齊 曉 王興春,? 向小娥

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷 030801;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)類國家教學(xué)示范中心,江蘇南京 210095)

油菜(Brassica napus L.)為十字花科蕓薹屬植物,原產(chǎn)于我國。據(jù)統(tǒng)計,我國目前油菜播種面積達(dá)730萬hm2,位居世界第二,油菜籽總產(chǎn)量為1 430 萬t,位居世界第三,油菜已成為我國重要的油料作物之一[1]。近年來,由于人均種植面積的減少,以及油菜與糧棉作物茬口矛盾的突出,油菜種植面積明顯下降[2-3]。因此,改良油菜品質(zhì)對提高其經(jīng)濟價值和食用價值具有重要意義。

油菜的品質(zhì)指標(biāo)主要包括含油量、油脂組分構(gòu)成、蛋白質(zhì)含量等。研究表明,油菜籽經(jīng)榨取油脂后可得到50%～55%的餅粕,餅粕中約含40%～50%的粗蛋白,因其賴氨酸和蛋氨酸含量較高,氨基酸組成合理,且鈣、磷、硒、錳等礦物質(zhì)含量較高,可作為植物蛋白源,應(yīng)用于動物飼料加工[4-5]。此外,菜籽油中含有人體所必需的多種不飽和脂肪酸,其中油酸可減少人體血漿中低密度脂蛋白膽固醇含量,能預(yù)防和治療動脈硬化;亞油酸可降低人體內(nèi)血清膽固醇和甘油三酯含量,能預(yù)防高血壓、高血脂,使血管軟化,防止血栓形成,對人體健康十分有益,因此菜籽油被譽為健康油脂[6-7]。

質(zhì)體(plastid)是一類與碳水化合物的合成與貯藏密切相關(guān)的細(xì)胞器,其在植物不同的器官中可以分化為具有不同功能的形式,如造粉體、有色體、白色體、葉綠體以及黃化苗中的黃化質(zhì)體,其中研究較多的是葉綠體。葉綠體是植物光合作用主要的光接收器,其在植物光合器官中的含量決定了光合作用的效率[8-9]。在油菜生長發(fā)育期,葉片和角果是油菜最重要的2 個光合器官,二者的光合作用調(diào)控著油菜籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)[10]。在油菜籽發(fā)育過程中,其所需營養(yǎng)物質(zhì)主要來源于葉片、角果皮和莖稈的光合作用[11],其中70%～90%的營養(yǎng)物來自于角果皮產(chǎn)生的光合產(chǎn)物[12-13]。油菜開花前,植株主要通過葉片進行光合作用,其光合產(chǎn)物主要用于蛋白質(zhì)和淀粉的合成,供油菜根、莖、葉的形成;開花期根、莖、葉中的可溶性糖含量逐漸減少,并向花序轉(zhuǎn)移,促進角果形成;角果形成后,其光合產(chǎn)物以及植株中的營養(yǎng)物主要供給籽粒灌漿;成熟后,籽粒中的糖分大多轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和油脂儲備于籽粒胚中[14-15]。

油菜植株除了葉片和角果皮中含有葉綠體進行光合作用外,發(fā)育中的油菜籽也含有葉綠體[16]。油菜籽形成過程中胚中葉綠體會經(jīng)歷2 個分化過程,即葉綠體形成和去分化。種子在成熟初期變綠,通過其光合作用提供氧氣和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)來促進種子儲存物質(zhì)的合成;之后,葉綠體去分化形成干種子中的非光合質(zhì)體[17-18]。在擬南芥中,其胚內(nèi)的葉綠體發(fā)育于受精后48 h,持續(xù)約10 d[19]。在種子成熟期間,由于其失去葉綠素、內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)和淀粉,葉綠體去分化為非光合質(zhì)體,胚變成無色[20]。

油菜胚中的葉綠體既是綠胚進行光合作用的場所,也是油菜胚脂肪酸合成場所[21]。在油菜胚生長過程中,油菜胚包裹在果皮和種皮中,僅有少量的光可以透過角果皮和種皮到達(dá)胚[22-23]。盡管如此,胚細(xì)胞中的葉綠體仍能利用微弱的光進行光合作用,其產(chǎn)物ATP 和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)能夠為胚細(xì)胞的代謝活動提供能量和還原力[24-27]。在油菜種子發(fā)育過程中,胚由原初的白色逐漸變成綠色,最后變成黃色,這暗示胚中的葉綠體在種子油脂合成過程中發(fā)揮了一定的作用。如陳婷[28]研究發(fā)現(xiàn)油菜角果遮光后籽粒含油量顯著降低,而蛋白質(zhì)含量呈增加趨勢;邵玉嬌等[29]對油菜角果進行遮光處理同樣發(fā)現(xiàn)籽粒含油量后期迅速下降,而粗蛋白含量在籽粒發(fā)育前期明顯提高。上述研究表明,角果皮的光照處理對油菜籽油脂品質(zhì)有較大的影響。但目前關(guān)于胚細(xì)胞的光合作用對其營養(yǎng)物質(zhì)合成影響的研究尚未見報道。本試驗通過分析油菜遮光角果的胚以及利用光合作用抑制劑處理的胚的脂肪酸、蛋白質(zhì)以及葉綠素生物合成的變化,以期為揭示胚細(xì)胞中質(zhì)體光合作用在油菜種子儲存物質(zhì)生物合成中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為甘藍(lán)型油菜中雙11 號,購于武漢中油種業(yè)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 中雙11 號種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院油菜所油菜試驗田中,采用直播種植共3 行,行長2.5 m,行距30 cm,每行定植10 株幼苗,株距25 cm,田間管理同常規(guī)大田。油菜植株進入盛花期后隨機選取20 株,用彩色毛線標(biāo)記同一天開放的花朵。標(biāo)記后25 d(25 d)對角果套錫箔進行遮光和未遮光(不套錫箔)處理(CK)。遮光處理后3 d(28 d)進行第1 次取樣,遮光處理后10 d(35 d)進行第2 次取樣,樣品立即液氮速凍后,-80℃保存,用于葉綠素、蛋白質(zhì)含量及脂肪酸含量的測定。

1.2.2 胚培養(yǎng) 將25 d 油菜胚置于S 培養(yǎng)基[30]中培養(yǎng),培養(yǎng)條件： 溫度為 25℃, 光照強度為 600 μE·m-2s-1,處理組中添加50 μmol·L-1N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide,DCC),對照加等體積溶解DCC 的溶劑,培養(yǎng)時間分別為4、8 和12 h,培養(yǎng)后收集胚,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 葉綠素含量的測定 每處理各取5 粒胚,均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),分別加入2 mL 95%丙酮-乙醇溶液[31],于25℃下遮光浸提處理3 h,對葉綠素提取液進行吸光度測定,即用Thermo Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀(美國THERMO 公司)在645 nm 和663 nm 下測定吸光度值,95%丙酮-乙醇溶液為空白對照。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定 每處理各取5 粒胚,并均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),分別加入0.5 mL 預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,并使用Tissuelyser-48 全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)進行勻漿,采用5254R 小型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)于4℃12 000 r·min-1離心10 min,取上清。利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]中的微孔板測定程序測定上清液中的蛋白濃度,在562 nm 下測定吸光度值,以不含BSA 樣品的光吸收值作為空白對照。

1.2.5 脂肪酸含量測定 每處理各取5 粒胚,并均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),分別放入2 mL 離心管中利用Tissuelyser-48 全自動樣品快速研磨儀進行研磨粉碎,加入1.5 mL 甲醇(含2.5% 濃硫酸)以及2 μL 十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)(10 μg·μL-1),80℃水浴2 h,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中,加入2 mL 0.9% NaCl溶液和1 mL 正己烷,振蕩混勻后4 000 r·min-1離心10 min,取上清。真空干燥后加入50 μL 乙酸乙酯溶解,轉(zhuǎn)移至氣相色譜加樣瓶中待測。同時設(shè)置1 個僅含有十七烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)的空白對照。

利用Agilent 7890A 氣相色譜儀(江蘇蘇美達(dá)儀器設(shè)備有限公司)進行色譜分析,色譜柱采用BPX-70毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);初始溫度120℃,保持1 min,以10℃·min-1的速率升至150℃,再以4℃·min-1的速率升溫至230℃,保持10 min?；鹧骐x子化檢測器(flame ionization detector,FID)溫度300℃,氫氣30 mL·min-1,空氣350 mL·min-1。進樣量1 μL,經(jīng)自動進樣器轉(zhuǎn)入色譜柱后進行色譜分析。按照公式計算脂肪酸相對含量：

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理及分析統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜角果遮光對胚中主要儲存物質(zhì)積累的影響

2.1.1 油菜角果遮光對葉綠素含量的影響 由圖1可知,隨著油菜胚的生長發(fā)育,遮光處理和CK 胚中的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均呈增加的趨勢。但與CK 相比,角果經(jīng)遮光處理后胚中葉綠素a 和總?cè)~綠素含量各生育期均極顯著降低,其中葉綠素a 含量在遮光處理后3 d(28 d)后下降77.04%,降低幅度較大,遮光處理后10 d(35 d)下降64.62%;而葉綠素b 含量在遮光處理后3 d(28 d)極顯著下降,遮光處理后10 d(35 d)呈增加趨勢,但仍低于CK,且與CK 差異不顯著。表明油菜角果遮光處理能影響油菜籽胚中葉綠素的含量。

圖1 遮光對油菜胚葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of masking silique with tinfoil on the chlorophyll content in B. napus embryos

2.1.2 油菜角果遮光對蛋白質(zhì)含量的影響 由圖2可知,未遮光處理CK(28 d)和CK(35 d),平均每粒油菜胚蛋白質(zhì)含量分別為241.08 μg 和447.10 μg,蛋白增長速率約為29.43 μg·d-1;而遮光處理后3 天(28 d)的蛋白質(zhì)平均含量約為45.39 μg,遮光處理后10 d(35 d)約為117.53 μg,蛋白增長速率約為10.31 μg·d-1,不同生育期CK 蛋白含量均極顯著高于遮光處理,且蛋白增長速率也明顯高于CK。表明,角果遮光處理會導(dǎo)致油菜胚中蛋白質(zhì)的積累量降低。

圖2 遮光對油菜胚蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of masking silique with tinfoil on the protein content in B. napus embryos

2.1.3 油菜角果遮光對脂肪酸含量的影響 由圖3可知,隨著胚的發(fā)育,CK 中棕櫚酸(C16：0)和亞油酸(C18：2)含量降低,硬脂酸(C18：0)含量無明顯變化,而油酸(C18：1)和亞麻酸(C18：3)含量升高。角果經(jīng)遮光處理后,胚中棕櫚酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)的含量升高,遮光處理后3 d(28 d)二者分別較CK 上升11.08%和78.42%;遮光處理后10 d(35 d)分別較CK 上升102.50%和169.44%,且均極顯著高于CK。而遮光處理的亞油酸(C18：2)和亞麻酸(C18：3)含量均低于CK,遮光處理后3 d(28 d)較CK 分別降低7.29%和12.02%,遮光處理后10 d(35 d)亞油酸(C18：2)降低18.68%,亞麻酸(C18：3)含量降幅較大,降低約50%,極顯著低于CK。油酸(C18：1)是油菜胚中的主要脂肪酸,遮光處理后3 d(28 d)的含量相較CK 增加21.79%,遮光處理后10 d(35 d)的含量較CK 增加33.79%,且極顯著高于CK。表明,角果遮光處理會增加胚中飽和脂肪酸(棕櫚酸和硬脂酸)和部分不飽和脂肪酸(油酸)的含量,而降低胚中亞油酸和亞麻酸2 種不飽和脂肪酸的含量。

2.2 ATP 合成抑制劑DCC 對胚中主要儲存物質(zhì)的影響

圖3 遮光對油菜胚脂肪酸含量的影響Fig.3 Effect of masking silique with tinfoil on the fatty acid content in B. napus embryos

2.2.1 ATP 合成抑制劑DCC 對胚中葉綠素含量的影響 由圖4 可知,CK 胚中葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量均隨著時間的推移而逐漸降低。經(jīng)DCC 處理4 h 和8 h 的胚中葉綠素含量顯著或極顯著降低,但在培養(yǎng)期間,隨著時間推移至DCC 處理培養(yǎng)12 h 時胚中葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素量均略有增加,且均與其CK 的葉綠素含量接近。表明,DCC 可通過抑制胚細(xì)胞ATP 的形成減慢葉綠素的生物合成,從而降低胚細(xì)胞中葉綠素的含量。

圖4 DCC 對油菜胚葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of DCC on the chlorophyll content of B. napus embryos

2.2.2 ATP 合成抑制劑DCC 對胚中蛋白質(zhì)生物合成的影響 由圖5 可知,經(jīng)過DCC 處理的胚中蛋白質(zhì)的含量隨著時間的推移逐漸增加,而CK 呈先降低后增加的趨勢。DCC 處理后4 h 和12 h,胚中蛋白含量均略低于CK,但無顯著差異,DCC 處理后8 h 胚中蛋白含量高于CK,但差異不顯著。表明DCC 處理對胚中蛋白積累量的影響較小。

圖5 DCC 對油菜胚蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effect of DCC on the protein content of B. napus embryos

2.2.3 ATP 合成抑制劑DCC 對胚脂肪酸生物合成的影響 由圖6 可知,隨著DCC 處理時間的增加,硬脂酸(C18：0)的含量逐漸降低,油酸(C18：1)的含量于處理后12 h 時降低至51.47%,較CK 降低了7.49%,而亞油酸(C18：2)和亞麻酸(C18：3)與CK 相比略有增加。但在脂肪酸組分中,油酸是主要脂肪酸,添加DCC 處理能抑制油酸的生物合成,即DCC 抑制了胚中不飽和脂肪酸油酸的生物合成。

圖6 DCC 對油菜胚脂肪酸含量的影響Fig.6 Effect of DCC on the fatty acid content of B. napus embryos

3 討論

研究表明光合作用會影響油菜籽含油量及其油脂品質(zhì),如王志慧[32]提出高效的光合作用能為油料作物油的積累提供充足的碳源。王志新[33]在大豆的研究中發(fā)現(xiàn),在大豆初花期-終花期進行遮光處理會影響其蛋白質(zhì)和脂肪總量,且隨著遮光時間的增加,大豆籽粒蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢,而脂肪含量呈逐漸下降的趨勢。吳正鋒等[34]發(fā)現(xiàn)對花生進行遮光處理會導(dǎo)致籽仁蛋白質(zhì)含量降低,而對脂肪含量的影響不明顯。

油菜胚由角果皮包裹,長期處于低光環(huán)境,只有少量的光可以透過角果皮和種皮最終進入胚中[35]。油菜胚中含有光合活性的葉綠體,葉綠體是綠色植物固定和轉(zhuǎn)化光能的主要細(xì)胞器。在油菜種子發(fā)育過程中,胚由白色逐漸變成綠色,成熟后變?yōu)辄S色,在此過程中,種子中的葉綠素呈先增加后下降的趨勢,同時葉綠體是糖酵解途徑和脂肪酸合成途徑發(fā)生的重要場所,能夠進行光合磷酸化產(chǎn)生NADPH 和ATP,為脂肪酸的生物合成提供部分能量和還原性的H+[27,36]。本研究中,對角果進行遮光處理降低了油菜胚中葉綠素的含量,其中葉綠素a 含量在遮光后大幅降低,而葉綠素b 含量隨著遮光天數(shù)的增加下降幅度逐漸變小。表明光能夠透過油菜角果皮到達(dá)胚細(xì)胞,胚中質(zhì)體葉綠素含量受光誘導(dǎo)。此外,對角果進行遮光處理能顯著降低油菜胚中蛋白質(zhì)的含量,增加胚中棕櫚酸和硬脂酸2 種飽和脂肪酸以及油酸的含量,降低亞油酸和亞麻酸2 種不飽和脂肪酸的含量。表明光對胚營養(yǎng)物質(zhì)的生物合成有明顯的調(diào)控作用,這與前人研究一致。

研究表明,種皮的光合作用對油菜籽儲備物質(zhì)的積累具有重要作用[28-29]。本研究中,遮光后角果皮的光合作用降低,導(dǎo)致從角果皮運輸?shù)脚叩臓I養(yǎng)物質(zhì)減少,最終影響了胚的貯藏物質(zhì)的合成。但遮光不僅是遮蓋了角果皮,同時也降低了胚的光合作用,長時間遮光,導(dǎo)致油菜籽發(fā)育畸形,說明光對種子正常發(fā)育是必需的,而不僅是營養(yǎng)物質(zhì)的積累減少。本研究為了降低長時間遮光導(dǎo)致油菜籽凋亡,僅用鋁箔覆蓋油菜角果10 d。在此期間,油菜胚盡管未致凋亡狀態(tài)[37],然而其發(fā)育受到不同程度的影響,諸多代謝明顯受到影響,其中油菜籽胚葉綠素合成明顯降低,脂肪酸的生物合成代謝途徑顯著降低,最終影響油菜籽油脂的積累量,這些結(jié)果與前人在亞麻籽中的研究類似[35,38]。本研究表明角果皮遮光處理使得質(zhì)體光合原始產(chǎn)物ATP、NADPH 降低,導(dǎo)致供給給質(zhì)體脂肪酸、儲存蛋白和葉綠素生物合成的還原物質(zhì)和能量減少,進而導(dǎo)致脂肪酸和儲存蛋白生物合成代謝降低,最終導(dǎo)致油菜籽儲備物減少。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,角果皮遮光可降低油菜胚中葉綠素和蛋白質(zhì)含量,增加胚中飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸以及不飽和脂肪酸油酸的含量,降低亞油酸和亞麻酸2 種不飽和脂肪酸的含量;光合抑制劑DCC 使胚中葉綠素含量降低,抑制了不飽和脂肪酸油酸的生物合成;油菜胚發(fā)育過程中需要胚葉綠體的光合作用為其提供ATP 和還原性的H+供給胚儲存物質(zhì)的生物合成。本研究闡明了質(zhì)體光合在油菜籽儲存物質(zhì)的生物合成過程中的作用,為今后培育高含油量、高品質(zhì)的油菜新品種提供了一定的理論依據(jù)。