鞠玲燕,李兆杰*,宋衛(wèi)得,徐成鋼,崔 嘉

(1.威海海關，山東 威海 264205；2.日照海關，山東 日照 276800)

氧化型染發(fā)劑因效果好且顏色持久被廣泛應用，但這類染發(fā)劑含有芳香胺類和酚類染料成分，這些組分長期使用具有不同程度的致癌、致畸和致敏性[1-3]。鑒于氧化型染發(fā)劑的安全性問題，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》明確規(guī)定了染發(fā)劑中禁限用染料組分的類別及其使用限量，并發(fā)布了高效液相色譜法用于分析對苯二胺等32種染料，加強染發(fā)劑中染料成分安全性的監(jiān)測。文獻中也建立了其他檢測方法，但是這些方法存在一些不足，如采用液相色譜法[4-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]所覆蓋的染料種類有限，涉及多種染料成分時往往需多個檢測系統(tǒng)，且對復雜基質(zhì)的抗干擾能力不足；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-15]雖具有分離度高、特異性強等優(yōu)點，但因其反應模式的限制，無法同時在正負離子模式下檢測，檢測時需建立正負兩個檢測系統(tǒng)，且質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程比較繁瑣。本研究克服以上方法的不足，以苯二胺等32種禁限用染料為對象，建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時測定染發(fā)劑中多種染料成分的快速篩查和定量分析方法。本方法通過正負離子同時掃描模式，僅需一個系統(tǒng)即可實現(xiàn)32種染料組分的有效分離，18 min內(nèi)完成檢測；直接采用一級母離子精確質(zhì)量數(shù)獲得定性和定量結(jié)果，且無需優(yōu)化碰撞能，質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程也大大簡化；利用梯度碰撞能自動觸發(fā)獲得的豐富的二級碎片離子對定性結(jié)果進行確證，避免了假陽性出現(xiàn)的幾率，提高了定性的準確性。該方法方便、快捷、高通量、靈敏度高、特異性好，可同時對染發(fā)劑中多種染料成分進行測定，保證染發(fā)劑質(zhì)量安全。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(美國ThermoFisher公司)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(日立公司)。

32種染料成分標準品純度均>95%;間苯二酚、甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、對苯二胺、對氨基苯酚、間氨基苯酚、4-氯間苯二酚、鄰苯二胺、鄰氨基苯酚、2-硝基對苯二胺、甲苯-3，4-二胺、N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺鹽酸鹽、對苯二酚、2，6-二氨基吡啶、N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽、1-萘酚購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；2-氨基-3-羥基吡啶、4-氨基-2-羥基甲苯、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽、2-氯對苯二胺硫酸鹽、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、4-硝基鄰苯二胺、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、6-羥基吲哚、N-苯基對苯二胺、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚購自上海安譜公司；2-甲基間苯二酚、6-氨基間甲酚、4-氨基間甲酚購自德國CNW公司；間苯二胺購自美國Accustandard公司。甲醇(色譜純，美國默克公司)；正己烷、乙酸銨(色譜純，德國CNW公司)；抗壞血酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

標準儲備液：甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和2-氯對苯二胺硫酸鹽采用2 g/L抗壞血酸水溶液配制；2-硝基對苯二胺、甲苯-3，4-二胺采用甲醇配制，其余染料均采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)配制；標準工作液采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)配制，儲存于4 ℃冰箱于2 d內(nèi)使用。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A為甲醇，B為5 mmol/L的乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～6 min，10%～50% A；6～12 min，50%～80% A；12～14 min，80% A；14～15 min，80%～10% A；16～18 min，10% A；總分析時間：18 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件噴霧電壓：正離子模式3.5 kV，負離子模式3.0 kV；離子源溫度：350 ℃；金屬毛細管溫度：320 ℃；鞘氣壓力：35 arb；輔助氣壓力：15 arb；掃描范圍(m/z)：50～750 Da；一級質(zhì)譜全掃描(Full scan)分辨率：R=70 000；AGC target：3e6；最大注入時間：100 ms；數(shù)據(jù)依賴二級離子全掃描(Full MS/ddMS2)分辨率：R=17 500；歸一化碰撞能：20、45、70 eV；AGC target：e5；最大注入時間：50 ms；動態(tài)排除：10 s。32種染料的質(zhì)譜信息見表1。

1.3 樣品前處理

氧化型染發(fā)劑一般包括染發(fā)組分(1劑或A劑)和顯色組分(2劑和B劑)兩劑，檢測時準確稱取1劑或A劑染發(fā)劑、染發(fā)霜或染發(fā)焗油等染發(fā)組分0.25 g(精確至0.000 1 g)至50 mL離心管中，加入25 mL甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(體積比50∶50)，渦旋1 min，超聲提取15 min，取3 mL提取液，加入3 mL正己烷，渦旋1 min，以8 000 r/min離心5 min，移取下層清液過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。根據(jù)樣品中染料含量，檢測時可取處理后的樣品溶液適當稀釋至所需的質(zhì)量濃度。

表1 32種染料組分的CAS號、分子式、離子類型、保留時間和精確質(zhì)量數(shù)Table 1 CAS no.,molecular formula,ion formation,retention time and theoretical accurate mass of the 32 dyes

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取溶劑的選擇由于氧化型染發(fā)劑中很多染料組分易氧化，因此在配制標準溶液和提取過程中加入抗壞血酸來提高其穩(wěn)定性；另外，因染料性質(zhì)不同，一些染料成分在極性溶劑中具有較好的溶解性，而個別染料成分(如甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和2-氯對苯二胺硫酸鹽等)在水中具有較好的溶解性。因此，實驗考察了甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)、乙腈-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)和乙醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)為提取試劑時待測物的提取效率和提取體系的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，以乙腈-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽均出現(xiàn)了溶劑效應；以乙醇-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽和2-氨基-3羥基吡啶峰形不佳，溶劑效應嚴重；而采甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液提取時32種染料的色譜峰形均較好(圖1)，不存在嚴重的溶劑效應，完全滿足實驗要求。因此，實驗采用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)為提取溶劑。

圖1 32種染料組分的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 32 dyes the peak 1-32 were as same as those in Table 1

2.1.2 凈化溶劑的選擇氧化型染發(fā)劑在配方中會添加較多油脂類物質(zhì)，直接采用極性溶劑超聲的樣品前處理方法，較難去除樣品中的油脂類物質(zhì)，還會降低色譜柱的使用壽命及質(zhì)譜響應。因此，本實驗利用常見弱極性溶劑正己烷除去樣品基質(zhì)中的油脂類物質(zhì)，以達到凈化樣品的目的。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)超高效色譜柱和普通的C18色譜柱對待測物的分析效果。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)液相色譜法相比，超高效色譜柱對各待測物分離效果好，可在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)32種染料成分中7對同分異構(gòu)體(間苯二酚和對苯二酚；甲苯-3，4-甲苯-2，5-二胺硫酸鹽和甲苯3，4-二胺；對苯二胺、間苯二胺和鄰苯二胺；對氨基苯酚、間氨基苯酚和鄰苯二胺；4-氨基間甲酚、對甲基氨基苯酚硫酸鹽、4氨基-2-羥基甲苯和6氨基間甲酚；2-硝基對苯二胺和4-硝基鄰苯二胺；2，7-萘二酚和1，5-萘二酚)的良好分離，顯著提高了同分異構(gòu)體目標物定性和定量分析的準確性。另外，不同流動相對分析結(jié)果的影響顯示，有機相采用甲醇的分離效果和信號強度優(yōu)于乙腈，且當流動相中加入5 mmol/L乙酸銨后，可兼顧正負離子模式的各種染料組分的信號強度，故采用甲醇-5 mmol/L的乙酸銨作為流動相。優(yōu)化后的色譜條件見“1.2.1”所述，各染料組分在18 min內(nèi)獲得較好的分離效果和較理想的峰形。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用高分辨質(zhì)譜的一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描方式，對目標檢測物進行定性篩查和確證。為了兼顧所有待測物，采用正負離子切換方式同時進行分析，檢測時無需采用多個檢測系統(tǒng)多次檢測，縮短了檢測時間。在正負離子模式下分別提取32種染料組分的一級母離子精確質(zhì)量數(shù)，發(fā)現(xiàn)間苯二酚、4-氯間苯二酚、2-甲基間苯二酚、4-氨基-3-硝基苯酚、對苯二酚、2，7-萘二酚、1，5-萘二酚、1-萘酚8種染料組分在負離子模式下響應強度高，離子干擾少，其母離子均為[M-H]-；而其他染料組分在正離子模式下響應強度高。在正離子模式的染料組分中，甲苯-2，5-二胺硫酸鹽、N，N-雙(2-羥乙基)對苯二胺硫酸鹽、2-氯對苯二胺硫酸鹽、對甲基氨基苯酚硫酸鹽和N，N-二乙基對苯二胺硫酸鹽的母離子均為[M-H2SO4+H]+；2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽母離子為[M-2HCl+H]+；N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺鹽酸鹽的母離子為[M-HCl+H]+，其余均為[M+H]+。通過正負離子切換全掃描模式確定目標物離子類型、母離子的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間(見表1)。使用高分辨質(zhì)譜檢測目標化合物的精確質(zhì)量數(shù)對于同時準確定性和定量非常重要，因此必須保證質(zhì)譜數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量準確度。表2列出的32種目標物的母離子質(zhì)量準確度誤差均小于10 ppm，可見檢測物的質(zhì)量準確度均很好，可滿足定性定量需求。

通過全掃描獲得目標化合物母離子精確質(zhì)量數(shù)，根據(jù)獲得的精確質(zhì)量數(shù)設定目標物列表，僅在一級質(zhì)譜掃描時發(fā)現(xiàn)列表中的母離子，且其強度達到設定閥值時，即自動進行二級質(zhì)譜掃描。設定高、中、低3個碰撞能量(20、45、70 eV)對目標物進行碰撞，最終加和獲得豐富的二級碎片離子(見表2)。分析結(jié)果既有母離子的精確質(zhì)量數(shù)，又有二級碎片離子信息，提高了定性的準確性，顯著降低了假陽性出現(xiàn)的幾率。此外，高分辨質(zhì)譜以母離子作為定量離子，且直接采用梯度設置碰撞能，簡化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，節(jié)省了樣品分析前的準備時間，更利于樣品的快速篩查和定量分析。

表2 32種染料組分的質(zhì)量準確度誤差和碎片離子Table 2 Mass accuracy error and fragment ions of the 32 dyes

(續(xù)表2)

No.CompoundTheoreticalaccuratemass(m/z)Measuredaccuratemass(m/z)Massaccuracyerror(ppm)Fragmentions(m/z)132-Aminophenol110.06004110.060070.2792.04948,83.04914142-Nitro-1,4-phenylenediaine154.06110154.06099-0.71119.04780,108.06820153,4-Diaminotoluene123.09167123.091901.87106.06513,79.05423162-Methylresorcinol123.04515123.04476-3.1795.01385,79.05532176-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45106.06513,79.0542318Edaravone175.08659175.08614-2.57133.07602,106.06513194-N,N-Diethyl-2-methyl-p-phenylenediaminemonohydrochloride179.15428179.15398-1.67151.12298,136.09950204-Amino-3-nitrophenol153.03057153.02934-8.04122.02475,78.0349221m-Phenylenediamine109.07602109.076141.1093.04472,80.0494822Hydroquinone109.02950109.02891-5.4165.03967,67.01894234-Amino-m-cresol124.07569124.075871.45109.05222,79.05423244-Methylaminophenolsulfate124.07569124.075891.61109.05222,80.04948254-Nitro-o-phenylenediamine154.06110154.06100-0.65137.05836,108.06820262,6-Diaminopyridine110.07127110.071300.2793.04472,66.0338327N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate165.13863165.13817-2.79136.09950,121.07602286-Hydroxyindole134.06004134.05975-2.16107.04914,92.04948292,7-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04442-4.59115.05532,131.05024304-Aminodiphenylamine185.10732185.107450.7093.05840,108.08187311,5-Dihydroxynaphthalene159.04515159.04445-4.40130.04241,103.05532321-Naphthol143.05024143.04951-5.10115.05532,79.01894

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍與檢出限用甲醇-2 g/L抗壞血酸水溶液(50∶50)配制32種染料的混合標準系列溶液，在優(yōu)化條件下測定，以染料的色譜峰面積(Y)為縱坐標，對應質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。采用向空白樣品中逐級降低加標濃度至儀器能夠定量檢出的最低加標濃度為方法定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，32種染料組分在相應的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)不低于0.997 2，LOQ為0.2～40 μg/g，可滿足檢測要求(表3)。該方法較《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年)》中收錄的液相色譜法靈敏度和特異性更好，能對染發(fā)劑中的染料成分進行更好的監(jiān)測。

表3 32種染料組分的線性范圍、相關系數(shù)、定量下限、平均回收率和相對標準偏差(RSD,n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficients,LOQs,average recoveries and the relative standard deviations(n=6) of the 32 dyes

(續(xù)表3)

No.CompoundLinearrange(μg/L)r2LOQ(μg/g)Spiked(μg/g)Averagerecovery(%)RSD(%)204-Amino-3-nitrophenol100～40000.99801010,50,10099.6,94.0,98.36.9,7.5,5.221m-Phenylenediamine4～10000.99930.40.4,2.0,4.089.1,90.3,95.59.2,8.7,7.822Hydroquinone400～40000.99954040,200,400108,99.4,1059.6,7.6,8.8234-Amino-m-cresol10～10000.99991.01.0,5.0,1093.1,88.3,95.97.8,9.2,6.5244-Methylaminophenolsulfate2～4000.99970.20.2,1.0,2.085.4,89.5,90.49.3,9.1,7.8254-Nitro-o-phenylenediamine40～20000.99734.04.0,20,4092.5,97.4,1008.2,7.4,5.2262,6-Diaminopyridine2～4000.99860.20.2,1.0,2.088.4,96.9,1029.9,8.0,8.127N,N-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate4～10000.99930.40.4,2.0,4.098.6,108,99.37.3,7.9,6.0286-Hydroxyindole100～40000.99811010,50,10099.2,104,99.07.1,6.5,5.3292,7-Dihydroxynaphthalene40～20000.99814.04.0,20,40105,101,1088.9,7.5,4.8304-Aminodiphenylamine2～4000.99880.20.2,1.0,2.093.1,88.3,95.99.0,9.5,7.0311,5-Dihydroxynaphthalene10～10000.99721.01.0,5.0,1089.4,99.9,96.09.8,9.0,5.8321-Naphthol40～20000.99964.04.0,20,4098.9,99.4,1068.8,7.0,5.1

content of dye components in hair dyes(μg/g)=mass concentration of components to be measured from standard curve(μg/L)*dilution multiple/1 000(染發(fā)劑中染料組分的含量(μg/g)=從標準曲線上得到的待測組分的質(zhì)量濃度(μg/L)*稀釋倍數(shù)/1 000)

2.4.2 回收率及精密度由于氧化型染發(fā)劑中均含有幾種染料成分，因此很難獲得針對32種染料成分的空白樣品，因此進行方法學驗證時，首先對市售染發(fā)劑進行了32種成分的檢測，選出2種染發(fā)劑作為空白樣品，一種染發(fā)劑除含有2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽外不包含其余30種染料成分(6#樣品)，采用該染發(fā)劑對不含有的30種染料組分進行方法學驗證；同時選擇不含有2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的另一種染發(fā)劑(5#樣品)，對這2種組分進行方法學驗證。選取上述染發(fā)劑空白樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，按“1.3”方法進行前處理，每個水平重復測定6次，計算其回收率和相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。32個染料的平均回收率為81.0%～110%，RSD為3.3%～9.9%，表明方法具有較好的回收率和重復性。

2.5 實際樣品的檢測

對8種市售染發(fā)劑在優(yōu)化條件下采用本方法測定，共檢出10種染料成分(表4)，檢出含量均小于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)》中的限量要求，與樣品標示的染料組分相同。8種染發(fā)劑中除6#染發(fā)劑以外，其余均含有間苯二酚、對苯二胺和甲苯-2，5-二胺硫酸鹽等多種致癌或致敏性強的染料組分。6#染發(fā)劑中2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的色譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖2。

表4 8種染發(fā)劑中染料成分的測定結(jié)果Table 4 Analytical results of 32 dyes in 8 oxidative hair dyes

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速定性篩查和定量分析染發(fā)劑中32種染料成分的方法。該方法簡單、快速、靈敏，無需繁瑣的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程，采用正負離子模式同時掃描，僅一次檢測即可同時分析32種染料組分，并能準確定性定量，適用于染發(fā)劑中染料的快速篩查測定，有助于染發(fā)劑質(zhì)量安全監(jiān)管。

圖2 6#染發(fā)劑中2-氨基-3-羥基吡啶和2，4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽的色譜圖和二級質(zhì)譜圖Fig.2 Chromotography and two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol and 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride in 6# dyesA.chromotography of 5-amino-o-cresol;B.two-stage full mass scan spectrum of 5-amino-o-cresol;C.chromotography of 2，4-diamino-phenoxyethanol dihydrochloride;D.two-stage full mass scan spectrum of 2，4-diaminophenoxyethanol dihydrochloride