鄧紹友，李 麗，楊仁華，劉 光，劉 韜

（1.云南省執(zhí)業(yè)藥師注冊(cè)中心，云南 昆明 650106；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 藥劑科，云南 昆明 650118；3.醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；4.紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，云南 紅河 661100）

兒科人群是臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的敏感人群，屬于特殊群體。美國FDA強(qiáng)調(diào)由于幼齡動(dòng)物試驗(yàn)可檢出潛在的、可能與人體安全性相關(guān)的危害，臨床使用兒童人群的年齡和治療期限，以及從成年動(dòng)物試驗(yàn)和成年患者使用中得到的安全性數(shù)據(jù)，在兒科患者開始短期、多次給藥的有效性和安全性臨床試驗(yàn)之前應(yīng)考慮獲得適當(dāng)?shù)挠g動(dòng)物非臨床安全性評(píng)價(jià)的研究結(jié)果[1]，完成幼齡動(dòng)物試驗(yàn)[2，3]。

濕疹(chronic eczema)是皮膚科臨床常見的一組變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，主要包括變應(yīng)性接觸性皮炎、濕疹和特應(yīng)性皮炎，多認(rèn)為由機(jī)體內(nèi)、外因共同作用引起，反復(fù)發(fā)作[4，5]。目前的治療方法西醫(yī)多采用查找并消除過敏源、脫敏療法和H1受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素等非特異性藥物治療、中藥、抗菌藥等進(jìn)行局部或全身藥物治療。

七參連濕疹膏具有清熱燥濕、活血消腫、祛風(fēng)止癢之功效，已經(jīng)上市用于治療成人濕疹，對(duì)因風(fēng)濕熱毒瘀阻所引起的濕疹臨床療效肯定?，F(xiàn)擬經(jīng)皮膚涂抹治療嬰幼兒濕疹，因此，本文按照《中藥、天然藥物刺激和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[6]、《中藥、天然藥免疫原性（過敏、光敏反應(yīng)） 研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]進(jìn)行幼齡家兔皮膚刺激性和幼齡豚鼠主動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)，觀察給藥局部和全身性反應(yīng)情況，為嬰幼兒臨床試驗(yàn)和安全用藥提供試驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法 一、藥品與試劑 七參連濕疹膏（組方：黃連、苦參、蒼術(shù)、重樓、三七、白鮮皮、爐甘石、花椒、冰片、甘草）及基質(zhì)均由同一生產(chǎn)企業(yè)提供。2，4一二硝基氯苯，化學(xué)試劑產(chǎn)品，用橄欖油配制成1%和0.1%濃度。致敏用1%濃度，激發(fā)用0.1%濃度，硫化鈉。

二、試驗(yàn)動(dòng)物 健康幼齡（2月齡）家兔，雌雄各半，體重0.8～1.2kg，健康幼齡豚鼠，雌雄各半，體重150～200g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

三、方法 1.幼齡家兔皮膚局部刺激反應(yīng)[6]

①分組與給藥 設(shè)置單次給藥完整皮膚試驗(yàn)組和破損皮膚試驗(yàn)組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質(zhì)陰性對(duì)照組共2組，每組6只幼齡家兔），多次給藥整皮膚試驗(yàn)組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質(zhì)陰性對(duì)照組共2組，每組6只）和破損皮膚試驗(yàn)組（包括七參連濕疹膏受試藥物組、空白基質(zhì)陰性對(duì)照組共2組，每組6只幼齡家兔）。

②對(duì)幼齡家兔完整皮膚的刺激反應(yīng) 健康幼齡家兔6只，雌雄各半，將其背部兩側(cè)對(duì)稱脫毛2塊，面積每側(cè)約5.0cm×7.5cm。試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法，即左側(cè)背部皮膚涂搽七參連濕疹膏4g，右側(cè)背部皮膚涂擦基質(zhì)4g。

③對(duì)幼齡家兔破損皮膚的刺激反應(yīng) 健康幼齡家兔6只，雌雄各半，將其背部兩側(cè)對(duì)稱脫毛2塊，面積每側(cè)約5.0cm×7.5cm。用無菌8號(hào)針頭劃直徑為2cm的“#”形擦傷，注意只刺破表皮，不傷及真皮，以有輕度滲血為度。試驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對(duì)照法，即左側(cè)背部皮膚涂搽七參連濕疹膏4g，右側(cè)背部皮膚涂搽基質(zhì)4g。

④單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn) 取完整去毛皮膚和破損皮膚各1組（每組6只），將受試物4g均勻涂抹于左側(cè)脫毛區(qū)皮膚上，然后用一層保鮮膜、兩層紗布覆蓋，再用剪去指套的乳膠手套包住整個(gè)背部和腹部加以固定；右側(cè)涂布空白基質(zhì)作為陰性對(duì)照。涂藥后用兩層紗布和一層無刺激性膠布固定6h，貼敷6h后，去除受試藥物，并用0.9%氯化鈉溶液洗凈給藥部位。給藥前及給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h，觀察動(dòng)物有無紅斑和水腫反應(yīng)，涂搽部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄，記錄出現(xiàn)和消退時(shí)間。

⑤多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn) 取完整去毛皮膚和破損皮膚組各1組（每組6只），給藥方式同單次用藥，但在同一部位連續(xù)給藥14d，每次給藥時(shí)間相同，每次涂藥后用兩層紗布和一層無刺激性膠布固定6h。固定結(jié)束后，除去受試藥物并用溫水清潔給藥部位。連續(xù)涂藥14d。每天給藥前及末次給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h，觀察動(dòng)物有無紅斑和水腫反應(yīng)，涂搽部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄，記錄出現(xiàn)和消退時(shí)間。

⑥刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)[6，8]分別于給藥前及給藥后0.5h、1h、24h、48h和72h觀察實(shí)驗(yàn)區(qū)部位皮膚是否出現(xiàn)紅斑及紅腫。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：（1）紅斑：0分：皮膚處未出現(xiàn)紅斑；1分：勉強(qiáng)可以看見皮膚處存在輕微紅斑；2分：明顯可以看見皮膚處中度紅斑；3分：重度紅斑；4分：紅斑呈紫紅色，形成焦痂； （2）水腫：0分：未出現(xiàn)水腫；1分：勉強(qiáng)可以看見輕微水腫；2分：明顯可以看見水腫處高出周圍皮膚；3分：水腫處高出周圍皮膚1mm，重度水腫，有較為清晰的輪廓；4分：嚴(yán)重水腫，潛在擴(kuò)大、水腫，甚至破潰、嚴(yán)重水腫。皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：分值0.000～0.049為無刺激性；分值為0.50～1.99為輕度刺激性；分值為2.00～5.99為中度刺激性；6.00～8.00為強(qiáng)刺激性。

刺激反應(yīng)平均分值=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/動(dòng)物數(shù)。

2.幼齡豚鼠皮膚過敏反應(yīng)[7]①分組及給藥量幼齡豚鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，10只/組。受試藥組：七參連濕疹膏按每只每次0.2mL涂搽；基質(zhì)對(duì)照組：軟膏基質(zhì)按每只每次0.2mL涂搽；陽性對(duì)照組：2，4一二硝基氯苯，用橄欖油配制成1%和0.1%濃度。致敏用1%濃度，激發(fā)用0.1%濃度。均按每只0.2mL涂搽；空白對(duì)照組：0.9%生理鹽水，按每只0.2mL涂搽。

②致敏接觸 將幼齡豚鼠背部兩側(cè)毛脫掉，去毛區(qū)范圍每側(cè)約3cm×3cm。脫毛后24h，將上述各受試物分別涂于各組動(dòng)物左側(cè)脫毛區(qū)（陽性對(duì)照用1%2，4一二硝基氯苯），用一層油紙及二層紗布覆蓋，再以無刺激膠布封閉、固定，持續(xù)6h。每只動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，于第7d和第14d，以同樣方法各重復(fù)一次，共3次。

③激發(fā)接觸 末次給受試物致敏后14d，將上述各受試物分別涂于各組動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)（陽性對(duì)照用0.1%2，4一二硝基氯苯），6h后用溫水清除受試物，即刻觀察，然后于24h、48h、72h再次觀察皮膚過敏反應(yīng)情況。

④致敏性評(píng)價(jià) 按前述“刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)”計(jì)算激發(fā)接觸后24h、48h和72h時(shí)間點(diǎn)過敏反應(yīng)分值；致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8，9]：致敏發(fā)生率0%～10%為無致敏性；11%～30%為輕度致敏性；31%～60%為中度致敏性；61%～80%為高度致敏性；81%～100%為極度致敏性。

致敏發(fā)生率=出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫或全身性過敏反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)/動(dòng)物總數(shù)

結(jié) 果 一、單次涂搽皮膚給藥對(duì)幼齡家兔皮膚的刺激反應(yīng) 七參連濕疹膏及其基質(zhì)對(duì)照單次涂搽于家兔完整皮膚和破損皮膚后，各組動(dòng)物均未觀察到嚴(yán)重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生，見表1。用藥前及用藥后24h、48h和72h的刺激評(píng)分均為0分；用藥后0.5h和1h七參連組評(píng)分均為0.33，基質(zhì)對(duì)照組評(píng)分為0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關(guān)，其分值＜0.49，為無刺激反應(yīng)，見表2。

二、多次涂擦皮膚給藥對(duì)幼齡家兔皮膚的刺激反應(yīng) 七參連濕疹膏及其基質(zhì)多次涂搽于幼齡家兔完整皮膚后，在14d內(nèi)，涂藥過程中以及每次涂藥后各組動(dòng)物均未觀察到嚴(yán)重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生。在14d內(nèi)，每次用藥前及用藥后48h和72h的刺激評(píng)分均為0分；用藥后0.5h、1h和24h七參連濕疹膏組和基質(zhì)對(duì)照組評(píng)分均為0.33、0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關(guān)，其分值＜0.49，為無刺激反應(yīng)，見表3。

七參連濕疹膏及其基質(zhì)多次涂搽于幼齡家兔破損皮膚后，各組動(dòng)物均未觀察到嚴(yán)重的紅斑及水腫出現(xiàn)，也未見色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生。在14d內(nèi)，每次用藥前及用藥48 h和72h的刺激評(píng)分均為0分；用藥后0.5h、1h和24h七參連濕疹膏組和基質(zhì)對(duì)照組評(píng)分均為0.50、0.33和0.17，這與藥物涂搽于皮膚固定物摩擦皮膚有關(guān)，0.5h評(píng)分為其0.50，屬輕度刺激反應(yīng)，1h后分值＜0.49，為無刺激反應(yīng)，見表4。

三、對(duì)幼齡豚鼠皮膚過敏性的影響 在致敏期間，2，4一二硝基氯苯陽性藥物組，部分動(dòng)物出現(xiàn)紅斑和水腫，其余各組動(dòng)物均未見過敏反應(yīng)；激發(fā)后，生理鹽水空白對(duì)照組1只動(dòng)物在激發(fā)后24h出現(xiàn)輕度紅斑，致敏發(fā)生率為10%，為無致敏性，見表5。在激發(fā)給藥后24h、48h和72h，七參連濕疹膏組致敏率分別為10%、0%和0%；其基質(zhì)對(duì)照組致敏率分別為10%、0%和0%；陽性藥物組各時(shí)間點(diǎn)的致敏發(fā)生率均為100%，見表6。

表1 七參連濕疹膏單次涂搽幼齡家兔完整皮膚的刺激反應(yīng)評(píng)分（n=6）

討 論 中藥外用為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病尤其是皮膚疾病的重要手段，但近年來外用中藥過敏的臨床事件時(shí)有發(fā)生。中藥致皮膚過敏反應(yīng)的類型有接觸性皮炎、局部皮膚刺激、光毒性及光變應(yīng)性皮炎、系統(tǒng)性接觸性反應(yīng)等，引起這些反應(yīng)的中藥既有單味藥，也有復(fù)方制劑[10]。這些中藥外用可能引起局部過敏反應(yīng)或全身過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至中毒致死[11]。因此，有必要對(duì)外用中藥進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)。

表2 七參連濕疹膏單次涂搽幼齡家兔破損皮膚的刺激反應(yīng)評(píng)分（n=6）

表5 七參連濕疹膏涂搽幼齡豚鼠皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表6 七參連濕疹膏涂搽幼齡豚鼠皮膚的致敏發(fā)生率和致敏性

表3 七參連濕疹膏多次涂搽幼齡家兔完整皮膚的刺激反應(yīng)評(píng)分（n=6）

表4 七參連濕疹膏多次涂搽幼齡家兔破損皮膚的刺激反應(yīng)評(píng)分（n=6）

本次家兔皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)幼齡家兔的正常皮膚和破損皮膚，七參連濕疹膏單次及多次涂搽皮膚用藥的刺激指數(shù)均≤0.49。病理組織學(xué)檢查也未見明顯異常，可認(rèn)為無刺激性。在激發(fā)給藥后24h、48h和72h，七參連濕疹膏組致敏率分別為10%、0%和0%，根據(jù)致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[8，9]，致敏發(fā)生率在0%～10%，提示七參連濕疹膏無致敏性。

綜上所述，七參連濕疹膏單次及多次經(jīng)皮涂搽對(duì)幼齡家兔的完整皮膚和破損皮膚均無明顯刺激性；給幼齡豚鼠皮膚用藥后，無過敏作用。皮膚安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明七參連濕疹膏對(duì)幼齡動(dòng)物皮膚給藥使用安全。