，HGPRT通過支路途徑將尿酸前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，進(jìn)而使尿酸因?yàn)樵喜蛔愣铣墒茏琛?/p>

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，通過液體發(fā)酵得到桑黃菌培養(yǎng)液，進(jìn)行質(zhì)譜分析后，確定桑黃培養(yǎng)液主要活性多糖成分的相對(duì)分子質(zhì)量為800～850左右。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)用藥量超過0.20 g/ml后對(duì)細(xì)胞影響較大，細(xì)胞出現(xiàn)較多的死亡。然后將桑黃提取液作用于肝臟細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其能夠在一定范圍內(nèi)能促進(jìn)HGPRT基因的表達(dá)及其酶活性，使尿酸前體物質(zhì)黃嘌呤被更多的轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致尿酸合成受阻；在一定范圍內(nèi)其能抑制XO基因的表達(dá)，從而抑制體內(nèi)尿酸的生成途徑的關(guān)鍵酶，使尿酸的合成受阻。本實(shí)驗(yàn)從分子水平上研究了桑黃抗尿酸活性的機(jī)理，為桑黃資源的開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，并為天然降尿酸藥物的開發(fā)和桑黃的臨床應(yīng)用提供了一定的理論機(jī)理，但桑黃體內(nèi)抗尿酸活性的研究有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的跟進(jìn)。

致謝：感謝長(zhǎng)白朝鮮族自治縣林豐菌業(yè)有限公司提供的桑黃菌。