江政松　童金鳳　陳雪禮　劉曉峰

【摘要】 目的：探討M1和M2型巨噬細(xì)胞在急性冠狀動脈綜合征（ACS）中的表達(dá)水平。方法：選取本院32例ACS患者為ACS組、30例穩(wěn)定性心絞痛（SAP）患者為SAP組及32例健康對照者（HC）為HC組，流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血M1、M2細(xì)胞，ELISA方法檢測M1分泌的細(xì)胞因子TNF-α、M2分泌的細(xì)胞因子TGF-β1，儀器法檢測超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）。結(jié)果：ACS組M1型細(xì)胞比例、TNF-α、hs-CRP水平均高于HC組、SAP組（P<0.05），且M1細(xì)胞與TNF-α呈顯著正相關(guān)（P<0.000 1）;ACS組M2型細(xì)胞比例、TGF-β1水平均低于HC組、SAP組（P<0.05），且M2細(xì)胞與TGF-β1呈顯著正相關(guān)（P<0.000 1）;SAP組M2型細(xì)胞比例、TGF-β1水平均低于HC組，TNF-α水平高于HC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），SAP組和HC組M1型細(xì)胞比例、hs-CRP水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：在ACS的病程進(jìn)展中，M1型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子TNF-α具有促炎作用，而M2及其分泌的細(xì)胞因子TGF-β1可能具有免疫保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 M1; M2; 巨噬細(xì)胞; 急性冠狀動脈綜合征

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of M1 and M2 macrophages in acute coronary syndrome（ACS）.Method：32 patients with ACS were selected as ACS group，30 patients with stable angina pectoris（SAP）were selected as SAP group，32 healthy controls（HC）were selected as HC group.Flow cytometry was used to detect M1 and M2 cells in peripheral blood，the cytokines TNF-α and TGF-β1 secreted by M1 and M2 were detected by ELISA，high sensitivity C-reactive protein（hs-CRP）was detected by instrumental method.Result：The percentage of M1 cells，TNF-α and hs-CRP levels in ACS group were higher than those of HC group and SAP group（P<0.05），there was a significant positive correlation between M1 cells and TNF-α（P<0.000 1）.The percentage of M2 cells and the level of TGF-β1 in ACS group were lower than those of HC group and SAP group（P<0.05），there was a significant positive correlation between M2 cells and TGF-β1（P<0.000 1）.The percentage of M2 cells and the level of TGF-β1 in SAP group were lower than those of HC group，and the level of TNF-α was higher than that of HC group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The percentage of M1 cells and the level of hs-CRP in SAP group and HC group were compared，the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：In the progression of ACS，M1 cells and their secreted cytokine TNF-α have pro-inflammatory effects，while M2 and its secreted cytokine TGF-β1 may have immunoprotective effects.

【Key words】 M1; M2; Macrophages; Acute coronary syndrome

First-authors address：The First Peoples Hospital of Jiujiang，Jiujiang 332000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.005

急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndromes，ACS）是指動脈粥樣硬化斑塊脫落，血小板聚集，血栓形成，致使冠狀動脈狹窄、阻塞、引起心肌缺血以及心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病理現(xiàn)象，包括不穩(wěn)定性心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）、非Q波心肌梗死（non-Q wave myocardial infarction，NQMI）、Q波心肌梗死（Q wave myocardial infarction，QMI）乃至ACS終末期臨床表現(xiàn)猝死等。據(jù)世界衛(wèi)生組織介紹，盡管全力防止和治療手段不斷改進(jìn)，包括冠狀動脈疾病在內(nèi)的心血管疾病仍然是造成死亡的首要原因[1]。巨噬細(xì)胞分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。目前對于這兩類細(xì)胞在ACS中的作用還不清楚。筆者通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測ACS患者外周血M1、M2細(xì)胞，ELISA方法檢測M1分泌的細(xì)胞因子TNF-α、M2分泌的細(xì)胞因子TGF-β1，儀器法檢測超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），以明確ACS患者體內(nèi)炎癥因子的變化情況及其之間的相互關(guān)系，為下一步早期診斷和干預(yù)治療提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月-2019年1月本院心內(nèi)科收治的經(jīng)冠脈造影確診為ACS患者32例為ACS組（AMI 13例、UAP 19例）、穩(wěn)定性心絞痛（stable angina pectoris，SAP）30例為SAP組，另選取同期32例健康體檢者為HC組（health control，HC）。納入標(biāo)準(zhǔn)：AMI為休息狀態(tài)下持續(xù)性胸痛30 min以上，心肌酶譜升高2倍以上，并且心電圖發(fā)生典型ST段抬高或壓低改變;UAP為1個月內(nèi)新發(fā)的嚴(yán)重心絞痛，心絞痛程度加重，或休息時發(fā)生心絞痛，心電圖發(fā)生缺血性改變，心肌酶譜升高在2倍以內(nèi);SAP為1個月內(nèi)心絞痛發(fā)生頻率，持續(xù)時間和程度沒有改變，心肌酶譜正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染、全身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全者。本研究符合人體試驗的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，檢查者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 CD163-PE、CD86-APC、CD68-FITC單抗購自美國eBioscience公司;TNF-α、TGF-β1 ELISA kit試劑盒購自晶美公司;FC500流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）;貝克曼庫爾特IMMAGE800特定蛋白分析儀;ST-360型酶標(biāo)儀（科華生物）。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 所有受檢者均于冠狀動脈造影手術(shù)前空腹抽取靜脈血3管，1管EDTA抗凝用于流式細(xì)胞分析，另2管為普通干管，2干管均分離血清，取其中1管血清分裝至無核酶、無蛋白酶的EP管后立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，?干管立即上機(jī)進(jìn)行hs-CRP檢測。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測M1和M2型巨噬細(xì)胞比例 取流式管，加入待檢全血50 μL，隨后加入抗人CD163-PE、抗人CD86-APC、抗人CD68-FITC各5 μL，充分混勻，室溫置暗處20 min。加入BD溶血劑1 mL，輕輕搖勻并置室溫暗處10 min。200 g離心5 min，傾去上清，洗滌3次，加2%多聚甲醛400 μL，震蕩搖勻。同時用FITC、PE、APC標(biāo)記的抗人IgG抗體設(shè)置同型對照，用貝克曼庫爾特FC500流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。采用CD68/SSC設(shè)門，確定巨噬細(xì)胞群體，進(jìn)一步進(jìn)行巨噬細(xì)胞亞群分析。數(shù)據(jù)分析使用WinMDI 2.9軟件。

1.2.4 血清TNF-α、TGF-β1濃度檢測 將收取到的患者和對照組冰凍血清室溫解凍，使用ELISA kit試劑盒測定TNF-α、TGF-β1濃度，所有操作嚴(yán)格參照說明書。

1.2.5 hs-CRP檢測 分離普通干管血清，立即使用貝克曼庫爾特IMMAGE800特定蛋白分析儀分析患者血清hs-CRP。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;相關(guān)性利用Pearson分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基線資料比較 三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 三組M1、M2型巨噬細(xì)胞比例比較 巨噬細(xì)胞分析以CD68/SSC設(shè)門，進(jìn)一步分析M1和M2型細(xì)胞在CD68+細(xì)胞的比例。ACS組M1型細(xì)胞比例均高于HC組、SAP組，M2型細(xì)胞比例均低于HC組、SAP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;HC組和SAP組M1型細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但SAP組M2型細(xì)胞比例低于HC組（P<0.05），見表2。

2.3 三組血清TNF-α、TGF-β1、hs-CRP比較 ACS組TNF-α、hs-CRP水平均高于HC組、SAP組，TGF-β1水平均低于HC組、SAP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;SAP組TNF-α水平高于HC組，TGF-β1水平低于HC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但HC組和SAP組的hs-CRP水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.4 M1、M2細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β1的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，M1細(xì)胞與TNF-α呈顯著正相關(guān)（r=0.814 3，P<0.000 1）、M2細(xì)胞與TGF-β1呈顯著正相關(guān)（r=0.930 3，P<0.000 1），見圖1。

3 討論

冠狀動脈斑塊破裂（或侵蝕）致血栓形成和急性狹窄或閉塞而產(chǎn)生的綜合征是冠心病致死致殘的主要原因[2]。炎癥和免疫影響動脈斑塊形成現(xiàn)在已被廣泛接受。積累的證據(jù)強(qiáng)調(diào)不同炎癥和免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在動脈粥樣硬化病變的病理生理學(xué)中的關(guān)鍵作用[3]。已有研究表明，巨噬細(xì)胞亞群與多種疾病，如腫瘤、病毒引起的腦損傷、肥胖和腎病等相關(guān)[4-9]。機(jī)體通過多個信號通路選擇性表達(dá)靶基因，使巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)相應(yīng)特征性的分子標(biāo)志物，最終實現(xiàn)不同極性及功能，即促炎的M1型和抗炎的M2型巨噬細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，ACS組M1型細(xì)胞比例及TNF-α均高于HC組、SAP組（P<0.05），且M1細(xì)胞與TNF-α呈顯著正相關(guān)（P<0.000 1）。M1型巨噬細(xì)胞表面有CD11c、CD86、主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ、膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體等特征性受體，具有高表達(dá)IL-12和IL-23，低表達(dá)IL-10的表型特征，并能產(chǎn)生活性氧、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及炎癥因子（如IL-1β、腫瘤壞死因子及IL-6）等。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α等炎癥因子在冠心病患者體內(nèi)明顯偏高，炎癥因子誘導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷，使局部心肌結(jié)構(gòu)和心肌氧化應(yīng)激出現(xiàn)病理性改變，導(dǎo)致電重構(gòu)，誘導(dǎo)心律失常的同時參與心肌重建[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，ACS組hs-CRP水平高于HC組、SAP組（P<0.05），CRP是全身炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)，由肝細(xì)胞合成分泌，在炎癥反應(yīng)的早期就成百上千的升高，可以引起局部壞死心肌的炎癥反應(yīng)[12-13]。這表明M1型細(xì)胞在ACS進(jìn)展中分泌促炎細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥的作用。

M2型巨噬細(xì)胞具有高表達(dá)IL-10、低表達(dá)IL-12和IL-23的表型特征，并高表達(dá)清道夫受體、甘露醇受體、半乳糖受體、精氨酸酶、Dectin-1（CLEC7A）、CD206和CD163等，這類細(xì)胞分泌細(xì)胞因子CCL17、CCL22、CCL24、TGF-β，TGF-β可以增強(qiáng)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，刺激血管內(nèi)皮生成因子促進(jìn)血管生成[14]。TGF-β1能夠使血管細(xì)胞黏附分子1、細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)下調(diào)，從而抑制巨噬細(xì)胞黏附[15]。本研究結(jié)果顯示，ACS組M2型細(xì)胞比例、TGF-β1水平均低于HC組、SAP組（P<0.05），且M2細(xì)胞與TGF-β1呈顯著正相關(guān)（P<0.000 1）。ACS相較于SAP是更嚴(yán)重的心血管病變。這表明M2巨噬細(xì)胞顯示免疫調(diào)節(jié)和抗炎屬性。

綜上所述，在ACS的病程進(jìn)展中，M1型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子TNF-α具有促炎作用，而M2及其分泌的細(xì)胞因子TGF-β1可能具有免疫保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Mendis S，Puska P，Norrving B.Global Atlas on Cardiovascular Disease Prevention and Control[J].Geneva World Health Organization，2011.

[2]楊躍進(jìn)，楊進(jìn)剛，袁晉青，等.高齡老年（≥75歲）急性冠狀動脈綜合征患者規(guī)范化診療中國專家共識[J].中國循環(huán)雜志，2018，33（8）：732-750.

[3] Cimmino G，Loffredo F S，Morello A，et al.Immune-inflammatory Activation in Acute Coronary Syndromes：A Look into the Heart of Unstable Coronary Plaque[J].Curr Cardiol Rev，2017，13（2）：110-117.

[4] Zaki M A，Wada N，Ikeda J，et al.Prognostic implication of types of tumor-associated macrophages in Hodgkin lymphoma[J].Virchows Arch，2011，459（4）：361-366.

[5] Soulas C，Conerly C，Kim W K，et al.Recently infiltrating MAC387（+）monocytes/macrophages a third macrophage population involved in SIV and HIV encephalitic lesion formation[J]Am J Pathol，2011，178（5）：2121-2135.

[6] Prieur X，Mok C Y，Velagapudi V R，et al.Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice[J].Diabetes，2011，60（3）：797-809.

[7] Harford K A，Reynolds C M，McGillicuddy F C，et al.Fats，inflammation and insulin resistance：insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue[J].Proc Nutr Soc，2011，70（4）：408-417.

[8] Zhang L，Sugiyama T，Murabayashi N，et al.The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice[J].J Mol Endocrinol，2011，47（2）：157-165.

[9] Waddell A，Ahrens R，Steinbrecher K et al.Colonic eosinophilic inflammation in experimental colitis is mediated by Ly6C（high）CCR2（+）inflammatory monocyte/macrophage-derived CCL11[J].J Immunol，2011，186（10）：5993-6003.

[10]鄭堃，馬麗霞，郭秀珍，等.血清CD40L、TNF-α、IL-1β水平與急性冠脈綜合征繼發(fā)室性心律失常的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2015，55（41）：45-46.

[11]張源，黎玲伊，陳潔，等.急性冠狀動脈綜合征患者外周血單個核細(xì)胞TLR4和TNF-α的變化及臨床意義[J].中國動脈硬化雜志，2017，25（5）：480-484.

[12] Pasceri V，Willerson J T，Yeh E T.Direct proinflammatory effect of C-reactive protein on human endothelial cells[J].Circultion，2000，102（18）：2165-2168.

[13] Venugopal S K，Devarj S，Yuhanna I，et al.Demonstration that C-reactive protein decreases eNOS expression and bioactivity in human aortic endothelial cells[J].Circultion，2002，106（12）：1439-1441.

[14] Gombozhapova A，Rogovskaya Y，Shurupov V，et al.

Macrophage activation and polarization in post-infarction cardiac remodeling[J].J Biomed Sci，2017，24（1）：13.

[15] Feinberg M W，Jain M K，Werner F，et al.Transforming growth factor-beta 1 inhibits cytokine-mediated induction of human metalloelastase in macrophage[J].J Biol Chen，2000，275（33）：25766-25773.

（收稿日期：2019-01-07） （本文編輯：董悅）