鐘純燕　郝飛　李文良　毛立　主性　嵇辛勤　江杰元　李基棕　劉茂軍

摘要：為篩選出最佳消毒劑以降低羊舍內(nèi)空氣細(xì)菌含量，采用規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)常用的4種消毒劑進(jìn)行消毒效果試驗(yàn)，在消毒前后測(cè)定羊舍內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù)，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，不同種類的消毒劑殺菌效果有差異，其中戊二醛溶液的殺菌率為42.8%，戊二醛癸甲溴銨溶液殺菌率為58.6%，溴氯海因殺菌率為76.5%，聚維酮碘殺菌率為44.5%，因此溴氯海因殺菌效果最佳;PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果表明，羊舍內(nèi)空氣細(xì)菌主要有芽孢桿菌、葡萄球菌、志賀氏菌、不動(dòng)桿菌、奧斯陸莫拉菌、希氏腸球菌和胚芽乳桿菌等，這些細(xì)菌的16S rRNA序列與GenBank收錄的參考序列同源性達(dá)98.0%以上。本研究為規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)細(xì)菌性疾病的預(yù)防與控制提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng);消毒劑;細(xì)菌計(jì)數(shù);PCR鑒定

中圖分類號(hào)： S826.4+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0194-04

近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，羊群數(shù)量不斷增加，規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)逐漸形成。規(guī)?；B(yǎng)殖雖然降低了經(jīng)濟(jì)成本，但也因?yàn)榛夹蟮念l繁接觸、羊舍通風(fēng)不良、排泄物堆積等因素導(dǎo)致空氣中細(xì)菌濃度大大升高，這對(duì)羊群健康產(chǎn)生潛在的威脅[1-2]。王振對(duì)發(fā)病羊的病料進(jìn)行細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，主要病原菌有鏈球菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和溶血性曼氏桿菌，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示這些細(xì)菌對(duì)小白鼠致病力較強(qiáng)[3]。李奕芙研究得出，羊場(chǎng)發(fā)病死羊以綠膿桿菌的感染率最高（49.3%），且存在細(xì)菌多重感染，其中二重感染率達(dá)54.4%[4]。因此，掌握養(yǎng)羊場(chǎng)空氣中的細(xì)菌數(shù)量和種類，是預(yù)防和控制養(yǎng)羊場(chǎng)細(xì)菌性疾病的先決條件。規(guī)模羊場(chǎng)常用噴霧消毒來(lái)殺滅羊舍內(nèi)細(xì)菌，但市面上用于羊場(chǎng)細(xì)菌消毒的消毒劑種類較多，消毒效果也存在一定差異，選擇敏感性消毒劑做好環(huán)境消毒亦成為當(dāng)前凈化環(huán)境、控制疾病的主要手段[5-6]。

因此，為準(zhǔn)確掌握各種消毒劑的殺菌效果，本試驗(yàn)采用噴霧消毒法對(duì)規(guī)模羊場(chǎng)常用的4種消毒劑進(jìn)行消毒效果評(píng)估，計(jì)算消毒后的殺菌率，選擇最有效合理的消毒劑，并鑒定其中的優(yōu)勢(shì)菌落，以期為消毒劑的選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基及試劑

綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker等均購(gòu)自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2消毒藥品

試驗(yàn)使用了4種消毒劑，分別為稀戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液、溴氯海因粉和聚維酮碘溶液（表1）。[HJ1.5mm]

1.2試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2017年11月在江蘇省太倉(cāng)市某湖羊場(chǎng)進(jìn)行。

1.3采樣設(shè)計(jì)

選擇4間羊數(shù)、大小、風(fēng)向相同的羊舍，在每間羊舍內(nèi)設(shè)置6個(gè)細(xì)菌采集點(diǎn)，1個(gè)采集點(diǎn)放置2個(gè)綿羊鮮血瓊脂平皿，每間羊舍中間設(shè)有過(guò)道，分別在過(guò)道三等分處按圖1所示設(shè)置6個(gè)采集點(diǎn)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1空氣中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18024.1—2000《公共場(chǎng)所空氣微生物檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測(cè)定》收集羊舍內(nèi)空氣中的細(xì)菌[7]。消毒前后1 h對(duì)空氣中的細(xì)菌進(jìn)行收集，將綿羊鮮血瓊脂平皿開蓋放置于羊舍內(nèi)離地面1.5 m的6個(gè)采集點(diǎn)上，暴露于空氣中10 min后，蓋好平皿蓋，標(biāo)注采集地點(diǎn)、日期及編號(hào)，冷藏快速送往實(shí)驗(yàn)室置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。對(duì)平皿上的細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每平皿菌落數(shù)（CFU/m3）報(bào)告結(jié)果。

1.4.2消毒劑殺菌試驗(yàn)

將戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液、溴氯海因、聚維酮碘4種消毒劑按說(shuō)明書上的最適殺菌濃度進(jìn)行稀釋，每種消毒液噴灑消毒1間羊舍，消毒后1 h，利用自然沉降法收集羊舍內(nèi)空氣中的細(xì)菌，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算消毒后的細(xì)菌含量和殺菌率[8]。殺菌率=（消毒前菌數(shù)-消毒后菌數(shù)）/消毒前菌數(shù)×100%，從6個(gè)細(xì)菌采集點(diǎn)的殺菌率求出每種消毒劑的平均殺菌率。

1.4.3優(yōu)勢(shì)細(xì)菌鑒定

參照丁燕霞等設(shè)計(jì)的細(xì)菌16S rRNA引物[9]（P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為1 400 bp。選取優(yōu)勢(shì)菌落制備細(xì)菌染色體DNA模板，PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DNA模板2.0 μL，引物P1、P2各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，無(wú)菌水17.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。將目的片段切膠回收，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定正確后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

2結(jié)果與分析

2.1羊場(chǎng)舍內(nèi)空氣細(xì)菌菌落總數(shù)

羊舍內(nèi)空氣中采集到的細(xì)菌經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，按奧氏公式[10]計(jì)算菌落總數(shù)：C=50 000N/AT。C表示菌落總數(shù)，CFU/m3;N表示每皿菌落數(shù)，個(gè);A表示培養(yǎng)皿面積，cm2;T表示采樣時(shí)間，min。所得菌落總數(shù)見(jiàn)表2。

2.2消毒劑殺菌試驗(yàn)

對(duì)4間羊舍分別使用4種消毒劑進(jìn)行噴灑消毒，因消毒劑的種類不同，消毒效果也不同，4種消毒劑的殺菌率見(jiàn)表3，其中以溴氯海因殺菌效果最好。

2.3優(yōu)勢(shì)細(xì)菌鑒定

2.3.1PCR鑒定結(jié)果

將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，得到大小約1 400 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。測(cè)序獲取核酸序列，BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，主要優(yōu)勢(shì)菌包括芽孢桿菌屬（枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、土地芽孢桿菌和類芽孢桿菌）、葡萄球菌屬（產(chǎn)色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和金黃色葡萄球菌）、不動(dòng)桿菌屬（不動(dòng)桿菌和魯氏不動(dòng)桿菌）、腸球菌（希氏腸球菌和屎腸球菌）、痢疾志賀氏菌、大腸桿菌、奧斯陸莫拉菌、胚芽乳桿菌等。

2.3.2遺傳進(jìn)化分析

將獲取的核酸序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，痢疾志賀氏菌、奧斯陸莫拉菌、不動(dòng)桿菌、屎腸球菌、胚芽乳桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌與GenBank中收錄的菌株16S rRNA同源性均達(dá)98%以上。用MEGA 5.0繪制遺傳進(jìn)化樹得出，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、胚芽乳桿菌和奧斯陸莫拉菌與GenBank中的參考序列遺傳距離均較遠(yuǎn);痢疾志賀氏菌與HQ759185.1、KY789442、EU009185.1、KX162657.1等11株菌序列親緣關(guān)系最近;屎腸球菌與KT261031.1、KT261082.1親緣關(guān)系最近;枯草芽孢桿菌與CP024649、CP017682、AP018349.1、AP017891.1親緣關(guān)系最近，共同組成一組微小分支（圖3）。

3討論與結(jié)論

規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)疫病往往是在多種因素誘導(dǎo)下發(fā)生的，包括外界病原菌入侵或動(dòng)物機(jī)體內(nèi)細(xì)菌增殖紊亂等因素造成[11]。因此，對(duì)羊舍空氣進(jìn)行消毒是減少環(huán)境中的病原菌、消滅傳染源、預(yù)防和控制羊群疾病的發(fā)生的重要措施。目前，消毒劑的種類繁多，消毒效果各異，在實(shí)際使用過(guò)程中存在選擇不當(dāng)造成效果不佳、疫病控制不力等問(wèn)題。本試驗(yàn)對(duì)消毒劑殺菌能力進(jìn)行比較分析，可篩選適用于規(guī)模化養(yǎng)羊場(chǎng)消毒使用的消毒劑。結(jié)果表明，通過(guò)測(cè)定消毒前后羊舍內(nèi)空氣細(xì)菌數(shù)量，4種消毒劑均有較好的消毒效果，其中溴氯海因殺菌效果最佳，殺菌率能達(dá)到76.5%，戊二醛癸甲溴銨次之，殺菌率為 58.6%，戊二醛殺菌率為42.8%，聚維酮碘消毒能力最弱，殺菌率為44.5%。鹵素類消毒劑的殺菌效果具有廣譜、高效、廉價(jià)等特點(diǎn)，是當(dāng)前養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的消毒劑，其中氯的殺菌力最強(qiáng)，對(duì)皮膚和黏膜有刺激作用，廣用于飲水消毒和廄舍、場(chǎng)地、車輛、排泄物等的消毒;碘殺菌能力稍弱，刺激性較小，一般用于皮膚消毒和創(chuàng)面消毒[12-13]。本研究使用的溴氯海因溶于水后可形成次溴酸和次氯酸，推測(cè)混合型消毒劑的消毒效果較好;多重組分的消毒劑戊二醛癸甲溴銨的殺菌效果也強(qiáng)于單一組份的消毒劑戊二醛。

空氣中的致病菌可能通過(guò)微生物氣溶膠的形式污染飲水槽或進(jìn)入羊呼吸道引起感染，甚至污染羊場(chǎng)周圍環(huán)境，威脅公共衛(wèi)生安全[14]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行PCR鑒定發(fā)現(xiàn)，該羊場(chǎng)存在一定數(shù)量的致病菌，其中痢疾志賀氏菌可感染幼羊?qū)е赂篂a，從而引起大批發(fā)病和死亡;金黃色葡萄球菌常引發(fā)滲出性皮炎、乳房炎、拉稀、關(guān)節(jié)腫大和膿腫等，說(shuō)明獸醫(yī)人員應(yīng)制定健全的衛(wèi)生管理制度，做好環(huán)境消毒和免疫接種[15]。大腸桿菌是危害養(yǎng)羊生產(chǎn)的常見(jiàn)條件致病菌，在臨床檢測(cè)中分離率較高，耐藥性也較強(qiáng)[16-17]。惠艷華等、陸桂平等和王磊等在上海、江蘇和青海地區(qū)均檢測(cè)到大腸桿菌病的發(fā)生[18-20]。顏艾等對(duì)貴州省發(fā)病羊進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染率較高，且檢出大腸桿菌和支原體混合感染[21]。本試驗(yàn)羊場(chǎng)的空氣中存在大腸桿菌，推測(cè)該細(xì)菌來(lái)源于羊群糞便和污水，因此羊場(chǎng)工作人員應(yīng)加強(qiáng)糞便和污水的清理及無(wú)害化處理，防止大腸桿菌病的發(fā)生。本試驗(yàn)在羊舍空氣中檢測(cè)到枯草芽孢桿菌和屎腸球菌，近期研究表明這些細(xì)菌可作為日糧添加以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[22-23]，但其在羊舍空氣環(huán)境中存在是否會(huì)對(duì)羊群健康造成影響，有待進(jìn)一步探究。

以上結(jié)果表明，規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)羊舍空氣中細(xì)菌含量較高，種類繁多，且存在一些致病菌和條件致病菌。4種常見(jiàn)消毒劑殺菌效果均較好，其中以溴氯海因的消毒能力最佳，可在規(guī)模羊場(chǎng)推廣應(yīng)用。

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