陳紅純,吳科君,李 瑞,王 婷,周 翠,馬文超,魏 虹,*

1 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715 2 攀枝花市旅游局, 攀枝花 617000

鎘(Cd,cadmium)是一種高毒性、非生物必需的致癌元素[1],在土壤中天然存在,但是由于礦山開采、廢水排放、磷肥的大量使用以及城市交通等人為活動(dòng)導(dǎo)致環(huán)境中的Cd含量明顯增加,引起嚴(yán)重的環(huán)境問題[2]。Cd進(jìn)入植物體后將引起一系列的生理和生化障礙,包括光合結(jié)構(gòu)的損傷、氧化應(yīng)激的啟動(dòng)、營養(yǎng)吸收和碳水化合物代謝紊亂等,從而導(dǎo)致植物生長受阻、生物量降低[3- 4]。環(huán)境中的Cd通過植物吸收富集進(jìn)入食物鏈后,將對(duì)人類健康造成危害[5]。因此,重金屬污染土壤的治理與修復(fù)成為近年來生態(tài)修復(fù)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。

眾多修復(fù)技術(shù)中,植物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、美觀和適用性廣等特點(diǎn),在土壤重金屬污染修復(fù)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[6]。植物修復(fù)技術(shù)(phytoremediation)是通過利用適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)的植物吸收、分解、轉(zhuǎn)化或固定土壤中的重金屬,達(dá)到降低污染物濃度,提高土壤安全性目的的重金屬污染修復(fù)技術(shù)[7]。然而,隨著研究工作的不斷深入,結(jié)果顯示土壤中重金屬的生物有效性通常較低,以及大多數(shù)重金屬超積累植物生長緩慢、生物量小,從而在很大程度上限制了重金屬污染土壤植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展[8- 9]。近年來有研究者提出,“螯合-誘導(dǎo)”植物修復(fù)技術(shù)(chelate-induced phytoremediation)的應(yīng)用將有助于克服這個(gè)障礙[10]。與合成螯合劑相比,天然低分子量有機(jī)酸(natural low molecular weight organic acids, NLMWOAs)如檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸等作為植物體重要代謝物,不僅是植物根系分泌物和微生物分泌物的重要組成,同時(shí)也是植物和動(dòng)物殘?jiān)谕寥乐蟹纸獾淖匀划a(chǎn)物,具有高降解性、低毒性的特點(diǎn),更符合環(huán)境友好性的要求[11]。有機(jī)酸可通過促進(jìn)金屬離子解吸附作用及與金屬離子形成可溶性的絡(luò)合物,增加介質(zhì)中重金屬的溶解度和生物利用度,從而加強(qiáng)植物對(duì)重金屬的吸收[12]。此外,有機(jī)酸作為植物體內(nèi)重要的金屬配位體,還將參與重金屬的吸收、運(yùn)輸、貯存和解毒等生理代謝過程[13]。研究發(fā)現(xiàn),外源有機(jī)酸如草酸、檸檬酸的加入可以緩解重金屬對(duì)植物的毒害,增加植物對(duì)重金屬脅迫的耐性,提高重金屬積累量等[14]。有機(jī)酸對(duì)重金屬活化以及植物積累重金屬的影響為植物修復(fù)技術(shù)開辟了一條新的途徑[15]。但隨目標(biāo)金屬和工程物種種類的不同,不同有機(jī)酸對(duì)植物修復(fù)的作用效果也存在較大差異[16]。

秋華柳(Salixvariegata)是楊柳科(Salicaceae)柳屬(SalixL.)多年生灌木,生長速率快,繁殖能力強(qiáng),具有較好的Cd耐性與Cd富集能力,在Cd污染土壤的植物修復(fù)工程中有廣泛的應(yīng)用前景[17- 19]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cd脅迫下,草酸、酒石酸和琥珀酸等低分子有機(jī)酸是秋華柳根系分泌物中有機(jī)酸的主要成分,對(duì)保持植株正常生理功能有重要作用[20]。聯(lián)合低分子量外源有機(jī)酸的使用,是否可進(jìn)一步促進(jìn)秋華柳的生長及其Cd積累效率？本研究通過營養(yǎng)液培養(yǎng),探究5種常見低分子量外源有機(jī)酸的添加對(duì)Cd脅迫下秋華柳的生長適應(yīng)性及Cd積累特征的影響,為推動(dòng)植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年11月7日,從重慶市嘉陵江同興街段河岸(29°41′2″N,106°26′56″E)采集一年生秋華柳實(shí)生幼苗,移栽入西南大學(xué)生態(tài)園適應(yīng)性培養(yǎng)后作為研究對(duì)象,期間采用常規(guī)田間管理,適時(shí)澆水除草。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年6月2日,選取長勢(shì)良好并一致的幼苗(株高約25 cm、基莖約4 cm)轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室,使用1/2 Hoagland改良營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)容器為18 cm(上口徑)×16 cm(高)的花盆,每盆量取1.7 L營養(yǎng)液。培養(yǎng)室晝夜溫度分別控制在25℃和20℃,每天光照16 h,光強(qiáng)為5000 lx。

預(yù)培養(yǎng)一周后隨機(jī)分組,進(jìn)行Cd和有機(jī)酸(草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸)的處理。Cd濃度為50 μmol/L,各有機(jī)酸濃度均為100 μmol/L,設(shè)置7個(gè)處理(表1)。所有處理均6個(gè)重復(fù)。其中,Cd以CdCl2·2.5H2O的水溶液加入,各有機(jī)酸均以純酸的水溶液加入,并測(cè)定各處理組培養(yǎng)液pH值。

培養(yǎng)4周后收獲并進(jìn)行分析測(cè)定,培養(yǎng)期間,保持水培箱內(nèi)24 h持續(xù)曝氣。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 溶液中金屬離子形態(tài)的分布

用化學(xué)平衡程序VISUAL MINTEQ v.3.0計(jì)算溶液中金屬離子的形態(tài)[21]。

1.4 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.4.1 生物量的測(cè)定

處理4周后將樣品采回,用超純水沖洗干凈,根部用20 mmol/L EDTA-Na2浸泡5 min后,迅速用超純水沖洗干凈。各植株樣品分為根、莖和葉3部分,分裝好后放置于通風(fēng)烘箱中80 ℃下烘干至恒重,用電子天平稱量各部分生物量。

1.4.2 植株各組分Cd含量的測(cè)定

用球磨儀對(duì)烘干的各樣品進(jìn)行粉碎后,稱取粉狀樣品0.05 g加入HNO3(6 mL)-H2O2(2 mL)消解液在微波消解儀(SpeedWave SW- 4)中進(jìn)行消解,用超純水定容至50 mL,采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES,ThermoFisher iCAP6300,UK)測(cè)定Cd含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

植株各組分Cd積累量=植株各組分生物量×相應(yīng)Cd含量。

根-地上部分Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)=地上部分Cd含量/根中Cd含量

地上部分富集系數(shù)=地上部分Cd含量/介質(zhì)中Cd含量[22]

利用SPSS 22.0軟件采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey′s多重比較分析不同有機(jī)酸處理對(duì)Cd脅迫下秋華柳生物量及Cd積累的影響差異。利用軟件Origin 8.5繪圖,Microsoft word制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液中金屬離子形態(tài)的分布

金屬離子在溶液中以游離離子或作為絡(luò)合物存在,取決于金屬配體的濃度和種類以及溶液pH[23]。在本研究中,金屬離子溶液和配體溶液以1∶2的比例在營養(yǎng)液中進(jìn)行配置,測(cè)定溶液酸堿度,Cd處理組pH值為6,各添加有機(jī)酸的處理組中,pH值明顯降低(表2)。使用VISUAL MINTEQ v.3.0預(yù)測(cè)Cd在營養(yǎng)液中的形態(tài)發(fā)現(xiàn),低濃度有機(jī)酸(100 μmol/L)處理下,只有少部分Cd與有機(jī)酸形成Cd-有機(jī)酸復(fù)合物,約5.6%的Cd2+與草酸結(jié)合,與檸檬酸、酒石酸和蘋果酸結(jié)合的Cd2+分別占1.42%、0.9%和1.62%,與琥珀酸結(jié)合的Cd2+比例最少,約為0.24%；但有機(jī)酸的加入均增加了游離Cd2+的比例,其中琥珀酸的加入使游離Cd2+得到最大提高,草酸處理對(duì)Cd2+的增加影響最小(表2)。

表2 Cd在不同有機(jī)酸溶液中的形態(tài)

括號(hào)內(nèi)的數(shù)值是不同形態(tài)Cd占總Cd含量的百分比

2.2 有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳生長的影響

圖1呈現(xiàn)了各處理下秋華柳根、莖、葉及總生物量的變化。與對(duì)照相比,Cd脅迫顯著降低秋華柳根、莖生物量及總生物量,對(duì)植株生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。

檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的加入則明顯緩解了Cd對(duì)秋華柳生長的毒害,促進(jìn)了秋華柳生物量的積累?？傮w來看,蘋果酸的添加使秋華柳生物量的促進(jìn)作用最為明顯,琥珀酸次之。草酸的添加則沒有解除Cd脅迫對(duì)植株的毒害和生長抑制,各生物量指標(biāo)均低于對(duì)照處理,與Cd處理植株生物量間沒有明顯差異。

比較各處理對(duì)秋華柳各器官生物量的影響,結(jié)果表明,外源有機(jī)酸的添加更有利于植株根、莖的生長。與Cd脅迫下秋華柳植株相比,檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的加入使根和莖生物量分別提高了61%、55%、101%、76%和56%、95%、141%、87%。

圖1 外源有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳生物量的影響Fig.1 Effects of organic acids on the biomass of S. variegata under Cd Stress不同小寫字母分別表示各處理之間有顯著差異(α=0.05)

2.3 有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳各器官Cd含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)的影響

Cd脅迫下,有機(jī)酸添加對(duì)秋華柳各器官Cd含量的影響如圖2所示。秋華柳對(duì)Cd的積累主要集中在根部,根系中Cd含量遠(yuǎn)高于莖和葉中含量。檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸和酒石酸的添加分別在不同程度促進(jìn)了秋華柳各器官Cd含量的提升,草酸的添加則對(duì)提高秋華柳各器官中Cd含量沒有顯著效果。

與Cd處理組相比,檸檬酸的加入明顯提高了秋華柳根系Cd含量,琥珀酸的加入使莖中Cd含量提高了20%；蘋果酸的加入使葉中Cd含量提高了36%；酒石酸的加入則顯著提升了秋華柳地上及地下部分Cd含量,根、莖、葉中Cd含量分別為Cd脅迫對(duì)照處理組的119%、118%和182%(圖2)。

與Cd處理組相比,秋華柳根—地上部分Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)在加入有機(jī)酸后沒有顯著變化。地上部分Cd富集系數(shù)在加入酒石酸后得到顯著提升(圖2)。

圖2 外源有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳各器官Cd含量、Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)及地上部分Cd富集系數(shù)的影響Fig.2 Effect of organic acids on content of Cd in each organ, Cd translocation coefficient and enrichment of S. variegata under Cd Stress

2.4 有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳Cd積累量的影響

綜合考慮秋華柳生物量和Cd含量,Cd環(huán)境中加入檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和蘋果酸后,秋華柳植株中Cd積累量得到顯著提升,分別是未加入有機(jī)酸Cd處理組的210%、190%、190%和178%；草酸的添加未對(duì)秋華柳植株Cd積累量產(chǎn)生顯著影響(表3)。

秋華柳各器官Cd積累量依次為根>莖>葉,大部分Cd被保留在根中。檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的添加均顯著提高了秋華柳根中Cd積累量,分別是未加入有機(jī)酸Cd處理組的222%、183%、178%、185%。檸檬酸對(duì)提高秋華柳根中Cd積累的作用最為明顯,但對(duì)于莖和葉中Cd積累量則沒有明顯的提升效果。酒石酸、琥珀酸和蘋果酸的加入則顯著促進(jìn)了秋華柳地上部分的Cd積累量。

3 討論

環(huán)境中的Cd被植物吸收后,植物體內(nèi)游離的Cd離子將通過干擾礦物吸收、植物水分關(guān)系、氧化代謝和光合作用等生理過程阻礙植物的生長[24],植物生物量可以直接指示重金屬對(duì)植物的毒害程度[25]。本研究結(jié)果表明,Cd脅迫顯著降低了秋華柳生物量,外源有機(jī)酸的添加則在不同程度上緩解了Cd對(duì)植株生長的抑制。其中,蘋果酸對(duì)秋華柳生物量積累的促進(jìn)作用最為顯著,草酸無明顯改善。

有機(jī)酸在植物對(duì)重金屬的耐受、運(yùn)輸和儲(chǔ)存以及在植物維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26]。低分子量有機(jī)酸可通過與Cd進(jìn)行螯合,改變Cd在植物體內(nèi)的賦存形態(tài),使其由高毒性的自由離子形式向低毒性的Cd-有機(jī)酸復(fù)合物形式轉(zhuǎn)化,緩解植物受到的毒害[27-28]。本研究中,檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的加入顯著緩解了Cd對(duì)秋華柳的毒害,與An等人報(bào)道的結(jié)果一致[29-30]。在低分子量有機(jī)酸對(duì)重金屬的解毒中,目前普遍認(rèn)可的機(jī)制是有機(jī)酸在細(xì)胞內(nèi)與重金屬發(fā)生絡(luò)合作用,并把重金屬隔離在液泡中從而緩解重金屬對(duì)植物的毒害[31],本研究中各有機(jī)酸的添加對(duì)緩解秋華柳Cd毒害效果的差異可能與其螯合Cd時(shí)的配體親和力有關(guān)。外源低分子量有機(jī)酸緩解重金屬對(duì)植物毒害,促進(jìn)植物生長能力的差異與其在植物生理代謝過程中所扮演的角色有密切關(guān)系。有研究表明,有機(jī)酸可通過緩解重金屬所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,維持細(xì)胞正常生理活動(dòng),減輕植物受到的毒害作用[32]。Guo等[33]發(fā)現(xiàn),Cd脅迫下,蘋果酸的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了部分抗氧化酶的活性和基因表達(dá),通過Miscanthussacchariflorus體內(nèi)酶和非酶抗氧化劑的調(diào)節(jié)來緩解Cd對(duì)植物的毒害和氧化損傷。Cd脅迫下檸檬酸的加入可通過調(diào)節(jié)植物葉片中光合色素合成和分解相關(guān)酶基因的表達(dá),增加葉片中光合色素含量,提高植物光合作用能力[34]。同時(shí),有機(jī)酸對(duì)植物營養(yǎng)代謝也有著重要意義,如Schulze等人發(fā)現(xiàn)alfalfa中蘋果酸的分泌有助于植物體對(duì)N和P等營養(yǎng)物質(zhì)的獲取,這可能也是本研究中蘋果酸處理組生物量明顯提升的原因之一[35]。本研究結(jié)果表明,草酸的添加對(duì)秋華柳生物量沒有顯著影響,可能是由于在較低pH環(huán)境下,植物pH恒穩(wěn)態(tài)遭到破壞,細(xì)胞的代謝活動(dòng)、DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂等過程受到影響[36-37]。

表3 有機(jī)酸對(duì)Cd脅迫下秋華柳Cd積累量的影響(μg平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

不同小寫字母分別表示各處理之間有顯著差異(α=0.05)

研究金屬在植物體內(nèi)的積累和遷移機(jī)制,對(duì)提高植物修復(fù)效率具有重要意義。秋華柳根部作為Cd進(jìn)入植物的主要部位,與莖和葉相比,根中Cd含量更高,是減輕植物地上組織尤其是葉片受Cd毒害的自然保護(hù)反應(yīng)[38]。檸檬酸的添加顯著提升了秋華柳根對(duì)Cd的吸收和固定能力,酒石酸、琥珀酸和蘋果酸則顯著提升了秋華柳地上部分的Cd含量。Chen等人認(rèn)為,有機(jī)酸提高植物對(duì)Cd的吸收歸因于有機(jī)酸的施加使溶液pH降低,酸性環(huán)境中H+濃度較高,金屬離子更易釋放從而增加了金屬的遷移率[39]。這與本研究中通過VISUAL MINTEQ v.3.0預(yù)測(cè)的結(jié)果一致,有機(jī)酸的加入除了形成Cd-有機(jī)酸復(fù)合物,也提高了介質(zhì)中游離Cd2+的含量。草酸處理組形成了最大濃度的Cd-有機(jī)酸復(fù)合物,而游離Cd2+含量只有較小提升,這是否是造成草酸處理組秋華柳Cd含量沒有顯著提升的主要原因還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,植物Cd含量的提升可能與有機(jī)酸絡(luò)合重金屬的能力具有更為密切的關(guān)系,如對(duì)促進(jìn)秋華柳根部Cd吸收具有顯著作用效果的檸檬酸具有成對(duì)的OH/COOH依附在兩個(gè)相鄰的碳原子上,能與重金屬形成較為穩(wěn)定的五元環(huán)狀結(jié)構(gòu)[40]。而草酸在植物體內(nèi)多以草酸鹽的形式存在,游離態(tài)的草酸與Ca等離子的優(yōu)先結(jié)合可能也是草酸處理組秋華柳體內(nèi)Cd含量沒有顯著提升的原因之一[41- 42]。植物體積累的Cd超過其所能承受的閾值后將導(dǎo)致植物代謝紊亂,乃至死亡[43]。本研究中秋華柳根中Cd濃度最高達(dá)320 mg/kg,但其生長并未受到負(fù)面影響,各器官生物量均與對(duì)照組達(dá)到相同水平。一方面體現(xiàn)出有機(jī)酸在秋華柳解Cd毒和儲(chǔ)存Cd過程中的重要性,另一方面也體現(xiàn)出秋華柳具有較強(qiáng)的Cd耐性以及在吸收富集Cd方面較好的調(diào)節(jié)能力。

大部分Cd存留于根系中,秋華柳根中Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移系數(shù)仍處于較低水平。有研究報(bào)道檸檬酸在重金屬的木質(zhì)部負(fù)載中起著重要作用,可以提高重金屬從根向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)[44- 45]。本研究結(jié)果則顯示,在檸檬酸的作用下,秋華柳將Cd固定在根中的能力被加強(qiáng),減少了Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移。酒石酸的加入顯著提升了地上部分Cd富集系數(shù),我們前期的研究也發(fā)現(xiàn),酒石酸是Cd脅迫下秋華柳根系分泌物的主要成分之一,推測(cè)酒石酸在秋華柳體內(nèi)重金屬解毒、積累、轉(zhuǎn)運(yùn)過程中都起著重要作用。

植物修復(fù)的重點(diǎn)應(yīng)該放在地上部分從土壤中去除的污染物總量上[22,46]。對(duì)秋華柳的重金屬積累量進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明,檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的加入對(duì)秋華柳Cd積累總量的提升有顯著效果。其中,檸檬酸加入后通過對(duì)秋華柳根生物量和根中Cd含量的提升,使根中Cd積累量顯著增加；酒石酸、琥珀酸和蘋果酸的應(yīng)用使秋華柳各器官中Cd積累量都得到顯著增加,有利于秋華柳對(duì)Cd污染土壤修復(fù)效率的提高。其中,蘋果酸主要通過提升秋華柳各器官生物量使其Cd積累量得到增加,酒石酸和琥珀酸對(duì)秋華柳各器官生物量和Cd含量均有所提升,酒石酸對(duì)秋華柳Cd吸收能力的促進(jìn)作用大于琥珀酸。

4 結(jié)論

(1)Cd脅迫顯著降低了秋華柳生物量,檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的添加有效緩解了Cd對(duì)秋華柳的毒害,使秋華柳生長得到顯著提高。其中,蘋果酸對(duì)秋華柳生物量積累的促進(jìn)作用最為顯著。

(2)加入有機(jī)酸后,除草酸處理組外,其余處理組中游離Cd2+含量均得到較大提升,有利于秋華柳對(duì)Cd的吸收。檸檬酸的加入提高了秋華柳根中Cd含量；琥珀酸和蘋果酸的加入分別使秋華柳莖和葉中Cd含量顯著提升；酒石酸的加入則對(duì)增加秋華柳各器官中的Cd含量均有明顯效果,地上部分富集系數(shù)也得到顯著提升。

(3)檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸的加入對(duì)秋華柳Cd積累總量的提升有顯著效果。酒石酸、琥珀酸和蘋果酸的應(yīng)用可增加秋華柳地上部分Cd積累量,可有效提高秋華柳對(duì)Cd污染土壤的修復(fù)效率。