楊華，宋昭，戴航，陳雄，李欣，陳守文，蔡冬波，李俊輝，王志*

1(發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢，430068) 2(省部共建生物催化與酶工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北大學(xué))，湖北 武漢，430062) 3(綠康生化股份有限公司，福建 浦城，353400)

地衣芽胞桿菌是革蘭氏陽(yáng)性的產(chǎn)芽胞兼性厭氧微生物，能分泌淀粉酶、蛋白酶等水解酶[1-3]，以及肽類抗生素，其中包括桿菌肽。通過(guò)非核糖體合成酶系合成的十二環(huán)肽分子[4]-桿菌肽具有廣譜抗菌、藥物殘留量少、無(wú)抗藥性等優(yōu)良特性，是目前國(guó)際社會(huì)允許使用的為數(shù)不多的綠色飼料添加劑之一[5]。

地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的過(guò)程中，細(xì)胞優(yōu)先使用速效碳、氮源已獲得最大的生長(zhǎng)速率[6]，并伴隨著培養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)成分改變做出快速響應(yīng)，如呼吸代謝抑制[7]、溢流代謝[8]等碳分解代謝阻遏的具體表現(xiàn)形式[9-10]。通過(guò)提高溶氧(dissolved oxygen, DO)促進(jìn)氨基酸代謝[11]、中期流加H2O2降低溢流代謝程度[12],以及提高乙偶姻還原酶活性,降低胞內(nèi)NADH/NAD+比率[13]等方法,均可以提高桿菌肽合成效率。而在桿菌肽補(bǔ)料發(fā)酵方面，劉道奇等發(fā)現(xiàn)葡萄糖補(bǔ)料能促進(jìn)細(xì)胞溢流代謝,但桿菌肽的合成被抑制[14]。另外，桿菌肽發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基黏度大，易起泡，細(xì)胞數(shù)可高達(dá)百億CFU/mL等因素，均使氧的供應(yīng)及利用效率逐漸降低[11]，使得發(fā)酵前期DO跌至零[12]、中期菌體自溶[13]。就增加發(fā)酵液DO而言，工業(yè)上常增加通風(fēng)量和提高轉(zhuǎn)速，但會(huì)增加能耗，也不利于泡沫的控制[15]，而適量升高罐壓可以有效避免上述不利因素，如陳偉波等[16]將罐壓由0.02 MPa升至0.06 MPa，L-精氨酸產(chǎn)量提高了34%。另外，桿菌肽合成也與其前體氨基酸的供應(yīng)效率呈正相關(guān)，如ORN[21]、Asp、Glu、Asn、His、Ile、Lys等[11]。因此，桿菌肽合成涉及到了碳-氮-氧等綜合因素，而相關(guān)的綜合研究還未見(jiàn)報(bào)道。

以工業(yè)地衣芽孢桿菌LC為發(fā)酵菌株，本文探索了pH耦合、間歇補(bǔ)料-罐壓控制和間歇-溶氧耦合流加等方式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和桿菌肽合成的影響，建立了基于細(xì)胞需求的綜合補(bǔ)料策略，有效提高了桿菌肽發(fā)酵效率，為桿菌肽工業(yè)化生產(chǎn)的補(bǔ)料工藝優(yōu)化提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisLC，LC菌株)，湖北大學(xué)綠康生物工程研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

茄子瓶斜面培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏20， NaCl 5，瓊脂20，調(diào)pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：豆粕90，玉米淀粉40，玉米漿2.5，輕質(zhì)CaCO34，蛋白胨 5，(NH4)2SO41。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：豆粕79，玉米淀粉37.5，玉米漿7.5，輕質(zhì)CaCO34.5，蛋白胨 15，(NH4)2SO40.75，MgSO4·7H2O 1.1。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子活化

無(wú)菌竹簽轉(zhuǎn)接-80 ℃保藏甘油管菌液至茄子瓶斜面，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

茄子瓶斜面加50 mL無(wú)菌水制備菌懸液，取4 mL菌懸液接種于搖瓶中(裝液量50 mL)。37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，合瓶得到種子液。

1.3.3 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

種子液接種后發(fā)酵液體積27 L，接種量5%，在通風(fēng)量1.6 m3/h、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速350 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.4 50 L罐發(fā)酵策略控制

發(fā)酵1：按發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，罐壓0.03 MPa。

發(fā)酵2：pH耦合補(bǔ)料策略，基于發(fā)酵1實(shí)施。于18～20 h補(bǔ)氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g)，22～28 h采用pH耦合補(bǔ)糖。pH值設(shè)定方式為：22～24 h為7.5，22～28 h每2 h的pH設(shè)定值上升0.1，28 h后pH自然。發(fā)酵過(guò)程中共補(bǔ)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的葡萄糖溶液400 mL，罐壓0.03 MPa。

發(fā)酵3：18～20 h補(bǔ)氮源3.0 L(含豆粕500 g、玉米漿250 g)，其他同發(fā)酵2，補(bǔ)入葡萄糖340 g。

發(fā)酵4：間歇補(bǔ)料策略，從18 h開(kāi)始，以200 mL/3 h的速率補(bǔ)入1 L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的葡萄糖溶液(750 g)，第30小時(shí)補(bǔ)完。于18～20 h補(bǔ)氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g)，罐壓0.03 MPa。

發(fā)酵5：間歇補(bǔ)料-罐壓控制策略，基于發(fā)酵4，并且24 h至發(fā)酵結(jié)束罐壓維持在0.05 MPa。

發(fā)酵6：間歇-溶氧耦合補(bǔ)料策略?；诎l(fā)酵5，18～21 h間歇補(bǔ)料，24 h開(kāi)始將補(bǔ)料方式改為DO耦合(溶氧>35%時(shí)，耦合補(bǔ)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的葡萄糖溶液)，24 h至發(fā)酵結(jié)束罐壓維持在0.05 MPa。共補(bǔ)入葡萄糖500 g。

發(fā)酵7：間歇-溶氧耦合-二次氮源補(bǔ)料策略，基于發(fā)酵6。另外，在24～25 h第2次補(bǔ)入氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g)，發(fā)酵過(guò)程中共補(bǔ)入葡萄糖436 g。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖的測(cè)定

DNS法[12]。

1.4.2 桿菌肽效價(jià)測(cè)定

采用Ultimate 3000高效液相色譜進(jìn)行桿菌肽效價(jià)測(cè)定[14]，桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品(效價(jià)為65.8 U/mg)。

1.4.3 生物量的測(cè)定

采用稀釋平板涂布法獲得CFU/mL數(shù)據(jù)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)為至少3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵策略1對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

發(fā)酵1中桿菌肽效價(jià)、生物量、pH值和還原糖的變化如圖1所示。

圖1 發(fā)酵1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.1 Influences of fermentation 1 on cell growth and bacitracin synthesis

桿菌肽效價(jià)在24 h達(dá)到峰值793 U/mL，平均桿菌肽合成速率為33 U/(mL·h)。菌體快速生長(zhǎng)至18 h，之后趨于穩(wěn)定，并在21 h達(dá)到峰值35×109CFU/mL。21～24 h，還原糖基本耗完，菌體于24 h自溶。因此，應(yīng)在21 h之前開(kāi)始補(bǔ)料，以維持細(xì)胞代謝和桿菌肽的合成。

2.2 發(fā)酵策略2(pH耦合補(bǔ)料)對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

在發(fā)酵策略1中，21 h后還原糖基本耗完(圖1)，碳源不足使氨基酸脫氨基作用加強(qiáng)，導(dǎo)致pH上升過(guò)快，菌體自溶，影響桿菌肽合成[17]。因此采用階梯控制pH的方式來(lái)耦合流加葡萄糖，延緩pH上升速度的同時(shí)補(bǔ)充碳源。另外，有機(jī)氮源對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝也是必不可少的，并且富含桿菌肽合成的前體氨基酸。WANG等[18]研究了豆粕、菜籽餅、芝麻餅粉、花生餅粉等氮源對(duì)桿菌肽合成的影響，發(fā)現(xiàn)豆粕中氨基酸種類豐富，是桿菌肽發(fā)酵過(guò)程中的最佳單一氮源。但是豆粕在發(fā)酵過(guò)程中分解較為緩慢，所以考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基中已有的速效氮源-玉米漿混合使用。在18～20 h補(bǔ)入玉米漿和豆粕，形成發(fā)酵策略2。發(fā)酵過(guò)程中桿菌肽效價(jià)、生物量、pH、還原糖變化如圖2所示。

圖2 發(fā)酵2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.2 Influences of fermentation 2 on cell growth and bacitracin synthesis

桿菌肽效價(jià)持續(xù)合成至30 h達(dá)到峰值(1 006 U/mL)，平均合成速率為33.5 U/(mL·h)。菌體生物量在27 h達(dá)到峰值(42×109CFU/mL)后發(fā)生了自溶。糖質(zhì)量濃度在18～24 h快速下降(8.7～3.1 g/L)，但由于18～22 h的pH值<設(shè)定值，期間未補(bǔ)入葡萄糖。pH耦合補(bǔ)糖期間(22～28 h)的葡萄糖質(zhì)量濃度維持在3 g/L左右，效價(jià)最高點(diǎn)(30 h)還原糖質(zhì)量濃度為2.6 g/L。與發(fā)酵1相比，保持桿菌肽平均合成速率不變，合成時(shí)間延長(zhǎng)了6 h，效價(jià)提高了26.9%。

2.3 發(fā)酵策略3對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

作為十二環(huán)肽分子，發(fā)酵過(guò)程中氮源的充分供給是桿菌肽有效合成的基礎(chǔ)，由于發(fā)酵2在18 h補(bǔ)充氮源后效價(jià)得到明顯提升，于是在發(fā)酵2的基礎(chǔ)上，繼續(xù)加大氮源的補(bǔ)入量，形成了補(bǔ)料策略3。發(fā)酵過(guò)程中桿菌肽效價(jià)、生物量、pH、還原糖的變化如圖3所示。

圖3 發(fā)酵3對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.3 Influences of fermentation 3 on cell growth and bacitracin synthesis

桿菌肽效價(jià)持續(xù)合成至32 h達(dá)到峰值958 U/mL，比發(fā)酵2減少了4.8%。菌體生物量24 h達(dá)到峰值40×109CFU/mL，與發(fā)酵2峰值生物量相當(dāng)。葡萄糖質(zhì)量濃度在18～24 h快速下降(8.5～3.6 g/L)，之后一直維持低位。通過(guò)增加氮源補(bǔ)入量，并沒(méi)有進(jìn)一步提高桿菌肽效價(jià)，可能是因?yàn)榧哟蟮吹难a(bǔ)入，增加了菌體分解和轉(zhuǎn)運(yùn)大分子蛋白質(zhì)的負(fù)擔(dān)，加速了能量的消耗[19，22]。另外，氮源補(bǔ)入量增加而碳源的補(bǔ)加量并未相應(yīng)調(diào)整，導(dǎo)致碳氮源比例失衡，也影響了氮源的利用效率[20]，此時(shí)桿菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白bcrABC也可能被抑制[23-24]。最終桿菌肽效價(jià)只有發(fā)酵2的95%。

2.4 發(fā)酵策略4(間歇補(bǔ)料)對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

發(fā)酵3效價(jià)低于發(fā)酵2，說(shuō)明一味提高氮源濃度會(huì)導(dǎo)致碳氮比失衡，從而影響桿菌肽的合成[25-26]。而采用pH耦合流加葡萄糖的方式，無(wú)法在pH較低時(shí)補(bǔ)加葡萄糖。于是以發(fā)酵2為基礎(chǔ)，基于18～24 h葡萄糖質(zhì)量濃度降低5.6 g/L，以及發(fā)酵3在18 h后葡萄糖供給不足的現(xiàn)象，采用間歇補(bǔ)料的方式，在18～30 h每3 h補(bǔ)入5.6 g/L的葡萄糖(200 mL的75%葡萄糖溶液/3 h)，形成發(fā)酵策略4(間歇式補(bǔ)料),見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.4 Influences of fermentation 4 on cell growth and bacitracin synthesis

如圖4所示，菌體生物量持續(xù)合成至27 h并達(dá)到峰值56.8×109CFU/mL，比發(fā)酵2提高了35.2%，和發(fā)酵2相比，以200 mL/3 h補(bǔ)入葡萄糖的方式更能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但生物量過(guò)高后，菌體維持代謝所需要的葡萄糖、氮源以及溶氧等無(wú)法得到保障，營(yíng)養(yǎng)和能量供應(yīng)受限，開(kāi)始大量自溶[12]。桿菌肽效價(jià)在30 h達(dá)到峰值(1 070 U/mL)，比發(fā)酵2和發(fā)酵3分別提高了6.4%和11.7%，桿菌肽平均合成速率為35.7 U/(mL·h)，略高于發(fā)酵2。與發(fā)酵2相比，雖然發(fā)酵過(guò)程中多補(bǔ)入了450 g葡萄糖(其中18～21 h補(bǔ)入300 g)，但葡萄糖并沒(méi)有在胞外積累。18～24 h葡萄糖質(zhì)量濃度從8.8 g/L降到3 g/L，之后維持低位。

2.5 發(fā)酵策略5(間歇補(bǔ)料-罐壓控制)對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

根據(jù)圖1～4試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)條件下桿菌肽發(fā)酵峰值細(xì)胞數(shù)可達(dá)百億級(jí)CFU/mL，對(duì)溶氧的需求極大。而由圖5可知,18 h補(bǔ)料后溶氧降為0，因此推測(cè)DO不足使得氧化磷酸化供能效率低，可能是桿菌肽效價(jià)無(wú)法繼續(xù)有效合成的原因。于是基于發(fā)酵4，在24 h將罐壓從0.03 MPa提高到0.05 MPa，研究其對(duì)24 h前后生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響(圖5)。

圖5 發(fā)酵5對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.5 Influences of fermentation 5 on cell growth and bacitracin synthesis

如圖5所示，24 h罐壓提高到0.05 MPa，桿菌肽效價(jià)持續(xù)合成至30 h達(dá)到峰值(1 118 U/mL)，比發(fā)酵4提高了4.5%，說(shuō)明提高溶氧對(duì)桿菌肽合成有積極的影響。但提高溶氧對(duì)生物量的影響不明顯，菌體生物量在27 h達(dá)到峰值(55.6×109CFU/mL)后的變化趨勢(shì)和峰值濃度都和發(fā)酵4基本一致，說(shuō)明細(xì)胞數(shù)在峰值條件下，能量供應(yīng)及碳源不足可能與菌體自溶有關(guān)。

18～24 h葡萄質(zhì)量糖濃度從8.2 g/L降到2.3 g/L，變化趨勢(shì)與發(fā)酵4一致。另外，18 h補(bǔ)入氮源和葡萄糖后，DO即從14%降為0并一直維持至26 h左右，并沒(méi)有因24 h升罐壓而立即升高。期間大量碳源和氮源被消耗，菌體代謝活躍。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)和碳氮源的消耗，碳源不足可能引起了細(xì)胞氧化磷酸化的耗氧降低，使DO于26 h開(kāi)始回升，并于27 h達(dá)到55%。此時(shí)桿菌肽效價(jià)(1 040 U/mL)比發(fā)酵4(975 U/mL)提高了7%。隨著27 h間歇補(bǔ)料(200 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%葡萄糖)，DO再次被大量消耗而跌為0，說(shuō)明26 h時(shí)碳源供應(yīng)確實(shí)處于不足狀態(tài)，使氧化磷酸化對(duì)溶氧的消耗減少。

30 h間歇補(bǔ)料后，由于此時(shí)細(xì)胞數(shù)只有27 h的61%，對(duì)碳源的需求減少。仍按200 mL/3 h的葡萄糖補(bǔ)入量對(duì)于此時(shí)(30 h)的細(xì)胞而言，可能已經(jīng)過(guò)量，CcpA被激活[10]，氧化磷酸化作用被抑制[9]，菌體對(duì)氧的利用速率反而減小，因而DO沒(méi)有像27 h那樣出現(xiàn)跌0的情況；

另外，溢流代謝被激活，大量的小分子有機(jī)酸如乙酸被合成[8]，引起pH在發(fā)酵后期由8.7下降至8.4，補(bǔ)入的葡萄糖通過(guò)溢流代謝僅僅維持了細(xì)胞活性，但并沒(méi)有促進(jìn)桿菌肽效價(jià)的合成。

2.6 發(fā)酵策略6(間歇-DO耦合補(bǔ)料)對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

發(fā)酵4和5中菌體生物量在27 h分別達(dá)到了56.8×109CFU/mL和55.6×109CFU/mL，比發(fā)酵1(未補(bǔ)料)提高了60%左右，但高菌體量也激化了能量供應(yīng)的矛盾。至30 h時(shí)，細(xì)胞又自溶了40%左右，這也造成了碳氮源的浪費(fèi)。而且，這種間歇補(bǔ)料的方式在25～26 h溶氧開(kāi)始回升時(shí)并不能及時(shí)補(bǔ)入葡萄糖；而在30 h菌體自溶后對(duì)碳源需求量減小時(shí)，又補(bǔ)入了過(guò)量的碳源，所以在24 h后應(yīng)采用溶氧耦合的方式根據(jù)細(xì)胞對(duì)碳源的需求補(bǔ)入葡萄糖，形成發(fā)酵策略6(圖6)。

圖6 發(fā)酵6對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.6 Influences of fermentation 6 on cell growth and bacitracin synthesis

如圖6所示，菌體生物量在24 h即達(dá)到峰值46×109CFU/mL，和發(fā)酵5在24 h的菌體生物量相當(dāng)(47.6×109CFU/mL)，但比其峰值生物量減少了17%。雖然菌體在24 h后就逐漸自溶，但桿菌肽的合成速率沒(méi)有受到影響，進(jìn)一步說(shuō)明桿菌肽的合成不需要維持菌體的高生物量。

24 h開(kāi)始葡萄糖耦合DO(35%)補(bǔ)料策略，由于24～27 h的DO一直低于35%，因而期間未補(bǔ)入葡萄糖。葡萄糖質(zhì)量濃度從18～24 h快速下降(7.7～3 g/L)，然后一直維持在2.3 g/L左右。

桿菌肽效價(jià)近線性上升至30 h的峰值濃度1 123 U/mL，與發(fā)酵5基本一樣，但是補(bǔ)糖量總計(jì)500 g，比發(fā)酵5補(bǔ)糖量(750 g)減少了33.3%，節(jié)約了成本。而且這種基于DO耦合的補(bǔ)料方式滿足了細(xì)胞對(duì)DO-糖代謝匹配的需求，桿菌肽對(duì)糖的得率系數(shù)(YP/S)提高了22.7%(表1)。

2.7 發(fā)酵策略7(間歇-DO耦合-二次氮源補(bǔ)料)對(duì)LC菌株生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

鑒于發(fā)酵6和發(fā)酵5的試驗(yàn)結(jié)果，考慮到桿菌肽合成不僅與糖和DO有關(guān)，更是涉及到碳-氮-氧的綜合因素，因此，在發(fā)酵6的基礎(chǔ)上，于24 h二次補(bǔ)入氮源(豆粕250 g、玉米漿125 g)形成發(fā)酵策略7，考察其對(duì)桿菌肽合成的影響。

如圖7所示，桿菌肽效價(jià)持續(xù)合成至30 h,達(dá)到峰值1 220 U/mL，比發(fā)酵6提高了9.1%，說(shuō)明24 h后，氮源不足是影響桿菌肽合成的另一個(gè)重要因素。另外，雖然生物量于24 h達(dá)到峰值(45×109CFU/mL)后自溶，但是27 h時(shí)細(xì)胞僅自溶了11%，相比于發(fā)酵6(自溶率33%)降低了66%。說(shuō)明綜合匹配碳-氮-氧3個(gè)關(guān)鍵因素的補(bǔ)料方式能有效地維持細(xì)胞在發(fā)酵中后期的代謝活性，形成了基于細(xì)胞生理需求的發(fā)酵策略，突破了有關(guān)葡萄糖不適宜作為桿菌肽補(bǔ)料碳源的認(rèn)知，并提高了桿菌肽的合成效率[40.67 U/(mL·h)]，比相關(guān)報(bào)道[14]的桿菌肽合成效率[29 U/(mL·h)]提高了40.3%。

圖7 發(fā)酵7對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

Fig.7 Influences of fermentation 7 on cell growth and bacitracin synthesis

為了進(jìn)一步分析補(bǔ)料策略對(duì)桿菌肽合成的影響，對(duì)發(fā)酵1～7進(jìn)行了總結(jié)，相關(guān)參數(shù)如表1所示。

表1 所有試驗(yàn)批次相關(guān)參數(shù)情況

注：效價(jià)為發(fā)酵過(guò)程中桿菌肽的最高效價(jià)；生物量為發(fā)酵過(guò)程中菌體的最高生物量；YP/S是糖對(duì)新增桿菌肽的得率系數(shù)，糖質(zhì)量=效價(jià)達(dá)到峰值時(shí)補(bǔ)入的糖質(zhì)量，新增效價(jià)=峰值效價(jià)-793，體積按27 L計(jì)，桿菌肽效價(jià)的質(zhì)量系數(shù)為65.8 U/mg；平均桿菌肽合成速率為從發(fā)酵開(kāi)始到桿菌肽達(dá)到最大值的平均桿菌肽合成速率。

如表1所示，發(fā)酵7桿菌肽效價(jià)最高，分別比發(fā)酵2、4提高了21%和14%。通過(guò)提高罐壓(增強(qiáng)氧的供應(yīng)強(qiáng)度)、補(bǔ)入碳源、氮源，桿菌肽效價(jià)比未補(bǔ)料(發(fā)酵1)提高了54%，平均桿菌肽合成速率提高了23.1%，節(jié)省了發(fā)酵時(shí)間。同時(shí)發(fā)酵7形成了基于細(xì)胞碳氮源和能量需求的補(bǔ)料模式，其YP/S(葡萄糖桿菌肽得率)達(dá)到了0.4 g/g，遠(yuǎn)高于其他補(bǔ)料試驗(yàn)批次。

3 結(jié)論

本研究探索了碳、氮源的間歇補(bǔ)加、pH耦合流加、氧的供應(yīng)強(qiáng)度以及DO耦合流加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和桿菌肽合成的影響。結(jié)論如下：

(1)pH耦合補(bǔ)料策略(18 h補(bǔ)入氮源、pH耦合補(bǔ)糖)的桿菌肽效價(jià)(1 006 U/mL)比對(duì)照提高了27%，但當(dāng)18～22 h需要增加葡萄糖供應(yīng)量時(shí)，卻存在因pH低于耦合設(shè)定值而無(wú)法補(bǔ)入的缺陷。

(2)間歇補(bǔ)料-罐壓控制策略(18 h補(bǔ)入氮源、間歇補(bǔ)糖、罐壓控制)的效價(jià)(1 118 U/mL)比對(duì)照提高了41%，也比pH耦合策略提高了11%，但存在發(fā)酵后期碳源不足時(shí)(溶氧迅速回升至55%)，葡萄糖無(wú)法及時(shí)補(bǔ)入、而細(xì)胞自溶后對(duì)糖需求量減少時(shí)仍按設(shè)定值補(bǔ)入的缺陷，即存在發(fā)酵后期補(bǔ)糖量與DO不匹配的問(wèn)題。

(3)采用間歇-DO耦合補(bǔ)料策略(18 h補(bǔ)入氮源、18～21 h間歇補(bǔ)糖，24 h以后耦合DO補(bǔ)料、罐壓控制)，可以避免18～24 h葡萄糖補(bǔ)入量不足和發(fā)酵后期葡萄糖補(bǔ)入過(guò)量的問(wèn)題，雖然桿菌肽效價(jià)為1 123 U/mL，但是由于補(bǔ)糖量比間歇補(bǔ)料-罐壓控制模式減少了33.3%，因此桿菌肽對(duì)糖的得率系數(shù)(YP/S)提高了22.7%。

(4)基于間歇-DO耦合補(bǔ)料策略于24 h二次補(bǔ)入氮源后，桿菌肽效價(jià)峰值達(dá)到了1 220 U/mL，比pH耦合、間歇補(bǔ)料-罐壓控制分別提高了21%和9.1%，平均桿菌肽合成速率為40.67 U/(mL·h)，突破了有關(guān)葡萄糖不適宜作為桿菌肽補(bǔ)料碳源的認(rèn)知，形成了基于細(xì)胞需求的綜合碳-氮-氧因素的補(bǔ)料策略，為工業(yè)化補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽提供了重要參考。