高永紅，張國杰

(1.河南康復中心醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

糖尿病[1](Diabetes mellitus，DM)是指由遺傳因素、飲食不平衡、內(nèi)分泌功能紊亂等多種致病因子共同作用，導致胰島素功能減退，生物作用障礙,并伴蛋白質(zhì)、糖、水、電解質(zhì)、脂肪等一系列代謝紊亂綜合征。糖尿病心臟血管病變是常見的慢性并發(fā)癥之一[2]，發(fā)病率是正常人群的3～5倍，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是導致糖尿病患者死亡或傷殘的主要原因[3]，約占糖尿病死亡率80%，累及心肌細胞、心臟自主神經(jīng)、冠狀動脈，臨床表現(xiàn)為心律不齊、心絞痛、心肌梗塞、心臟衰竭、甚至猝死。目前研究認為糖尿病心臟血管病變可能參與或加速冠狀動脈粥樣硬化炎癥過程，但兩者間病理機制尚不明確。中醫(yī)學認為,糖尿病心臟病屬于“消渴”“心痛”范疇[4]，DM患者嗜食肥甘厚味，飲食不節(jié)損傷脾胃，脾氣虛弱，病久不愈，正氣虧虛，痰濕內(nèi)生，又因外邪內(nèi)侵或情志難舒累及心絡，痰瘀互結，阻塞絡道，氣滯血瘀引發(fā)糖尿病心臟病，屬以氣血兩虛為本，痰瘀阻脈為標的本虛標實證。西醫(yī)多以降糖降脂、抗炎抗氧化等對癥治療，效果不理想療程長，易產(chǎn)生耐藥性及不良反應[5]，而中醫(yī)治療糖尿病由來已久，益氣活血方可益氣活血、滋陰生津，對于延緩改善糖尿病慢性并發(fā)癥、臨床癥狀有著極好的療效[6]，但益氣活血方與糖尿病心臟血管之間機制尚不明確，本研究旨在研究益氣活血方輔助治療對糖尿病大鼠模型心臟血管保護功能的機制，期望為臨床治療提供實驗和理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用成年健康SPF級雄性SD大鼠64只(北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證書11400700126477)，體質(zhì)量180～210 g，采用同種無菌飼料及滅菌純水投喂大鼠，環(huán)境溫度(24±2)℃之間，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為陰性對照組(n=16)、造模組(n=48)，本研究上報動物保護協(xié)會，且獲得醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要藥物及試劑

自擬益氣活血方組方：黃芪、白術、茯苓、葛根、丹參、川芎和甘草(上海市藥材有限公司)，按照人與大鼠劑量換算比例進行配置，制備成凍干粉，每克含生藥5 g；辛伐他汀(北京萬生藥業(yè)有限責任公司)；鏈脲佐菌素(華中海威北京基因科技有限公司)；MCP-1及ICAM-1免疫組化染色試劑盒(上海雅吉生物科技)；水合氯醛(南京邦諾生物科技有限公司)；超敏C反應蛋白試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司)；0.9%NaCl溶液(北京北生研生物制品有限公司)；HE染色試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)；10%福爾馬林(上海譜振生物科技有限公司)；枸櫞酸鈉緩沖液(赫澎生物科技有限公司)。

1.3 實驗模型制備

造模組48只大鼠均給予1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液(STZ、0.1 M檸檬酸鈉緩沖液配成1%濃度，pH值4.2無菌檸檬酸緩沖液)，按60 mg/kg注射于腹腔；對照組大鼠給予相同劑量檸檬酸鈉緩沖液于腹腔注射。72 h后，取造模組大鼠鼠尾靜脈血，檢測血糖,血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功。造模成功大鼠共42只，按完全隨機原則分為模型組(n=14)、聯(lián)合組(n=14)、西藥組(n=14)，西藥組以1.7 mg/kg給予辛伐他汀片灌胃，聯(lián)合組以31 g/kg自擬益氣活血方聯(lián)合1.7 mg/kg予辛伐他汀片灌胃，對照組及模型組每日給予相同體積生理鹽水灌胃，療程12周。

1.4 觀察項目

1.4.1 各組大鼠一般情況

每日觀察并記錄各組大鼠生長情況、體質(zhì)量、毛色、活動情況、精神狀態(tài)、飲食和排泄情況等。

1.4.2 生化指標測定

大鼠成功麻醉后股動脈采血，以強生血糖儀測定血糖(Blood glucose，GLU)，分離血清后使用全自動生化儀檢測膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol，HDL)和低密度脂蛋白(How density lipoprotein cholesterol，LDL)。

1.4.3 炎性因子測定

采血分離血清后取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)水平。步驟如下，標準品稀釋和加樣，各孔加樣量均為50 μL，第1、2孔濃度為300 ng/L，第3、4孔濃度為200 ng/L，第5、6孔濃度為100 ng/L，第7、8孔濃度為50 ng/L，第9、10孔濃度為25 ng/L；設11、12孔為空白孔，不加樣品和酶標試劑，其余操作相同，在酶標包被板96孔加入40 μL樣品稀釋液和10 μL樣品；溫育30 min；洗滌拍干重復5次；除空白孔加酶標試劑50 μL；溫育30 min；洗滌拍干重復5次；加顯色劑封板溫育15 min；加終止液上機測定。

1.4.4 組織形態(tài)學、細胞黏附因子-1(Intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1)及單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)表達

第12周末次給藥后，禁食禁水12 h，麻醉處死各組大鼠進行解剖。取胸主動脈10%甲醛溶液固定，石蠟包埋成塊備用，采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin eosin，HE)染色法。切成4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，1%鹽酸溶液分化30 s，流水洗凈，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結果。免疫組織化學法：石蠟4 μm切片，二甲苯脫蠟，抗原修復，3%雙氧水孵育10 min去除內(nèi)源性氧化物酶的活性，PBS沖洗5 min×3次，滴加正常山羊血清封閉20 min，滴加一抗工作液孵育60 min，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗工作液孵育37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，二氨基聯(lián)苯(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑顯色2 min，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

對照組大鼠生長速度正常，精神良好，毛發(fā)整齊有光澤，飲水、尿量無異常；模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)枯黃，明顯多食多飲多尿，消瘦，反應遲鈍，部分大鼠出現(xiàn)下肢水腫癥狀；西藥組與聯(lián)合組均出現(xiàn)模型組類似表現(xiàn)，皆有一定程度改善，各組大鼠一般情況表現(xiàn)依次為模型組<西藥組<聯(lián)合組<對照組。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量情況及血糖水平

干預后模型組、西藥組、聯(lián)合組GLU均顯著高于對照組(P<0.05)，西藥組與模型組之間GLU無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組GLU遠遠低于模型組和西藥組(P<0.05)。干預前四組體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，干預后模型組、西藥組、聯(lián)合組體質(zhì)量均顯著低于對照組(P<0.05)，西藥組與模型組之間體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組體質(zhì)量遠遠高于模型組和西藥組(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血脂水平比較

模型組、西藥組TC、TG、LDL及聯(lián)合組TC顯著高于對照組(P<0.05)，模型組HDL顯著低于對照組(P<0.05)，西藥組及聯(lián)合組HDL與對照組無明顯差異(P>0.05)，聯(lián)合組TG、LDL與對照組無明顯差異(P>0.05)，西藥組TG、LDL顯著高于聯(lián)合組(P<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況及血糖水平比較

注：*表示采用Kruskal-WallisH秩和檢驗計算的H值。與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

表2 各組大鼠血脂情況比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

2.4 各組大鼠hs-CRP水平比較

模型組hs-CRP水平顯著高于西藥組、聯(lián)合組及對照組(P<0.05)，西藥組、聯(lián)合組及對照組之間hs-CRP水平比較無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠hs-CRP水平比較

注:與模型組比較,bP<0.05。

2.5 各組大鼠病理學比較

對照組細胞紋理清晰，排列整齊，胞漿著色均勻，內(nèi)皮細胞扁平，內(nèi)膜平坦，平滑肌細胞與彈力板近平行相間排列。模型組細胞排列紊亂，內(nèi)皮細胞突起，內(nèi)膜增厚，平滑肌細胞增生，病灶處彈力板呈波浪狀或交織狀排列，可見斷裂分離。聯(lián)合組及西藥組的組織形態(tài)變化與模型組類似，但較模型組有所好轉，其中聯(lián)合組優(yōu)于西藥組，見圖1。模型組、西藥組、聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達顯著高于對照組(P<0.05)，聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達顯著低于模型組、西藥組(P<0.05)，見圖2、圖3和表4。

圖1 病理組織學比較(HE,×400)

圖2 各組ICAM-1表達情況(HE,×200)

圖3 各組MCP-1表達情況(HE,×200)

表4 各組大鼠免疫組織化學比較

注:與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

3 討論

隨著人口不斷趨于老齡化和肥胖化，受生活習慣和生活壓力雙重影響[7]，糖尿病病患人數(shù)快速增加，國際糖尿病聯(lián)合會報告指出，到2025年世界糖尿病患者可能升至38億，并將每年11月14日定為“世界糖尿病日”。糖尿病分為1型和2型糖尿病，1型糖尿病[8]是由于基因、病毒或自身免疫體統(tǒng)破壞產(chǎn)生胰島素的胰腺胰島β細胞，導致自身無法生產(chǎn)足夠胰島素或根本無法生產(chǎn)胰島素，目前對于此病沒有治愈方法，但可以通過胰島素注射維持正常生活。2型糖尿病[9]由于胰島素抵抗作用異?；蛞蚋鞣N原因細胞對胰島素沒有反應導致胰島素分泌遲緩不足，不能正常發(fā)揮生理作用。DM患者持續(xù)慢性高血糖環(huán)境及其他危險因素導致代謝紊亂，累及眼、腎、心腦血管等，最終導致器官功能障礙衰竭，糖尿病性心臟病[10]作為糖尿病的主要致死原因，病理改變包括心肌細胞纖維化、心肌肥大凋亡及血管病變等，其中血管病變導致的冠狀動脈粥樣硬化心臟病約占糖尿病死亡率80%，主要因為長期血糖偏高，化學物質(zhì)破壞血管壁，血管失去彈性逐漸硬化，白細胞在趨化因子作用下進入內(nèi)膜，釋放炎性因子，血脂斑塊、纖維蛋白、血小板在受損處聚集黏附，動脈硬化增厚，導致血管管腔狹窄，血液流通不暢，心肌無法獲得充足血液及氧氣，造成心臟病[11]。目前西醫(yī)采用胰島素、二甲雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等藥物進行降糖控制，但即使控制血糖也不能阻止延緩血管病變發(fā)生及進程，說明DM患者血管病變可能是多因素共同作用結果，而中醫(yī)藥具有多層面、多進程、多靶點共同作用機體，改善整體機能的優(yōu)勢。中醫(yī)學認為糖尿病屬于“消渴”癥[12]，《素問》云：“二陽結為消”，指出燥熱郁結，陰液虧損是發(fā)病的主要病機，臨床以多食、多飲、多尿、消瘦為基本癥狀，心臟血管病變屬于消渴癥常見主要并發(fā)癥，主要因為遷延不愈、熱灼津虧而致氣虛血瘀，臟腑功能失調(diào)伴心悸氣短、胸痛頻發(fā)，應以活血化瘀兼益氣滋陰治療。

益氣活血方由黃芪、白術、茯苓、葛根、丹參、川芎、甘草組成，其中黃芪[13]健脾益氣，生津通脈，擴張血管、改善血流變、可雙向調(diào)節(jié)血糖、增強機體免疫力、抗心律失常；白術降燥除濕，降血糖、增強白細胞吞噬力、增強免疫力、抗凝血；茯苓除熱生津，能增強巨噬細胞毒性、抗炎抗菌、清楚自由基、增強胰島素活性；葛根解熱止渴，抗心律失常、改善心肌缺血、擴張冠狀動脈、改善血流變、降低膽固醇；丹參活血祛瘀，抑制纖維組織增生、抑制脂質(zhì)過氧化反應、抗氧化抗凝血、抗動脈硬化、降糖降脂、擴張血管；川芎行氣止痛，降糖降脂抗凝血、增加冠狀動脈血流量、抑制血管收縮、改善心?。桓什菡{(diào)和諸藥，抗炎抗變態(tài)、增強免疫力；全方針對消渴、心痛之癥，以益氣活血治本、通絡祛瘀治標，標本兼治，緩解改善諸多癥候。辛伐他汀[14]作為口服降血脂藥物，屬于羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，可抑制肝臟制造膽固醇，有效避免血脂升高、降低心臟病發(fā)作幾率，常見副作用包括便秘、頭痛、惡心等。

本研究中，采用STZ破壞大鼠胰島β細胞，誘發(fā)大鼠糖尿病后以辛伐他汀及辛伐他汀聯(lián)合自擬活血益氣方給藥。各項指標中，血糖長期持續(xù)升高是導致糖尿病病變的主要原因之一，血糖升高致使糖基化末期產(chǎn)物生成，膠原合成，心肌及血管內(nèi)皮增生，生成大量自由基，損害機體組織和細胞。血脂作為動脈粥樣硬化致病因素，有研究表明脂質(zhì)代謝異常會產(chǎn)生胰島素抵抗現(xiàn)象，其含量高低可作為檢測冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(DC)指標。糖尿病血管病變是一個慢性炎癥過程[15]，刺激內(nèi)皮細胞激活凝血系統(tǒng)，造成凝血功能紊亂，促進白細胞黏附和附壁，加速動脈粥樣硬化，促使炎癥進一步發(fā)展，加重細胞組織損傷，hs-CRP作為炎癥過程標志性因子，可有效反應患者炎癥變化情況。ICAM-1[16]作為免疫球蛋白介導巨噬細胞和單核細胞黏附血管內(nèi)皮，引起血管內(nèi)皮損傷，血小板聚集，血管通透性增加致使動脈血栓形成，加速動脈粥樣硬化，與心臟血管損害程度呈正相關。MCP-1[17]作為趨化因子，具有吸附、趨化單核因子介導單核細胞活化，誘導黏附因子表達，促使炎癥細胞病變處聚集，而這正是動脈粥樣硬化早期階段表現(xiàn)，其在動脈粥樣硬化進展中起到關鍵作用。結果顯示，各組大鼠一般情況表現(xiàn)依次為模型組<西藥組<聯(lián)合組<對照組，說明益氣活血方顯著改善大鼠一般情況，提高生存質(zhì)量；模型組、西藥組、聯(lián)合組GLU均顯著高于對照組(P<0.05)體質(zhì)量均顯著低于對照組(P<0.05)，聯(lián)合組GLU遠遠低于模型組和西藥組(P<0.05)，聯(lián)合組體質(zhì)量遠遠高于模型組和西藥組(P<0.05)，說明益氣活血方具有一定降糖、調(diào)節(jié)糖代謝、改善體質(zhì)量作用，對糖尿病機體改善更為顯著；通過血脂各項指標對比，可明顯發(fā)現(xiàn)辛伐他汀及辛伐他汀聯(lián)合自擬活血益氣方均能顯著改善TC、TG、HDL、LDL，其中TC、HDL兩者改善程度無明顯差異(P>0.05)，TG、LDL改善情況聯(lián)合組顯著優(yōu)于西藥組(P<0.05)，說明聯(lián)合治療對于DM血脂改善效果更好；模型組hs-CRP水平顯著高于西藥組、聯(lián)合組及對照組(P<0.05)，西藥組、聯(lián)合組及對照組之間hs-CRP水平無顯著差異(P>0.05)，說明西藥組、聯(lián)合組均能顯著降低炎癥反應，效果相差不大；模型組、西藥組、聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達顯著高于對照組(P<0.05)，聯(lián)合組ICAM-1及MCP-1表達顯著低于模型組、西藥組(P<0.05)，說明聯(lián)合組更顯著抑制ICAM-1及MCP-1表達，抑制DM血管病變進程，保護心臟血管。

綜上，益氣活血方可通過降糖降脂抗炎、抑制ICAM-1及MCP-1表達從而對心臟血管進行保護。