朱 捷，馬桂娟，張 瑤，湯麗華

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，銀川 750004)

枸杞籽為枸杞深加工的副產(chǎn)品，含有豐富的生物活性物質(zhì)，其含油量為18%～22%，利用現(xiàn)代化萃取技術(shù)得到的枸杞籽油有效地保留了枸杞的多種功能成分，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。但目前關(guān)于枸杞籽油中多環(huán)芳烴檢測的研究較少，多集中于大豆油、菜籽油、花生油、橄欖油、玉米油等食用油脂[1-6]。

多環(huán)芳烴(PAHs)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的一類中性或非極性有機(jī)化合物，其中的某些物質(zhì)具有致突變性和致癌性[4]。國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017中僅對(duì)苯并[a]芘作出了規(guī)定，其限量為10 μg/kg，歐盟對(duì)食用油脂中苯并[a]芘的限量為 2 μg/kg，還對(duì)4種PAHs(苯并[a]蒽、、苯并[a]熒蒽和苯并[a]芘)的總量作出了規(guī)定，不得超過10 μg/kg[5]。由于植物油中基質(zhì)復(fù)雜，多環(huán)芳烴的檢測相對(duì)比較困難，目前的研究多數(shù)采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)和氣相色譜單四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測植物油中的多環(huán)芳烴[3,6-9]。但HPLC-FLD線性范圍較窄，且不能在同一波長下同時(shí)檢測多種多環(huán)芳烴。氣相色譜單四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀雖然可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)快速檢測多種多環(huán)芳烴，由于單四級(jí)桿只能實(shí)現(xiàn)選擇離子監(jiān)測方式(SIM)，而這種方式會(huì)造成基質(zhì)影響較大以及目標(biāo)物分離不完全的情況。如何高效準(zhǔn)確地對(duì)植物油中多環(huán)芳烴進(jìn)行檢測成為了目前研究的方向。

在檢測食品中多環(huán)芳烴的殘留時(shí)往往需要較為煩瑣的前處理[10-15]。QuEChERS是快速(Quick)、簡便(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的樣品處理技術(shù)的縮寫，現(xiàn)已被廣泛使用[14]。本文參考QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品前處理并結(jié)合氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS/MS)分析法測定保健食品枸杞籽油中16種多環(huán)芳烴，探討其可行性，為枸杞籽油產(chǎn)品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的起草提供一定的技術(shù)支撐，對(duì)食品安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

枸杞籽油膠丸，市售；16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品(200 μg/mL，1.0 mL)，北京曼哈格生物技術(shù)公司；乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，美國安捷倫科技公司；C18固相萃取填料，美國安捷倫科技公司；硅膠填料，迪馬科技有限公司；食用油中苯并[a]芘質(zhì)控樣(QC-CO-702)，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院分析測試中心。吸附填料使用前均需用乙腈浸泡處理，烘干備用。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8040氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；高速低溫離心機(jī)，德國Sigma公司；全自動(dòng)樣品濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；渦旋混勻器，德國IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

稱取枸杞籽油0.5 g于用乙腈浸泡過的10 mL玻璃管中，加入3.0 mL乙腈，渦旋1 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)該步驟再次提取，合并2次上清液，35℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL。加入200 mg PSA及100 mg C18凈化，渦旋1 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液供氣質(zhì)聯(lián)用儀測定。

1.2.2 GC-MS/MS分析

色譜條件：HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度300℃；不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；程序升溫為初始溫度90℃，以20℃/min升至220℃，再以5℃/min升至320℃，保持2 min；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

建設(shè)單位向生產(chǎn)廠家派駐監(jiān)造工程師，對(duì)原材料、生產(chǎn)過程、成品檢驗(yàn)進(jìn)行全過程監(jiān)造。未經(jīng)監(jiān)造工程師簽字，原材料不得使用，產(chǎn)品不得交付。監(jiān)造工程師與建設(shè)、質(zhì)量監(jiān)督、檢驗(yàn)等單位密切配合，從源頭上嚴(yán)格控制生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)質(zhì)量。

質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃；電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間2.7 min；四級(jí)桿溫度150℃；掃描方式為多反應(yīng)檢測掃描(MRM)方式。16種多環(huán)芳烴保留時(shí)間及特征離子對(duì)如表1 所示。

表1 16種多環(huán)芳烴保留時(shí)間和特征離子對(duì)

1.2.3 溶液配制

16種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品先用乙腈稀釋至2 μg/mL，再分別用基質(zhì)提取液配制成1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 16種多環(huán)芳烴的分離情況

以枸杞籽油為基質(zhì)，加標(biāo)40 μg/kg，當(dāng)采用選擇離子監(jiān)測方式(SIM)時(shí)干擾較大，本文采用多反應(yīng)檢測掃描(MRM)方式，檢測結(jié)果如圖1所示。

注：1.萘； 2.苊烯； 3.苊； 4.芴； 5.菲； 6.蒽； 7.熒蒽； 8.芘； 9.苯并[a]蒽； 10.； 11.苯并[b]熒蒽； 12.苯并[k]熒蒽； 13.苯并[a]芘； 14.茚并[1，2，3-c，d]芘； 15.二苯并[a，h]蒽； 16.苯并[g，h，i]芘。

圖1 樣品中添加16種多環(huán)芳烴的MRM圖

由圖1可以看出，采用MRM方式分析時(shí)基線穩(wěn)定，16種多環(huán)芳烴可基本分離，基質(zhì)干擾非常小，能夠滿足檢測要求。

2.2 不同種類的吸附劑對(duì)回收率的影響

枸杞籽油中含有微量的水，大量的脂肪、有機(jī)酸、芳香烴類物質(zhì)，目前較多研究中采用弗羅里硅土固相萃取柱、硅膠固相萃取柱以及C18固相萃取柱進(jìn)行凈化[16-18]，此步驟較為耗時(shí)。PSA可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用，可以有效去除脂肪酸、有機(jī)酸和一些極性色素及糖。C18的官能團(tuán)含碳量10%，具有疏水作用，對(duì)中性、非極性的組分有吸附作用，如芳香油、脂溶性維生素。硅膠填料具有很強(qiáng)的吸附力，可以去除水、色素等物質(zhì)。本文參考GB 5009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》以及市售QuEChERS試劑盒中凈化材料的種類及用量(100 mg PSA、100 mg C18及100 mg硅膠)，通過對(duì)枸杞籽油樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)，研究了3種常用吸附劑組合對(duì)多環(huán)芳烴回收率的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同吸附劑組合對(duì)多環(huán)芳烴回收率的影響 %

由表2可以看出，采用PSA及C18凈化后16種多環(huán)芳烴的回收率在63.2%～109.3%之間，而用PSA及硅膠凈化后蒽、熒蒽、芘、、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽回收率在60%～110%之間，但萘、苊烯、苊、芴、菲等的回收率僅為30%左右，這可能是由于硅膠會(huì)吸附萘、苊烯、苊、芴、菲等相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)。用C18及硅膠凈化后多環(huán)芳烴的回收率明顯降低，大部分在60%以下，這可能是由于凈化不完全導(dǎo)致其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物造成影響。所以本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理中使用PSA與C18的組合方式進(jìn)行凈化。另外，對(duì)PSA及C18的用量進(jìn)行了優(yōu)化，將PSA的用量由100 mg增加到200 mg后，凈化后的樣品顏色較優(yōu)化前澄清，16種多環(huán)芳烴的回收率較優(yōu)化前明顯提高，這可能是由于PSA的增加吸附了更多的色素及脂肪類物質(zhì)，使得多環(huán)芳烴的回收率提高，所以本文采用200 mg PSA與100 mg C18的組合方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 提取次數(shù)及乙腈體積對(duì)回收率的影響

在對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，分別研究了3、5 mL以及10 mL乙腈進(jìn)行提取，結(jié)果表明采用大體積乙腈進(jìn)行提取時(shí)，僅有萘、苊烯、苊等少部分多環(huán)芳烴的回收率較高，其余物質(zhì)的回收率變化不顯著，同時(shí)采用大量的乙腈也增加了吸附材料的使用量以及氮吹的時(shí)間，造成資源的浪費(fèi)，所以采用3 mL乙腈為宜。對(duì)乙腈提取1次、2次以及3次時(shí)多環(huán)芳烴回收率進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。

表3 不同提取次數(shù)對(duì)多環(huán)芳烴回收率的影響 %

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍及回收率

本研究采用外標(biāo)法定量，以各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，各化合物響應(yīng)值的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中采用直接向陰性枸杞籽油樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式進(jìn)行檢測，且添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，其中添加的低質(zhì)量濃度水平為40 μg/kg，高質(zhì)量濃度水平為200 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)及加標(biāo)回收率見表4。由表4可以看出，16種多環(huán)芳烴在1～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998，添加低、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后16種多環(huán)芳烴的回收率在60.04%～119.00%之間，回收率的RSD為2.92%～13.03%。各目標(biāo)化合物峰面積的RSD為0.6%～5.5%(n=6)，說明該方法重現(xiàn)性好。滿足GB/T 27404—2008的要求。

表4 16 種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及加標(biāo)回收率(n=6)

2.4.2 檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

孟繁磊等[19]采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值的方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)情況，若比值在0.85～1.15之間認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯，本文參考其方法進(jìn)行比較。用空白樣品為基質(zhì)，添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)品后測定，以信噪比(S/N)≥3 確定方法的檢出限(LOD) ，以信噪比(S/N)≥10確定方法的定量限(LOQ)，16種多環(huán)芳烴的檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)見表5。

表5 16種多環(huán)芳烴的檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)

由表5可知，16種多環(huán)芳烴的基質(zhì)效應(yīng)在85.1%～114.2%之間，可以認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。用外標(biāo)法定量測定，16種多環(huán)芳烴的檢出限在0.2～3.5 μg/kg之間，定量限在0.7～11.5 μg/kg之間。

2.5 質(zhì)量控制措施

本研究使用的玻璃器皿在使用之前均使用乙腈浸泡24 h后烘干，以消除玻璃器皿中多環(huán)芳烴類物質(zhì)的污染。PSA及C18使用之前分別稱取10 g，加入30 mL乙腈超聲30 min，棄去上清液，重復(fù)該步驟3次，吸附填料經(jīng)烘干后備用。這樣可以有效減少外源多環(huán)芳烴的污染。

本研究還發(fā)現(xiàn)，樣品提取后于35℃氮吹近干的過程中氮?dú)饬髁窟^大會(huì)導(dǎo)致4種多環(huán)芳烴(萘、苊烯、苊、芴)的回收率偏低，而對(duì)其余的12種多環(huán)芳烴影響較小，其中萘、苊烯、苊、芴的回收率僅為正常值的50%左右。這可能是由于萘、苊烯、苊、芴的熔點(diǎn)較低，且易揮發(fā)，如果氮?dú)饬髁窟^大，粘在管壁上的物質(zhì)會(huì)被氣流吹出，導(dǎo)致回收率下降。所以在氮吹時(shí)應(yīng)注意控制氣流。同時(shí)在氮吹時(shí)也應(yīng)注意氮吹溫度，當(dāng)?shù)禍囟仍?0～55℃時(shí)管中殘?jiān)鼤?huì)緊緊吸附在管壁上不易復(fù)溶，造成萘、苊烯、二苯并[a,h]蒽等物質(zhì)回收率偏低，這可能是由于油性物質(zhì)包裹多環(huán)芳烴吸附在管壁上引起的。

2.6 質(zhì)控樣品的檢測

本研究中除了進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)外還將購買的苯并[a]芘質(zhì)控樣以及歷年檢測中發(fā)現(xiàn)的苯并[a]芘超標(biāo)的枸杞籽油作為普通樣品進(jìn)行檢測，測得該質(zhì)控樣中苯并[a]芘的含量為10.7 μg/kg，在質(zhì)控樣的參考范圍值(11.3±1.3)μg/kg之內(nèi)。苯并[a]芘超標(biāo)的枸杞籽油復(fù)測結(jié)果的平均偏差在1.9%～3.2%之間。說明該法可靠有效。

2.7 QuEChERS前處理的優(yōu)勢

GB 5009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》中關(guān)于油脂含量較高的樣品的前處理采用乙腈提取，正己烷復(fù)溶，弗羅里硅土固相萃取柱凈化，正己烷-二氯甲烷洗脫，乙腈定容等過程，平均處理一個(gè)樣品需用1.5～2 h，且成本較高、毒害較大，同時(shí)萘、苊烯、苊、芴、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘的回收率僅為30%～40%，其余多環(huán)芳烴類物質(zhì)的回收率在92%～107%之間。采用本文中QuEChERS前處理，平均處理一個(gè)樣品用時(shí)0.5 h左右，省時(shí)省力，16種多環(huán)芳烴的回收率在60.04%～119.00%之間，回收率較高。

3 結(jié) 論

建立了同時(shí)檢測保健食品枸杞籽油中16 種多環(huán)芳烴的QuEChERS/GC-MS/MS方法。采用含200 mg PSA和100 mg C18吸附填料粉進(jìn)行凈化，凈化后采用GC-MS/MS進(jìn)行分析測定。在優(yōu)化條件下，16種多環(huán)芳烴分離度良好，在1.0～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。通過QuEChERS的樣品前處理方法能獲得較高的回收率，其回收率在60.04%～119.00%之間，回收率的RSD為2.92%～13.03%;方法的檢出限在0.2～3.5 μg/kg之間，定量限在0.7～11.5 μg/kg之間。該法可顯著降低實(shí)驗(yàn)成本，且降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)者及環(huán)境的污染風(fēng)險(xiǎn)；采用MRM方式顯著提高了檢測的準(zhǔn)確性和選擇性，有效地排除了干擾；該方法經(jīng)濟(jì)、可靠，并且簡單、快速，能夠滿足保健食品枸杞籽油中多環(huán)芳烴在日常檢測中的要求。