崔新玲，胡志上，孟曉光，錢小紅，朱 濤，應(yīng)萬(wàn)濤*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京)，北京 102206；3.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013；4.北京正旦國(guó)際科技有限責(zé)任公司，北京 102206；5.天津康希諾生物股份有限公司，天津 300457)

21世紀(jì)以來(lái)，單克隆抗體的研發(fā)技術(shù)快速發(fā)展，推進(jìn)了其在生物醫(yī)學(xué)研究、生物制藥以及臨床治療中的應(yīng)用[1]。單克隆抗體藥物(mAb)是通過(guò)基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物，具有特異性高、作用機(jī)制明確、效果顯著、經(jīng)濟(jì)效益大等優(yōu)勢(shì)，已成為近年來(lái)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要增長(zhǎng)點(diǎn)。與小分子藥物不同，抗體類藥物不僅分子質(zhì)量大[2]，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且可經(jīng)糖基化或其它翻譯后修飾[3]，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)具有高度不均一性(異質(zhì)性)[3-4]，這對(duì)單克隆抗體類藥物的表征分析和質(zhì)量控制提出了新的要求和挑戰(zhàn)。

先進(jìn)的分析方法，比如質(zhì)譜技術(shù)[5-11]，可提供非常詳細(xì)的表征過(guò)程和產(chǎn)品信息[5,12-13]，其提供的豐富的結(jié)構(gòu)信息對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要，而這些技術(shù)自身的準(zhǔn)確性、精確性、穩(wěn)健性和適用性也同樣重要。產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)產(chǎn)品而設(shè)定的，并且要持續(xù)適用于內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)品[14]。具有代表性且應(yīng)用廣泛的mAb標(biāo)準(zhǔn)品[15-17]，加之詳細(xì)的表征數(shù)據(jù)，可極大地保證整個(gè)藥品生命周期中的質(zhì)量控制[18-23]。本文主要對(duì)中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供的抗體對(duì)照品(IgG1型單克隆抗體)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究分析(主要是一級(jí)結(jié)構(gòu))，為后續(xù)進(jìn)行深入的質(zhì)量研究與計(jì)量學(xué)溯源技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

L-3120高效液相色譜儀(北京Rigol公司)，Exactive Plus EMR質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)，CEInfinite C01全柱成像毛細(xì)管電泳(加拿大AES公司)，6600 TripleTOF?(美國(guó)Sciex公司)，C4反相色譜柱(日本Shiseido公司)，SEC分子排阻色譜柱(日本Tosoh公司)，C18反相色譜柱(美國(guó)Agilent公司)，陽(yáng)離子交換色譜柱SCX(美國(guó)Sepax公司)。

IgG1型單克隆抗體(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)。甲酸(FA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、碳酸氫銨、碘乙酰胺、胰蛋白酶(Trypsin)、二硫蘇糖醇(DTT)均為質(zhì)譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PNGaseF酶(質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Promega公司)。兩性電解質(zhì)HR AESlyte 3-10、SH AESlyte 2.5-5、羧甲基纖維素(MC)、陰極電極液氫氧化鈉、陽(yáng)極電極液磷酸、等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品(7.03)、等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品(9.33)均為色譜級(jí)，購(gòu)自于加拿大AES公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸胍均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 mAb的分子量分析

完整分子量分析：將蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，高速離心后，取5 μg樣品進(jìn)行反相液相色譜-質(zhì)譜分析。采用C4色譜柱進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽和在線分離。流動(dòng)相A：98%H2O，2%ACN，0.1%FA；流動(dòng)相B：90%ACN，10%H2O，0.1%FA。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。流速：0.2 mL/min。梯度條件：0～3.0 min，2%～30%B；3.0～10.0 min，30%～90% B；10.0～13.0 min，90%B；13.0～15.0 min,90%～2% B；15.0～20.0 min，2%B。質(zhì)譜條件：采集范圍:m/z1 000～9 000;正離子模式；最大離子注入時(shí)間:200 ms。

完整切糖分子量分析：取樣品10 μg，按酶∶蛋白1∶50(U ∶μg)加入PNGaseF酶切糖，取5 μg樣本進(jìn)行反相液相色譜-質(zhì)譜分析。方法同上。

還原后分子量分析：取樣品100 μg(1 mg/mL)，加入DTT 進(jìn)行還原，以10 000 g高速離心后取5 μg樣本進(jìn)行體積排阻色譜-質(zhì)譜分析。采用SEC色譜柱，流動(dòng)相：80%H2O，20%ACN，0.1%TFA，0.1%FA。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流速：0.2 mL/min。等度洗脫20 min。質(zhì)譜條件同完整分子量分析。

切糖還原后分子量分析：取樣品10 μg，按酶∶蛋白1∶50(U∶μg)加入PNGaseF酶進(jìn)行切糖處理，再加入DTT 進(jìn)行還原，以10 000 g高速離心后取5 μg進(jìn)行體積排阻色譜-質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)分析方法同“還原后分子量分析”。

采用Protein Deconvolution(v4)(Thermo Fisher)軟件進(jìn)行分析。其中Rel.Abundance Threshold(%)：0%～1%；m/zRange：Min 1 000；Max 6 000。

1.3 電荷異質(zhì)性分析

全柱成像實(shí)時(shí)等電聚焦毛細(xì)管電泳：將樣品稀釋至10 mg/mL，并取樣品5 μL與HR AESlyte 3-10(1 μL)、SH AESlyte 2.5-5(3 μL)、0.5% MC(40 μL)、等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品(7.03)(0.5 μL)、等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品(9.33)(0.5 μL)混勻，之后以10 000 g離心2 min，單次進(jìn)樣體積5 μL。儀器參數(shù)：柱溫25 ℃；陰極電極液：0.1 mol/L NaOH；陽(yáng)極電極液：0.08 mol/L H3PO4；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。聚焦程序：1 000 V，1 min；2 000 V，1 min；3 000 V，4 min。溫度：25 ℃，電流：<15 μA。

離子交換色譜：以去離子水將樣品稀釋至1 mg/mL，高速離心后取10 μg進(jìn)樣。A相：10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)；B相：A+0.5 mol/L NaCl(pH 6.0)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流速0.6 mL/min。采用SCX色譜柱。梯度洗脫：0～5.0 min，0%B；5.0～43.0 min，0～25%B；43.0～43.5 min，25%～90%B；43.5～48.5 min，90%B；48.5～55 min，90%～0% B；55～60 min，0%B。

1.4 肽圖分析

還原肽圖：將樣品以50 mmol/L碳酸氫銨稀釋至1 mg/mL，取100 μL加入6 mol/L鹽酸胍，加入1 mol/L DTT使其濃度為20 mmol/L，56 ℃還原1 h，加入1 mol/L IAA至其終濃度為25 mmol/L，室溫避光反應(yīng)1 h。使用脫鹽柱除鹽。以酶與蛋白1∶30(質(zhì)量比)的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解16 h，加入FA至其終濃度為0.1%(體積分?jǐn)?shù))，終止反應(yīng)。取酶切液進(jìn)行HPLC/UV及ESI-MS/MS分析。

切糖還原肽圖：將樣品以50 mmol/L的碳酸氫銨稀釋至1 mg/mL，取100 μL，按照1∶30(U∶μg)的比例加入PNGaseF酶，37 ℃孵育16 h，然后進(jìn)行變性還原烷基化及胰蛋白酶酶切(同還原肽圖實(shí)驗(yàn)條件)。

液相色譜條件：A：95%H2O，5%ACN，0.1%FA；B：95%ACN，5%H2O，0.1%FA。流速：0.3 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。0～5.0 min，2%B；5.0～103.0 min，2%～45%B；103.0～108.0 min，45%～90% B；108.0～113.0 min，90%B；113.0～115.0 min,90%～2%B；115.0～120.0 min，2%B。

使用AB SCIEX的BioPharma View進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 完整分子量分析

質(zhì)譜電噴霧離子化源(ESI)可以使完整抗體蛋白帶多個(gè)電荷，從而將質(zhì)荷比(m/z)降至質(zhì)譜儀可監(jiān)測(cè)的范圍內(nèi)。而對(duì)帶多電荷的蛋白質(zhì)譜譜圖進(jìn)行去卷積處理是完整蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的首選方法，其與高分辨率質(zhì)譜儀一起使用時(shí)，可區(qū)分mAb糖型與其它翻譯后修飾(PTM)。在進(jìn)入質(zhì)譜儀之前，色譜分離可用于提高基于MS的完整檢測(cè)的通量和靈敏度。反相高效液相色譜(RP-HPLC)和尺寸排阻色譜(SEC)都已成功用于完整的mAb分離檢測(cè)[14，18]。本研究將上述方法應(yīng)用于抗體對(duì)照品的分析中，并將實(shí)測(cè)的分子量與理論分子量進(jìn)行比較。

mAb的完整分子量解析如表1及圖1所示。圖1A顯示，mAb完整蛋白所帶電荷狀態(tài)良好。綜合表1和圖1B可知，mAb的主峰(4號(hào)峰)是重鏈上攜帶的兩個(gè)G0F；部分重鏈(5號(hào)峰)含有G0F/G1F，相對(duì)比例為18.3%；小部分抗體兩條重鏈(6號(hào)峰)攜帶G1F糖型，其比例為3.1%。相對(duì)比例為6.9%的重鏈(2號(hào)峰)攜帶G0F/G0F(G0F掉一個(gè)HexNAc)，極少部分(1.4%)重鏈(1號(hào)峰)攜帶的G0F/G0F掉2個(gè)HexNAc。可見此抗體的主要糖型是G0F與G1F。3號(hào)峰未解析出，從圖1B插圖可得，其匹配的是主峰的部分，即此峰為主峰的一部分，此現(xiàn)象可能是去卷積ReSpect算法導(dǎo)致的。

表1 mAb完整分子量分析結(jié)果表Table 1 Intact molecular weght(MW) analysis of mAb

ND：no detection

圖2結(jié)果提示此抗體對(duì)照品切糖后分子量為145 810.4，與理論分子量145 806.0的相對(duì)誤差為44 ppm，兩者基本一致，說(shuō)明在完整切糖水平抗體序列正確。通過(guò)以上對(duì)完整分子量的解析，得出抗體的實(shí)測(cè)分子量分布和抗體的糖型分布情況，并計(jì)算出N糖含量為1.67%～2.15%(表2)。

圖1 mAb完整分子量解析圖譜Fig.1 Intact molecular weight analysis of mAbA.multi-charge spectrum，number 32-45,47 were electric charges;B.deconvoluted spectrum

圖2 mAb去糖后的分子量解析圖譜Fig.2 Molecular weight analysis of mAb after PNGaseF digestedA.multi-charge spectrum,number 32-46 were electric charges;B.deconvoluted spectrum

ProteoformIntactMWMWafterPNGaseFdigestedGlycosylatedcontent/%G0F/G0F-2HexNAc148285.0145810.41.67G0F/G0F-HexNAc148493.6145810.41.81G0F/G0F148697.3145810.41.94G0F/G1F148856.9145810.42.05G1F/G1F149020.8145810.42.15

2.2 還原分子量解析

使用Protein Deconvolution進(jìn)行去卷積分析，數(shù)據(jù)的置信區(qū)間設(shè)置為99%。mAb還原后重鏈主峰比例為100%，分子特征為重鏈攜帶一個(gè)G0F；mAb還原后輕鏈主峰比例為100%，與理論分子量一致。如圖3A所示。

mAb切糖后，分子量減小了1 443.4(G0F)，還原重鏈主峰比例為100%，與理論分子量一致。mAb切糖后還原輕鏈主峰比例為100%，與理論分子量一致。如圖3B所示。

2.3 電荷異質(zhì)性結(jié)果

抗體類產(chǎn)品的翻譯后修飾(如糖型的影響及末端賴氨酸的影響)可導(dǎo)致其電荷異質(zhì)性，而某些電荷異質(zhì)性由于對(duì)單抗穩(wěn)定性及其生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要的影響而成為關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，且電荷異質(zhì)性可直接反映其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，受到生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)界及監(jiān)管機(jī)構(gòu)密切關(guān)注，也是抗體類藥物放行必檢項(xiàng)目之一。

全柱成像實(shí)時(shí)等電聚焦毛細(xì)管電泳(WCID-cIEF)的等電點(diǎn)結(jié)果如圖4A所示，抗體等電點(diǎn)的分布(表3)范圍為8.21～8.74。主峰(Peak 4)的等電點(diǎn)為8.61，相對(duì)含量為61.43%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)(CV%)差異較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.08%。檢出3個(gè)酸性峰Peak 1、2、3，其等電點(diǎn)分別為8.21、8.35、8.46；檢出1個(gè)堿性峰(Peak 5)，其等電點(diǎn)為8.74。實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好(未附)，結(jié)果可信。離子交換色譜圖譜及分析見圖4B及表4，mAb由于C末端無(wú)K，所以堿性峰(Peak 5、6)含量較低(4.1%)，而酸性峰(Peak 1、2、3)相對(duì)較高(23.9%)，主峰(Peak 4)的相對(duì)含量為72.0%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(未附)。離子交換色譜結(jié)果與等電點(diǎn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的可靠性。

圖3 還原分子量解析圖Fig.3 Reducing molecular weight analysis chartA.the molecular weight distribution after DTT reduction,B.the molecular weight distribution of DTT reduction after PNGaseF digested；R:reduce,HC:heavy chain,LC:light chain,P:PNGaseF

圖4 mAb的等電點(diǎn)分布(A)及離子交換色譜圖(B)Fig.4 Distribution of pI(A) and ion exchange chrometographic spectrum(B) of mAb

表3 mAb的等電點(diǎn)分布Table 3 pI distribution of mAb

表4 mAb的離子交換色譜圖譜解析Table 4 Ion exchange chromatography spectrum analysis of mAb

2.4 肽圖結(jié)果

肽圖是一種強(qiáng)大的分析手段，可提供抗體序列覆蓋度及抗體的位點(diǎn)特異性信息，基于質(zhì)荷比、MS/MS碎裂模式和保留時(shí)間，LC-MS可進(jìn)一步確定肽圖中的所有峰。肽圖常用于檢測(cè)樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，如修飾(例如氧化、脫酰胺、剪切)和PTM(如糖基化)等。

此IgG1型抗體對(duì)照品的重鏈(HC)序列覆蓋率達(dá)87.4%，輕鏈(LC)序列實(shí)現(xiàn)100%覆蓋。其中重鏈由于中間有一段較長(zhǎng)的序列沒(méi)有胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，且超過(guò)質(zhì)譜的掃描范圍，故未覆蓋到。在肽圖分析中檢測(cè)到的糖型與分子量分析中檢測(cè)到的所有糖型一致，主要為G0F與G1F，糖肽表現(xiàn)在Fc區(qū)的EEQYNSTYR為中心的肽段上，提示糖位點(diǎn)在NST的天冬氨酸殘基上(圖5)。圖5中方框內(nèi)為檢測(cè)到的糖肽片段。同時(shí)進(jìn)行了抗體還原烷基化胰蛋白酶酶切與完整抗體胰蛋白酶酶切，成功解析出了二硫鍵的位點(diǎn)(圖6)及二硫鍵肽[16-19]。在抗體甲硫氨酸(M)的氧化分析中檢測(cè)到M34、M83、M257、M363及M433的氧化修飾，其中M83位點(diǎn)的氧化修飾率最高，為2.1%，與已報(bào)道的抗體氧化率一致[24]。由于抗體C末端的糖化主要發(fā)生在抗體C末端的Lys殘基上[25-29]，而此對(duì)照抗體C末端K缺失，故未檢測(cè)到抗體C末端的糖化情況。

最終根據(jù)以上的分析結(jié)果及抗體的理論氨基酸序列得出抗體的結(jié)構(gòu)，如圖6所示。人源化IgG1的輕(L)和重(H)鏈結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為可變區(qū)(V)和恒定區(qū)(C)，以及從N-末端開始的不同結(jié)構(gòu)域。

圖5 抗體切糖前(A)后(B)的肽圖Fig.5 Peptide mapping before(A) and after(B) PNGaseF digested

圖6 抗體結(jié)構(gòu)圖
Fig.6 Structure of the reference antibody the black line indicates the intrachain and interchain disulfide bond,and the cysteine residue number is the position appearing in the light chain or heavy chain sequence from the N-terminus

3 結(jié) 論

mAb的分子量大，完整分子/還原亞基、切糖前后的分子量分析是非常必要的[30]。本文在分子量的檢測(cè)中，從各個(gè)方面驗(yàn)證了抗體對(duì)照品序列的正確性及其相應(yīng)的糖型修飾，為后續(xù)多批次批間一致性分析提供了參考。通過(guò)全柱成像毛細(xì)管電泳及離子交換的方法表征了抗體對(duì)照品的電荷異構(gòu)體分布情況，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，證明了本方法的可信度。但電荷異構(gòu)體的不同峰形成的具體原因，需進(jìn)一步深入研究。通過(guò)肽圖分析獲得了抗體的序列覆蓋率、糖肽分布及其糖位點(diǎn)[31]的準(zhǔn)確信息，實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)肽段的分析檢測(cè)[32]、二硫鍵解析及甲硫氨酸(M)氧化修飾率分析，并關(guān)注了抗體C末端的糖化現(xiàn)象。上述分析流程，成功實(shí)現(xiàn)了抗體對(duì)照品的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。