于鐘鈺， 張曉明， 王劍濤， 溫小紅， 徐曉蝶， 郭景春， 周厚廣*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200040 2. 復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)水平和人們預(yù)期壽命的不斷提高，中國(guó)已進(jìn)入了人口老齡化的加速期。近期發(fā)布的《老年健康藍(lán)皮書：中國(guó)老年健康研究報(bào)告(2018)》顯示，2000至2018年，我國(guó)60歲及以上老年人口從1.26億人增加到2.49億人，占總?cè)丝诒戎貜?0.2%上升到17.9%。老齡化的加劇導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)病率顯著升高[1-2]，而老年人心腦血管病變的病理基礎(chǔ)主要是動(dòng)脈粥樣硬化。發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素眾多[3-6]，如2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)、高血壓病、血脂異常、肥胖、高同型半胱氨酸等，其中T2DM是最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。T2DM患者體內(nèi)存在糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，這些刺激可引起動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)血管病變的發(fā)生發(fā)展[7]。

研究[8]表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中的關(guān)鍵步驟。碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)是一種廣泛存在的含鋅金屬蛋白酶，同時(shí)也是一種pH調(diào)節(jié)蛋白，其中CAⅢ是該家族的特殊成員[9]。CAⅢ在人體的骨骼肌和肝臟組織中表達(dá)豐富，且可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[10-11]。因此，本研究擬進(jìn)一步探討血清CAⅢ水平與老年T2DM患者血管并發(fā)癥的相關(guān)性，為老年人T2DM性血管病變的診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科體檢人員，詳細(xì)詢問并記錄所有入組者年齡、性別、既往病史等。既往史包括：有無高血壓病、T2DM、冠心病、高血脂、心絞痛、心肌梗死、腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作等。根據(jù)2010年版美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的T2DM患者，共246例。記錄患者有無血管性疾病，包括腦血管疾病(腦梗死/腦小血管病/腦出血等)、冠心病、頸動(dòng)脈粥樣硬化。據(jù)此，將T2DM患者分為有血管并發(fā)癥組(n=87)和無血管并發(fā)癥組(n=159)。篩選同期56例健康老年人作為對(duì)照組。因此，本研究共有3組研究對(duì)象：對(duì)照組、T2DM未合并血管并發(fā)癥組和T2DM合并血管并發(fā)癥組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：T2DM以外的其他類型糖尿病患者或繼發(fā)性糖尿病患者；T2DM合并急性并發(fā)癥，如酮癥酸中毒、高滲性昏迷、低血糖；合并其他內(nèi)分泌代謝疾病，如甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、腎上腺皮質(zhì)功能不全、垂體瘤等；免疫相關(guān)血管性疾?。蛔陨砻庖咝约膊?、急慢性感染、艾滋病、梅毒、肝硬化、腎功能衰竭、惡性腫瘤、圍手術(shù)期、有精神病史等患者。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：無上述常見老年慢性疾病，同時(shí)無以上排除標(biāo)準(zhǔn)中各種疾病。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 比較對(duì)照組和T2DM組患者的血清生化指標(biāo)。比較T2DM是否伴發(fā)血管并發(fā)癥兩組患者的基本數(shù)據(jù)(包括年齡、高血壓、高脂血癥、心房顫動(dòng)/房撲、左束支傳導(dǎo)阻滯)以及血清標(biāo)志物水平。為研究血清CAⅢ水平與T2DM合并血管并發(fā)癥間是否存在相關(guān)性，ELISA法檢測(cè)3組患者血清CAⅢ水平，采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析CAⅢ水平與血清生化指標(biāo)之間的相關(guān)性，同時(shí)采用ROC曲線評(píng)價(jià)血清CAⅢ水平對(duì)診斷T2DM血管并發(fā)癥的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.3 生化指標(biāo) 受檢者清晨空腹(至少8 h內(nèi)未進(jìn)食)，采集靜脈血5 mL，生化指標(biāo)檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿酸(UA)、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，檢測(cè)嚴(yán)格遵守《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范》規(guī)定。

1.4 血清CAⅢ水平檢測(cè) 收集3組受檢者的血清。采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組血清中CAⅢ水平。首先在試劑盒中取標(biāo)準(zhǔn)品1支，離心機(jī)中使用6 000 r/min離心30 s，然后用1 mL樣本稀釋液溶解，完全混勻后得標(biāo)準(zhǔn)品S7。標(biāo)記7個(gè)1.5 mL離心管依次排列，編號(hào)為S0～6，每個(gè)離心管中加入250 μL樣本稀釋液，然后吸取250 μL S7內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，放入第一個(gè)離心管S6中，將S6混勻后吸取出250 μL溶液放入第2個(gè)離心管S5中，如此依次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，S0離心管中加入樣本稀釋液。依照以上步驟將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 ng/mL。然后，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔，每孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL,混勻后蓋上板貼，使用37℃溫箱孵育2 h。棄去液體，甩干。加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，蓋上板貼，37℃溫箱孵育1 h。棄去液體，甩干，洗板2 min×3次，每孔200 μL，甩干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素液100 μL，蓋上板貼，37℃溫箱孵育1 h。棄去液體，甩干，洗板2 min×5次，每孔200 μL，甩干。每孔內(nèi)加入90 μL底物溶液，37℃避光顯色15～30 min。之后，每孔加入50 μL終止溶液，使反應(yīng)終止。檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的光密度(D)值。最后，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)樣品中的CAⅢ水平。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料的比較 結(jié)果(表1)表明，與對(duì)照組相比，T2DM組患者血清中ALT、TP、ALB、BUN、UA、TG、LDL、FBG、HbA1c水平均增加，同時(shí)血清中HDL水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，T2DM患者體內(nèi)普遍存在糖脂穩(wěn)態(tài)失衡。本研究中，T2DM患者中血管并發(fā)癥的發(fā)生率為35.37%，其中冠心病的發(fā)生率最高，為28.86%；合并腦血管疾病的發(fā)生率為11.38%；合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率為4.47%。

2.2 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間的基本資料和生化指標(biāo)比較 結(jié)果(表2)表明，與無血管并發(fā)癥組相比，有血管并發(fā)癥組的高血壓、高脂血癥、心房顫動(dòng)/房撲以及左束支傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生比例較高，且年齡和高血壓兩因素差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，T2DM伴血管并發(fā)癥患者患有高血壓、高脂血癥、心房顫動(dòng)/房撲、左束支傳導(dǎo)阻滯的概率較大，遠(yuǎn)期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較高。

表1 對(duì)照組和T2DM組患者生化指標(biāo)比較

*P<0.05，**P<0.01. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)；堿性磷酸酶(ALP)；總膽紅素(TBIL)；直接膽紅素(DBIL)；總蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；膽固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血紅蛋白(HbA1c)

血清生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果(表3)表明：與無血管并發(fā)癥組相比，有血管并發(fā)癥組患者的血清TBIL水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其余生化指標(biāo)均無顯著性差異。T2DM患者體內(nèi)普遍存在糖脂穩(wěn)態(tài)失衡，各種血清生化指標(biāo)均可出現(xiàn)異常，但目前常見的血清生化指標(biāo)并不能用來評(píng)估T2DM患者有無血管并發(fā)癥。

表2 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間基本資料比較 n(%)

表3 有/無血管并發(fā)癥T2DM患者間血清生化指標(biāo)(95%CI)的比較

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)；堿性磷酸酶(ALP)；總膽紅素(TBIL)；直接膽紅素(DBIL)；總蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；膽固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血紅蛋白(HbA1c)

2.3 不同組別血清CAⅢ水平的比較 ELISA法分別檢測(cè)了3組人群血清中CAⅢ水平(圖1)，結(jié)果提示，3組間CAⅢ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，與對(duì)照組(1.05±0.108)相比，兩個(gè)T2DM組血清CAⅢ水平均明顯降低(P<0.01)。同時(shí)，T2DM合并血管并發(fā)癥組血清CAⅢ水平(0.82±0.113)顯著低于T2DM未合并血管并發(fā)癥組(0.97±0.131，P<0.01)。

2.4 血清CAⅢ水平與各生化指標(biāo)之間相關(guān)性分析 結(jié)果(表4)表明，血清CAⅢ水平與HDL和TBIL正相關(guān)，而與LDL和Scr負(fù)相關(guān)，但均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不排除樣本量較小所致可能。血清CAⅢ水平與BUN、FBG、HbA1c負(fù)相關(guān)，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示血清CAⅢ水平與BUN、FBG和HbA1c間的關(guān)聯(lián)性較大。

圖1 3組患者血清CAⅢ水平的比較

**P<0.01，T2DM未合并血管并發(fā)癥組/T2DM合并血管并發(fā)癥組與對(duì)照組相比；&&P<0.01，T2DM未合并血管并發(fā)癥組與T2DM合并血管并發(fā)癥組相比

表4 血清CAⅢ水平與各生化指標(biāo)之間Spearman相關(guān)性分析

HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；TBIL:總膽紅素;Scr：肌酐；FBG：空腹血糖；HbA1c：糖化血紅蛋白

2.5 血清CAⅢ水平對(duì)診斷T2DM合并血管并發(fā)癥的臨床應(yīng)用價(jià)值 通過比較ROC曲線(圖2)下面積AUC大小判斷各指標(biāo)對(duì)T2DM合并血管并發(fā)癥的臨床診斷準(zhǔn)確性。分析結(jié)果(表5)顯示，LDL的AUC為0.507 8(95%CI 0.390 9～0.624 6，P=0.896 9)，HDL的AUC為0.531 7(95%CI 0.423 2～0.640 3，P=0.566 0)，TBIL的AUC為0.557 3(95%CI 0.451 5～0.663，P=0.291 8)，CAⅢ的AUC為0.884 6(95%CI 0.813 2～0.956，P<0.000 1)。結(jié)果(表5)顯示，血清CAⅢ的ROC曲線下面積AUC為0.884 6，診斷準(zhǔn)確性優(yōu)于其他3項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)，提示血清CAⅢ對(duì)T2DM合并血管并發(fā)癥具有較好的臨床診斷敏感性和特異性。

圖2 各生化指標(biāo)的ROC曲線

項(xiàng)目AUC面積約登指數(shù)靈敏度(%)特異度(%)LDL0.507 823.6423.64100HDL0.531 715.6128.5787.04TBIL0.557 313.5592.8620.69CAⅢ0.884 669.5483.3386.21

3 討 論

伴隨著我國(guó)進(jìn)入深度老齡化社會(huì)，心腦血管疾病已嚴(yán)重威脅老年人群的身體健康和生活質(zhì)量。動(dòng)脈粥樣硬化是老年人心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。T2DM、高血壓病、高脂血癥、吸煙、肥胖和非酒精性脂肪肝等是動(dòng)脈粥樣硬化的常見危險(xiǎn)因素，其他還包括高尿酸血癥、高同型半胱氨酸血癥、不健康的飲食習(xí)慣、家族史等。中國(guó)T2DM的發(fā)病率逐年增加，是老年人群中最常見的慢性疾病，同時(shí)T2DM引起的血管病變嚴(yán)重影響老年人的預(yù)期壽命。雖然以往相關(guān)研究認(rèn)為T2DM引起的動(dòng)脈粥樣硬化病變過程中有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等多種相關(guān)機(jī)制的參與其中，但具體分子機(jī)制尚未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)，無論T2DM患者有無血管并發(fā)癥，體內(nèi)CAⅢ水平與對(duì)照組相比均顯著降低，同時(shí)T2DM合并血管并發(fā)癥患者血清中CAⅢ水平低于T2DM未合并血管并發(fā)癥患者，提示血清CAⅢ水平可能與T2DM及其相關(guān)血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展存在內(nèi)在聯(lián)系。

T2DM患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在高血糖和胰島素抵抗，在多種代謝紊亂的病理生理因素刺激下，通過增強(qiáng)氧化應(yīng)激，引起血管內(nèi)皮損傷，炎癥因子和黏附分子表達(dá)增加，致炎細(xì)胞向動(dòng)脈內(nèi)膜遷移并黏附。血管內(nèi)巨噬細(xì)胞通過吞噬LDL，形成泡沫細(xì)胞，最終促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下肝細(xì)胞內(nèi)CAⅢ表面的兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)迅速結(jié)合形成S-谷胱甘肽[13]；暴露在H2O2的細(xì)胞轉(zhuǎn)染CAⅢ后，活性氧(ROS)水平較未轉(zhuǎn)染組明顯減少[14]，提示CAⅢ可能具有抗氧化應(yīng)激作用。在本臨床試驗(yàn)中，T2DM合并血管并發(fā)癥患者血清CAⅢ水平明顯低于對(duì)照組和T2DM未合并血管并發(fā)癥組，提示CAⅢ水平下降有可能參與了T2DM患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)，除了作為一個(gè)特殊的體內(nèi)抗氧化應(yīng)激因子，CAⅢ還是一種pH敏感型的蛋白酶，在胰島素抵抗和高血糖作用下，可造成細(xì)胞內(nèi)乳酸生成增多，pH值下降，進(jìn)而抑制CAⅢ的表達(dá)，同時(shí)抑制O2與血紅蛋白結(jié)合，導(dǎo)致HbA1c增多，氧合血紅蛋白減少[15]，使組織出現(xiàn)缺氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，引起血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

此外，T2DM患者常伴隨肥胖和高脂血癥，血液中LDL水平增高和HDL水平降低會(huì)增加泡沫細(xì)胞的形成[16]，引起血液黏度增加和血流動(dòng)力學(xué)變化，進(jìn)而損傷動(dòng)脈管壁，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程[17]。以往相關(guān)研究表明，胰島素可促進(jìn)脂肪組織的從頭合成，而CAⅢ則主要是為此過程提供碳酸氫根離子[18-19]。T2DM患者體內(nèi)CAⅢ水平低下可能會(huì)加重脂代謝紊亂，從而導(dǎo)致血管并發(fā)癥的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，與56例正常老年對(duì)照組相比，248例老年T2DM患者血液中LDL水平明顯增高，而HDL水平則顯著降低，提示臨床老年T2DM患者確實(shí)存在明顯的脂代謝紊亂，與上述報(bào)道結(jié)果基本一致。

本研究中Spearman相關(guān)性分析顯示血清中TBIL水平與CAⅢ正相關(guān)，而且TBIL水平在T2DM有無血管并發(fā)癥患者中存在明顯差異，即合并血管并發(fā)癥T2DM患者的TBIL水平明顯低于無血管并發(fā)癥T2DM患者。臨床上普遍認(rèn)為膽紅素作為一種有害物質(zhì)，主要用來評(píng)估肝功能和黃疸。其實(shí)膽紅素同時(shí)也是一種內(nèi)源性抗氧化劑[20]，可以參與抗氧化、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、改善氧化應(yīng)激等的生理反應(yīng)[21]。研究表明缺血性腦卒中患者血清膽紅素水平偏低，而相對(duì)較高的膽紅素水平可能有助于避免腦梗死的發(fā)生[22]。因此，血清總膽紅素水平過低有可能是誘發(fā)老年人血管病變的危險(xiǎn)因素之一。由于血清CAⅢ和TBIL水平均與機(jī)體氧化應(yīng)激水平相關(guān)，提示兩者之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，共同參與T2DM相關(guān)氧化應(yīng)激障礙和血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，適當(dāng)提升或補(bǔ)充CAⅢ和TBIL水平可能有助于預(yù)防或延緩T2DM相關(guān)血管并發(fā)癥。但其內(nèi)在機(jī)制尚待進(jìn)一步研究和明確。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血清CAⅢ水平還與BUN和Scr呈一定負(fù)相關(guān)性，并與BUN呈顯著負(fù)相關(guān)，提示血清CAⅢ水平與BUN等腎功能相關(guān)指標(biāo)存在一定內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。長(zhǎng)期高血糖可造成腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂和葡萄糖代謝異常，激活機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[23-24]，而CAⅢ水平適度升高可使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[25]，同時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)可增強(qiáng)CAⅢ蛋白質(zhì)氧化，氧化的蛋白質(zhì)隨之被泛素化而降解。因此，我們推測(cè)腎功能水平可影響血清CAⅢ水平，而適度提升CAⅢ水平和活性可能有助于在一定程度上保護(hù)腎功能。

綜上所述，老年T2DM患者血清CAⅢ水平與糖脂代謝穩(wěn)態(tài)之間存在密切相關(guān)性，并與腎功能和TBIL水平存在一定內(nèi)在聯(lián)系。ROC曲線分析提示血清CAⅢ水平與T2DM血管并發(fā)癥之間存在內(nèi)在關(guān)系，對(duì)T2DM合并血管并發(fā)癥具有良好的臨床診斷參考價(jià)值。結(jié)果提示血清CAⅢ可能是通過調(diào)控糖脂代謝穩(wěn)態(tài)等機(jī)制來發(fā)揮其重要的生物學(xué)效應(yīng)，低水平的血清CAⅢ可能與TBIL共同參與了T2DM相關(guān)氧化應(yīng)激和血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。適度提升或補(bǔ)充CAⅢ可能有助于預(yù)防或延緩老年T2DM相關(guān)血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。但目前上述作用機(jī)制尚不清楚，仍需大量臨床觀察和深入研究來闡明和揭示CAⅢ參與老年T2DM性血管病變的病理和分子機(jī)制，進(jìn)而為老年T2DM性血管并發(fā)癥的機(jī)制研究和臨床干預(yù)提供新的思路。