周廣志 魯 敏 安華明

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴州省果樹工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽 550025)

刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)為薔薇科薔薇屬植物,其果實具有較高的營養(yǎng)保健和醫(yī)藥價值,是我國特有的并正大力開發(fā)的新興果樹,僅貴州省的種植面積已超過10 萬hm2。除果實外,刺梨葉中還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),具有重要的醫(yī)藥和保健功能[1-2],其相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)也逐漸受到人們關(guān)注[3-4]。貴州省果樹工程技術(shù)研究中心刺梨課題組前期研究表明,刺梨葉中含有較為豐富的抗氧化物質(zhì),如維生素C(Vc)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和黃酮等活性物質(zhì)[5-9],其Vc 含量甚至高于草莓、芒果、桃、番茄等園藝作物[10-14]。研究發(fā)現(xiàn)刺梨三萜類物質(zhì)對其抗氧化能力具有較大貢獻(xiàn),且在體外試驗中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌作用[15-16]。目前,對刺梨果實中的活性物質(zhì)鑒定的研究已有大量報道[17-19],而關(guān)于刺梨葉中抗氧化物質(zhì)種類及其對抗氧化活性貢獻(xiàn)等方面的研究尚鮮見報道。

無籽刺梨(R. sterilis S. D. Shi)和無刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)是晚于刺梨被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的近緣種質(zhì)。它們在植株形態(tài)、果實口感等方面與刺梨雖有相近之處,但在果實外觀、果刺有無及果實營養(yǎng)價值等方面與刺梨存在較大差異[18,20],具有明顯的特殊性狀和較大的開發(fā)利用潛力。雖然在資源分布地素有以其葉片為原料加工制作保健茶的傳統(tǒng)習(xí)慣,但對其營養(yǎng)物質(zhì)種類的研究鮮見報道。因此,本研究以刺梨、無刺刺梨和無籽刺梨3 個種質(zhì)資源的葉片為試驗材料,分析不同葉齡葉片中Vc、總?cè)啤⒖偡?、總黃酮的含量和SOD 活性變化,并通過測定鐵離子還原(ferric reducing antioxidant power,FRAP)、2,2′-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,ABTS]和1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)3 個體系的抗氧化能力,分析活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性及貢獻(xiàn),以期為刺梨、無刺刺梨和無籽刺梨葉片活性物質(zhì)的系統(tǒng)評價及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)、無刺刺梨(R.roxburghii f. eseiosa Ku)和無籽刺梨(R. sterilis S. D.Shi)的葉片為試驗材料,其中,刺梨和無籽刺梨的葉片采于貴州大學(xué)刺梨種質(zhì)資源圃,無刺刺梨葉片采于貴州省黔西縣。采樣的植株共為20 ～90 株,實驗采取3個時期樣品,分別是生長6～10 d 的葉片(幼葉),生長60～65 d 的葉片(成熟葉),生長100 ～105 d 的葉片(老葉),3 個時期葉片樣品隨機(jī)取自樹勢基本一致的植株樹冠外圍中上部,每次采樣量均大于100 g,液氮處理后立即于-75℃保存。

1.2 試驗試劑

標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸、沒食子酸、蘆丁和水溶性維生素E(Trolox)均購自上海源葉生物科技有限公司;福林酚(Folin-ciocalteu,Fc)試劑購自北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三吡啶吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-striazine,TPTZ]、ABTS、DPPH 試劑購自上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 Vc 含量的測定 參照王樂樂等[21]的方法,采用LC-15C 高效液相色譜儀(日本島津制作所)測定Vc 含量。

1.3.2 總?cè)扑岷康臏y定 采用香草醛-冰乙酸法[22-23]測定總?cè)扑岷?以標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸為對照,稱取樣品0.5～1.5 g,加入15 mL 75%乙醇,50℃超聲提取50 min,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取0.2 mL 提取液于10 mL 離心管中,依次加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL 高氯酸,搖勻后于60℃水浴處理20 min,然后于冰浴冷卻,再加入10 mL 冰乙酸并充分搖勻,于545 nm 波長處測定吸光值。

1.3.3 總酚含量的測定 采用福林酚比色法[24]測定總酚含量,以標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸為對照(記作CK1),稱取葉樣0.5 ～1.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取0.05 mL 提取液于10 mL容量瓶,依次加入2.45 mL 蒸餾水、0.2 mL Fc、2.5 mL 20% 碳酸鈉,定容,室溫靜置2 h,于765 nm 波長處測定吸光值。

1.3.4 總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[25-26]測定總黃酮含量,以標(biāo)準(zhǔn)蘆丁品為對照(CK2),稱取0.5 ～1.5 g 樣品,加入15 mL 30%甲醇,超聲提取2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL,即為提取液,搖勻備用。吸取2 mL 提取液于10 mL 離心管中,依次加入0.4 mL 5% NaNO2、0.6 mL 10% Al(NO3)3、4 mL 4% NaOH,每一步均需搖勻,室溫靜置6 min,用30%甲醇定容至10 mL,再靜置15 min,然后于510 nm 波長處測定吸光值。

1.3.5 SOD 活性測定 采用氮藍(lán)四唑法[27]測定SOD活性。

1.3.6 鐵離子還原能力(FRAP)的測定 參照杜國榮[28]和Benzie 等[29]的方法,并略加改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲提取2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。于10 mL 離心管中加入3 μL 樣品提取液和8 mL FRAP 溶液, 37℃反應(yīng)10 min 后在593 nm 波長處測定吸光值。

1.3.7 ABTS 自由基(ABTS·)清除能力的測定 參照杜國榮[28]和Re 等[30]的方法,并略作改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。將5 μL 樣品提取液和5 mL ABTS 溶液加入10 mL 離心管中,避光反應(yīng)10 min 后在734 nm 波長處測定吸光值。

1.3.8 DPPH 自由基(DPPH·)清除能力的測定 參照杜國榮[28]和Takebayashi 等[31]的方法,并略作改動。稱取葉樣0.5 g,加入15 mL 30%甲醇,超聲2 h,8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,定容至50 mL 搖勻備用。于10 mL 離心管中加入10 μL 樣品提取液和4 mL DPPH 甲醇溶液,反應(yīng)2 h 后在517 nm 波長處測定吸光值。

上述3 種體外抗氧化性評價方法中,均同時以0.1 g·mL-1沒食子酸和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液代替樣品提取液作為對照?？寡趸椒ńY(jié)果用μmol·L-1水溶性維生素E Trolox 等量抗氧化能力(trolox equal antioxidant capacity,TEAC)表示。所有試驗均設(shè)3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析;DPS v 7.05 統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性、相關(guān)性和主成分分析分析;多重比較采用Duncan′s 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種主要活性物質(zhì)含量變化

圖1 不同發(fā)育時期刺梨葉片的Vc、總?cè)?、總酚、總黃酮含量和SOD 活性Fig.1 Vc, total triterpene, total phenolic, total flavonoids content and SOD activity in leaves of Rosa roxburghii at different developmental stages

由圖1 可知,3 個種質(zhì)資源葉片的主要活性物質(zhì)含量和活性變化趨勢基本一致。其中,總酚、總黃酮、Vc 含量和SOD 活性均呈先上升后下降的趨勢,依次表現(xiàn)為成熟葉＞幼葉＞老葉,總酚含量以無刺刺梨的成熟葉中為最高,3 個種質(zhì)資源成熟葉中的總黃酮含量無顯著差異,Vc 含量以刺梨成熟葉中為最高,無刺刺梨和無籽刺梨成熟葉片中的SOD 活性無顯著差異;總?cè)坪孔兓c上述4 種活性成分不同,呈持續(xù)上升趨勢,其中幼葉中總?cè)坪孔畹?成熟葉中總?cè)坪恐械?老葉中含量最高,以刺梨老葉表現(xiàn)最為顯著。

2.2 葉片抗氧化活性分析

由圖2-A 可知,3 個種質(zhì)資源在不同發(fā)育時期的刺梨葉片鐵離子還原能力(FRAP 值)均顯著高于沒食子酸和蘆丁,且均隨著刺梨葉片的發(fā)育FRAP 值呈先升高后降低的趨勢,依次表現(xiàn)為成熟葉＞幼葉＞老葉,成熟葉中,無籽刺梨的FRAP 值顯著高于其他2 種試驗材料,且分別是對照(沒食子酸和蘆丁)的4.38 倍和5.43 倍。

由圖2-B 可知,3 個種質(zhì)資源在不同發(fā)育時期的葉片ABTS·清除能力均差異顯著(P＜0.05),且均顯著高于對照(沒食子酸和蘆丁)。其總體變化趨勢與FRAP 值一致,依次表現(xiàn)為成熟葉＞幼葉＞老葉,且成熟葉中,無刺刺梨ABTS·清除能力顯著高于其他2種試驗材料,分別是對照(沒食子酸和蘆丁)的9.77 倍和56.48 倍。

圖2 不同發(fā)育時期刺梨葉片的FRAP 值的變化和ABTS·、DPPH·清除能力Fig.2 Changes of FRAP value and ABTS·, DPPH·scavenging ability of leaves of rosa roxburghii at different developmental stages

由圖2-C 可知,與對照(沒食子酸和蘆丁)相比,3種材料在不同發(fā)育時期葉片DPPH·清除能力差異顯著(P ＜0.05),其DPPH·清除能力總體變化趨勢與FRAP 值和ABTS·清除能力基本一致,依次表現(xiàn)為成熟葉＞幼葉＞老葉,成熟葉中DPPH·清除能力則依次表現(xiàn)為刺梨＞無刺刺梨＞無籽刺梨,這3 種試驗材料的DPPH·清除能力分別是沒食子酸的9.75 倍、8.77 倍和8.21 倍,分別是蘆丁的21.59 倍、19.41 倍和18.17倍。

2.3 活性物質(zhì)含量和抗氧化能力之間的相關(guān)性

由表1 可知,DPPH·清除能力和FRAP 值與總酚、總黃酮和Vc 含量均呈極顯著正相關(guān)(P ＜0.01),與SOD 活性均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);ABTS·清除能力與Vc 含量呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01),與總酚和總黃酮含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),與SOD 呈正相關(guān),但不顯著。Vc 含量與DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01),總酚、總黃酮含量與DPPH·清除能力、ABTS·清除能力和FRAP值均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),說明Vc、總酚和總黃酮在刺梨葉片中抗氧化能力起關(guān)鍵性作用。而總?cè)坪颗cDPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈負(fù)相關(guān),這可能與在葉片的整個發(fā)育時期總?cè)坪砍噬仙厔?而DPPH·消除能力、ABTS·清除能力和FRAP 值均呈先升后降趨勢有關(guān)。

表1 活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between active substances and antioxidant capacity

2.4 5 種活性物質(zhì)對抗氧化能力的貢獻(xiàn)

3 種刺梨葉片主要抗氧化物質(zhì),如總酚、總黃酮、Vc 含量和SOD 活性均以成熟葉中為最高,且3 種抗氧化能力也以成熟葉中最強(qiáng),因此對成熟葉中具有抗氧化能力的5 種活性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。由表2 可知,各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率,取特征值大于1 的前2 個主成分,其累計貢獻(xiàn)率可達(dá)到75.138 3%,表明各性狀的貢獻(xiàn)率分散,累計貢獻(xiàn)率增長不明顯;而選擇前3 個因子,其累計貢獻(xiàn)率能達(dá)到91.862 2%,基本反映了5 個活性物質(zhì)對抗氧能力貢獻(xiàn)的全部信息。主成分PC1、PC2、PC3 的貢獻(xiàn)率分別為46.512 8%、28.625 4%、16.723 9%。

表2 各性狀主成分的特征向量及貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvectors and percentages of accumulated contribution of principal components

原始變量和3 個主成分之間的相關(guān)性如表3 所示,PC1 中總酚和Vc 含量的系數(shù)較大,是對第一主成分影響最大的特征向量,說明PC1 是由總酚和Vc 含量組成的一個綜合指標(biāo)。而PC2 主要代表性指標(biāo)是總?cè)坪亢蚐OD 活性;PC3 主要代表性指標(biāo)是總黃酮含量。5種活性物質(zhì)對抗氧化能力貢獻(xiàn)依次表現(xiàn)為總酚、Vc 含量＞總?cè)坪?、SOD 活性＞總黃酮含量,其中以總酚和Vc 含量貢獻(xiàn)最大,總?cè)坪亢蚐OD 活性次之。

表3 刺梨葉片性狀變量因子負(fù)荷量Table 3 Foctor loadings for petals character variable of Rosa roxburghii

3 討論

本研究結(jié)果表明,3 種刺梨葉片中總酚含量均以生長60～65 d 的成熟葉最高,這與謝國芳等[20]的研究結(jié)果相同。無刺刺梨成熟葉中總酚含量明顯高于其他2 個刺梨材料,因此提取總酚時應(yīng)以無刺刺梨成熟葉片為最佳原料。本研究中,3 種刺梨的成熟葉片中總黃酮含量均高于果實,但各材料間無明顯差異,其生長60～65 d 成熟葉片均較果實更適合于開發(fā)和提取總黃酮;總?cè)坪縿t以刺梨老葉中最高,因此提取總?cè)祁愇镔|(zhì)可以選擇生長100 ～105 d 刺梨老葉;在3 種刺梨的成熟葉片中的Vc 含量和SOD 活性均明顯低于果實,因此對Vc 和SOD 方面的開發(fā)以果實為主。

研究表明,以植物為主的富含天然抗氧化劑的產(chǎn)品,可作為自由基清除劑,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)損傷健康細(xì)胞[32],用于治療包括糖尿病、癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和炎性疾病[33-35]。因此,開發(fā)天然抗氧化劑材料已成為一種趨勢。刺梨葉中含有豐富的活性物質(zhì),其中Vc 含量高于大部分果蔬產(chǎn)品,參與細(xì)胞內(nèi)ROS 清除。貴州省果樹工程技術(shù)研究中心刺梨課題組前期研究發(fā)現(xiàn)刺梨葉片抗氧化能力是Vc 和SOD 協(xié)同作用的結(jié)果[8];刺梨葉醇提物與其對DPPH·和·OH 清除能力呈正相關(guān)[1]。本研究中,無籽刺梨葉提取物中總酚、總黃酮和Vc 含量與FRAP 和對ABTS·清除能力呈正相關(guān),這與在木菠蘿、人心果和龍眼葉[36]及秀麗槭葉[37]中的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)3 種刺梨葉片的3 種抗氧化活性均依次表現(xiàn)為成熟葉＞幼葉＞老葉,對不同基因型資源成熟葉來說,無刺刺梨對ABTS·清除能力、刺梨對DPPH·清除能力以及無籽刺梨FRAP 均不同程度高于其他2種刺梨材料。5 種活性物質(zhì)的主成分分析表明,總酚和Vc 含量對抗氧化能力的貢獻(xiàn)率為46.512 8%;總?cè)坪亢蚐OD 活性的貢獻(xiàn)率為28.625 4%,總黃酮含量貢獻(xiàn)率為16.723 9%,說明刺梨葉片中5 種活性物質(zhì)協(xié)同發(fā)揮抗氧化功能,而其中總酚和Vc 起著決定性作用。

總酚和總?cè)祁惢衔锸侵参锶~片的主要次生代謝產(chǎn)物,其藥用價值越來越受到人們重視。研究表明,酚類物質(zhì)具有防治心腦血管疾病以及消炎、抗衰老等[38-39]。研究發(fā)現(xiàn)印檁葉多酚提取液的DPPH·和·OH 清除能力較Vc 強(qiáng),能夠在較低質(zhì)量濃度發(fā)揮抗氧化能力[40]。三萜類物質(zhì)具有抗癌[41]、抗炎、抗菌、抗病毒、抗HIV、抗衰老、降低膽固醇等生理活性[42]。本研究中,3 個試驗材料成熟葉片中總酚含量明顯高于無刺和無籽刺梨果實,也顯著高于其他各時期葉片,對抗氧化能力的貢獻(xiàn)率為46.512 8%。本研究結(jié)果與前人研究[43]結(jié)果相似。費(fèi)約果成熟葉中總酚含量明顯高于幼葉和老葉,具有極強(qiáng)的抗氧化活性[43]。因此,成熟葉片是提取天然成分尤其是多酚的主要來源,尤其以無刺刺梨成熟葉最佳。刺梨果實總?cè)铺崛∥飳Ζ?葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用,而刺梨老葉中總?cè)坪扛哂诖汤婀麑峓44],因此其開發(fā)的茶葉等產(chǎn)品可作為防治餐后高血糖癥及緩解高胰島素血癥的重要材料。

4 結(jié)論

刺梨及其2 個近緣種質(zhì)葉內(nèi)含有豐富的活性物質(zhì)和較強(qiáng)的抗氧化能力,但不同基因型資源及其不同葉齡葉片在活性物質(zhì)含量和自由基清除能力等方面存在差異。對不同葉齡葉片而言,成熟葉中總酚、總黃酮和Vc 含量最高,體外抗氧化能力最強(qiáng),且前2 類主成分對抗氧化能力的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到75%以上,發(fā)育時期較長的葉片中有較高的三萜類物質(zhì)積累。綜上,3 個薔薇屬種質(zhì)葉可作為天然抗氧化物質(zhì)開發(fā)的良好材料來源。