謝波 王永芳 宋莎莎 吳建兵 李新宇

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院藥物研究室，南京 210042；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院皮膚科，南京 210042

瘙癢是多種疾病伴有的共同癥狀［1-2］。目前，關(guān)于瘙癢的確切機制尚未完全清楚。研究顯示，神經(jīng)細胞中瞬時受體電位通道A1（TRPA1）、V1（TRPV1）和瘙癢關(guān)系緊密，其開放引起Ca2+細胞內(nèi)流，繼而引發(fā)瘙癢動作電位信號在神經(jīng)纖維上傳導(dǎo)［3］。TRPV1主要介導(dǎo)組胺性瘙癢，而TRPA1主要介導(dǎo)非組胺性瘙癢［4］，且后者和許多炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)。臨床上急性瘙癢的治療主要用抗組胺藥等，而慢性瘙癢迄今尚無標準或普遍有效的方法［5］。一些中藥方劑有改善瘙癢的作用，厚樸是其中的一種組分［6］。厚樸中的酚類物質(zhì)是其主要活性成分之一，和厚樸酚可抑制心肌細胞Ca2+內(nèi)流［7］，并抑制IgE 復(fù)合物引起的過敏反應(yīng)和減少化合物48/80 誘導(dǎo)的小鼠搔抓次數(shù)［8］。但和厚樸酚是否影響神經(jīng)細胞瞬時受體電位通道（TRP）的活化尚無報道。本研究通過兩種小鼠瘙癢模型觀察和厚樸酚的止癢作用，觀察和厚樸酚對TRPV1 和TRPA1 激動劑誘導(dǎo)的大鼠脊髓背根神經(jīng)元（DRG）細胞中Ca2+內(nèi)流的影響，初步探討和厚樸酚的止癢作用機制。

材料與方法

一、材料

1.動物：4 ～ 6 周齡清潔級雄性ICR 小鼠，體重25 ～35 g，來自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK 蘇2017-0007，實驗動物質(zhì)量合格證號201821683。給予標準飼料、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ～ 24 ℃，濕度55% ～ 60%，光照12 h白/黑夜循環(huán)，動物實驗許可證號SYXK（蘇2017-007）。24 h內(nèi)新生的SPF級雄性SD大鼠來自南京青龍山動物育種場，生產(chǎn)許可證號SCXK 蘇2017-0001，實驗動物質(zhì)量合格證號201828729，于環(huán)境溫度22 ～24 ℃下即刻進行后續(xù)的DRG分離。

2.主要試劑和儀器：和厚樸酚、氯苯那敏和組胺均為分析標準品，純度≥98%，均產(chǎn)自南京森貝伽生物科技公司。辣椒素（分析標準品，純度≥98%）產(chǎn)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣椒平（分析標準品，純度 ≥98%）產(chǎn)自加拿大Toronto Research Chemicals 公司。胎牛血清、Neurobasal 培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、B27 均產(chǎn)自美國Gibco 公司；L-谷氨酰胺產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司；膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)自美國PeproTech 公司；阿糖胞苷產(chǎn)自上海生工生物工程股份有限公司；異硫氰酸烯丙酯（AITC）、HC030031（TRPA1拮抗劑）、Fluo-3-AM（Ca2+熒光指示劑）產(chǎn)自美國Sigma-Aldrich 公司；Pluronic F-127（非離子型表面活性劑）、含Ca2+的HBSS產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱來自美國Thermo Fisher Scientific公司。

二、方法

本研究中所有動物實驗均遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院實驗動物管理委員會相關(guān)指南執(zhí)行。正式實驗前首先對和厚樸酚的安全劑量進行測試，確定將50 mg/kg（最大安全劑量）作為以下動物實驗的最大給藥劑量。

1.組胺誘導(dǎo)的小鼠瘙癢模型實驗：45 只ICR小鼠隨機分成7 組，包括正常對照組3 只，模型組、氯苯那敏組、3 種劑量和厚樸酚組（50.0、25.0、12.5 mg/kg，用5 g/L羧甲基纖維素鈉配制）和溶媒組每組7只。小鼠頸背部剃毛（2 cm×2 cm）后，和厚樸酚組用不同濃度和厚樸酚灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理氯化鈉溶液灌胃，溶媒組給予5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，氯苯那敏組給予氯苯那敏5.0 mg/kg（用無菌生理氯化鈉溶液配制）灌胃。24 h后，正常對照組在頸部剃毛區(qū)皮內(nèi)注射100 μl生理氯化鈉溶液，其余各組注射100 μl（20 mmol/L）組胺。隨后將每只小鼠單獨置于觀察籠中，人工計數(shù)30 min內(nèi)小鼠后爪搔抓注射部位的次數(shù)［9］。

2.乙醚/丙酮/水（AEW）誘導(dǎo)的小鼠瘙癢模型實驗：28 只ICR 小鼠隨機分成6 組，其中正常對照組3 只，模型組、3 個劑量和厚樸酚組（50.0、25.0、12.5 mg/kg，用5 g/L 羧甲基纖維素鈉配制）和溶媒組每組5 只。所有小鼠頸背部剃毛；模型組、和厚樸酚組和溶媒組用乙醚∶丙酮（1∶1）擦拭剃毛區(qū)15 s后，用蒸餾水擦拭30 s，正常對照組用生理氯化鈉溶液擦拭，每天處理2 次，第5 天僅上午處理1 次，并在第4天時灌胃給藥，和厚樸酚組用不同濃度和厚樸酚灌胃，正常對照組給等量無菌生理氯化鈉溶液灌胃，溶媒組給予5 g/L 羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。24 h后將每只小鼠單獨置于觀察籠中，觀察并人工計數(shù)小鼠后爪30 min內(nèi)搔抓造模區(qū)的次數(shù)［10］。

3.DRG細胞分離培養(yǎng)和Ca2+成像實驗：摘取新生SD 大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)，用0.25%Ⅰ型膠原酶消化后按5×104/ml 接種至含有Neurobasal 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的35 mm 玻璃底培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后更換成含2%胎牛血清、2%B27、0.1 g/L L-谷氨酰胺、10 μg/L 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和5 μmol/L 阿糖胞苷的Neurobasal培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5 d［11］。將培養(yǎng)所得的DRG 細胞分成6 組：辣椒素或AITC 誘導(dǎo)的模型組、辣椒平［500 μmol/L，采用二甲基亞砜（DMSO）溶解并用Hanks 平衡鹽溶液（HBSS）稀釋］或HSC030031（10 μmol/L）組、溶媒組、3 種濃度和厚樸酚組（7.81、15.63、31.25 mg/L，用DMSO溶解并用培養(yǎng)基稀釋）。各組細胞棄培養(yǎng)基，用HBSS洗滌2次。加300 μl Ca2+熒光指示劑Fluo-3-AM/Pluronic F-127，5%CO2、37 ℃下孵育30 min后，模型組加入65 μl HBSS，辣椒平、HC030031以及各和厚樸酚組則用HBSS將藥液稀釋至設(shè)定終濃度后各加65 μl，溶酶組用5‰DMSO 溶液同法處理，激光掃描共聚焦顯微鏡下確定視野，每15 秒拍攝1 張圖片，連續(xù)拍攝20張，且在第1和第2張圖片的拍攝間隙將65 μl 辣椒素（1 000 μmol/L，DMSO 溶解并用 HBSS 稀釋）或AITC（200 μmol/L，DMSO 溶解并用HBSS 稀釋）加至平皿中［12］。統(tǒng)計每張照片的相對熒光強度（F），做相對熒光強度-時間曲線，計算相對熒光強度變化率（△F/F0），ΔF=Fmax-F0［12］，F(xiàn)max為熒光強度最大值，F(xiàn)0為熒光強度初始值。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS 20.0 軟件進行分析。搔抓次數(shù)結(jié)果以表示，通過單因素方差分析和Dunnet-t檢驗進行比較，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、和厚樸酚對組胺和AEW誘導(dǎo)的小鼠瘙癢模型搔抓次數(shù)的影響

在組胺瘙癢模型中，各組間搔抓次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=40.62，P＜ 0.001），見圖1A。與正常對照組比較，組胺模型組的搔抓次數(shù)顯著增多（t=3.59，P=0.004）。與組胺模型組相比較，50.0 mg/kg和25.0 mg/kg 和厚樸酚組的搔抓次數(shù)均明顯減少（t值分別為3.48、3.49，P值均為0.003），對瘙癢的抑制率分別為61.82%和60.65%；5.0 mg/kg 氯苯那敏組亦明顯減少（t=2.68，P=0.016），而組胺模型組與12.5 mg/kg 和厚樸酚組（t=2.01，P=0.062）和溶媒組（t=0.34，P=0.737）相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同劑量和厚樸酚對組胺（1A）和乙醚/丙酮/水（1B）誘導(dǎo)的小鼠瘙癢模型搔抓次數(shù)的影響 NC：正常對照組；MC：模型組；SC：溶媒組；CH：氯苯那敏組；Hon1 ～ Hon3：分別為和厚樸酚50.0、25.0、12.5 mg/kg組。a：P＜0.01；b：P＜0.05

在AEW 瘙癢模型中，各組間搔抓次數(shù)差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.12，P＜0.001）。見圖1B。與正常對照組比較，AEW 模型組的搔抓次數(shù)顯著增多（t=6.99，P＜ 0.001）。與AEW模型組比較，50 mg/kg和厚樸酚組搔抓次數(shù)顯著減少（t= 0.45，P=0.009），對瘙癢的抑制率為42.89%；AEW 模型組與25.0 和12.5 mg/kg 和厚樸酚組（t=1.00，P=0.343；t=0.24，P=0.813）以及溶媒組（t=0.45，P=0.665）相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

二、和厚樸酚對辣椒素誘導(dǎo)的DRG細胞TRPV1通道開放后Ca2+內(nèi)流的影響

大鼠DRG 細胞原代分離、培養(yǎng)后，在Ca2+熒光指示劑Fluo-3-AM/Pluronic F-127處理下，用辣椒素激活TRPV1通道后，各組熒光強度見圖2、3。模型組在加入辣椒素30 ～45 s 后即出現(xiàn)相對熒光強度峰值，△F/F0超過1。隨著時間延長（約60 s后），熒光強度緩慢減弱，165 s后迅速減弱，300 s時接近原始水平。45 s時模型組細胞熒光亮度明顯高于15 s。用15.63、31.25 mg/L和厚樸酚處理后均未檢測到任何熒光強度峰。7.81 mg/L 和厚樸酚處理后，辣椒素誘導(dǎo)約45 s時雖然出現(xiàn)相對熒光強度峰，但比模型組大約減弱一半。溶媒組在約45 s 時出現(xiàn)的峰值略低于模型組。辣椒平組Ca2+內(nèi)流明顯抑制，未見熒光強度峰值。

圖2 不同濃度和厚樸酚處理對辣椒素誘導(dǎo)的大鼠脊髓背根神經(jīng)元細胞瞬時受體電位通道V1 通道開放后Ca2+內(nèi)流的影響 ΔF/F0：相對熒光強度變化率，其值越大表明與初始值相比相對熒光強度升高越多

圖3 不同處理組大鼠脊髓背根神經(jīng)元細胞在辣椒素誘導(dǎo)后不同時間點的熒光強度

三、和厚樸酚對AITC誘導(dǎo)的DRG細胞TRPA1通道開放后Ca2+內(nèi)流的影響

見圖4、5。模型組在加入AITC 30 ～ 45 s 后即出現(xiàn)相對熒光強度峰值，△F/F0超過0.5；約60 s后，熒光強度緩慢減弱，300 s時接近原始值；45 s時細胞熒光亮度明顯高于15 s時。31.25 mg/L和厚樸酚組未檢測到任何熒光強度峰，15.63 和7.81 mg/L和厚樸酚組在AITC誘導(dǎo)約45 s時雖然出現(xiàn)相對熒光強度峰值，但比模型組大約減弱2/3和1/3。給予TRPA1 抑制劑HC030031 處理后未見熒光強度峰值。

討 論

目前對慢性瘙癢的治療效果常不理想［13］，TRPV1 和 TRPA1 是介導(dǎo)瘙癢的兩種受體通道［14］，其開放后Ca2+的細胞內(nèi)流與瘙癢動作電位在神經(jīng)纖維上的傳導(dǎo)、釋放瘙癢信號相關(guān)。

圖4 不同濃度和厚樸酚處理對異硫氰酸烯丙酯誘導(dǎo)的大鼠脊髓背根神經(jīng)細胞瞬時受體電位通道A1通道開放后Ca2+內(nèi)流的影響 ΔF/F0：相對熒光強度變化率，其值越大表明與初始值相比相對熒光強度升高越多

圖5 不同處理組大鼠脊髓背根神經(jīng)元細胞在異硫氰酸烯丙酯誘導(dǎo)后不同時間點的熒光強度

中藥厚樸來源于木蘭科植物厚樸的干皮、根皮及枝皮，和厚樸酚是厚樸的活性成分之一。我們在組胺誘導(dǎo)的小鼠瘙癢模型中觀察到和厚樸酚具有抑制瘙癢的作用（50 mg/kg 劑量下抑制率為61.82%）；在建立的大鼠原代DRG細胞TRPV1通道活化模型中，通過Ca2+成像實驗發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能明顯抑制TRPV1 受體激動劑辣椒素誘導(dǎo)的Ca2+細胞內(nèi)流，提示其阻斷組胺性瘙癢可能與對TRPV1 通道的作用有關(guān)。AEW瘙癢模型可被用作觀察非組胺性刺激誘導(dǎo)的瘙癢［10］。本研究中和厚樸酚對AEW瘙癢模型亦有一定的抑制作用（50 mg/kg劑量時抑制率為42.89%），同時對TRPA1 受體激動劑AITC誘導(dǎo)的Ca2+細胞內(nèi)流亦有明顯抑制，提示和厚樸酚對抗非組胺性瘙癢的作用可能與TRPA1通道活化受阻有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，和厚樸酚對組胺因素和非組胺因素引起的瘙癢均有抑制作用，同時能抑制大鼠DRG細胞TRPV1和TRPA1通道活化后Ca2+細胞內(nèi)流，提示可能影響后續(xù)的瘙癢信號傳導(dǎo)。以上結(jié)果提示，和厚樸酚在對抗瘙癢方面具有一定的潛在價值，其對TRP通道分子靶點的作用以及更多的組織學(xué)聯(lián)系值得進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突