方程，杜海，徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

大曲是中國(guó)白酒發(fā)酵所特有的糖化劑和發(fā)酵劑，它是在開(kāi)放式環(huán)境中，通過(guò)自發(fā)的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)而來(lái)，并且其生產(chǎn)原料通常是未經(jīng)滅菌處理的小麥、大麥和/或豌豆混合物[1]，因此大曲中包含多種類型的微生物，如細(xì)菌、酵母和絲狀真菌[1-2]。其中絲狀真菌對(duì)白酒的發(fā)酵至關(guān)重要，因?yàn)榻z狀真菌能夠分泌大量的水解酶類，可以將原料中的大分子物質(zhì)水解成小分子的肽類、單糖等，從而為后續(xù)的酒精發(fā)酵提供能量物質(zhì)[3]。

從分類學(xué)上來(lái)看，絲狀真菌是一類多樣性非常復(fù)雜的真核微生物，并且許多絲狀真菌的生長(zhǎng)條件尚不明確，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法很難全面了解大曲中絲狀真菌的物種多樣性，因此需要借助未培養(yǎng)的方法。近年來(lái)興起的高通量測(cè)序技術(shù)可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地測(cè)序，使得更加深入研究微生物的多樣性成為可能[4]，因此該技術(shù)也迅速在食品微生物領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。例如，喬曉梅等[5]利用高通量測(cè)序?qū)η逑愦笄婢郝浣Y(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，在微生物物種水平上，中溫大曲包含米根霉(Rhizopusoryzae)、淀粉絲菌(Amylomycesrouxii)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、橫梗霉(Lichtheimia)和傘枝犁頭霉(Lichtheimiacorymbifera)、傘形卷霉等多種絲狀真菌[5]。夏玙等[6]同樣利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，中高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)絲狀真菌屬主要為嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、根毛霉屬(Rhizomucor)和曲霉菌屬(Aspergillus)3種。除此以外，還觀察到了一些低豐度的Byssochlamys、Rhizopus、Monascus、Penicillium、Lichtheimia、Rasamsonia等絲狀真菌屬。最近，筆者通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合微生物溯源進(jìn)行研究還發(fā)現(xiàn)，大曲中的部分絲狀真菌，如A.flavus和A.oryzae等，還能進(jìn)入到白酒的酒精發(fā)酵過(guò)程[7-8]，說(shuō)明絲狀真菌除了產(chǎn)生各種水解酶類，可能還具有其他功能。

最近的研究表明，絲狀真菌具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力，并且許多次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要的藥理學(xué)活性[9]，因而近年來(lái)許多研究者試圖從一些絲狀真菌豐富的棲息地(深海[10]、植物內(nèi)生真菌[11]和海綿等[12])中研究這類微生物的物種多樣性，并挖掘具有生物活性的天然產(chǎn)物。且大曲中含有豐富的絲狀真菌資源，這些絲狀真菌可能也具有合成多種天然產(chǎn)物的潛力。但是，目前系統(tǒng)性地研究大曲中絲狀真菌的物種多樣性及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成潛力較少。

本研究的目的有2個(gè)：(1)利用高通量測(cè)序的方法比較中溫、中高溫和高溫3種大曲中絲狀真菌的菌群結(jié)構(gòu)差異；(2)結(jié)合純培養(yǎng)的方法研究大曲中絲狀真菌的物種多樣性及其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力。本研究為大曲來(lái)源的絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力研究奠定理論基礎(chǔ)，為與大曲相關(guān)的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 大曲樣本采集

本研究使用的大曲樣本均為成品曲粉(表1)，取樣時(shí)，每種樣本均使用無(wú)菌自封袋取500 g，并立即存放于-80 ℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所使用的大曲樣本

1.1.2 試劑與設(shè)備

麥芽提取物瓊脂(malt extract agar，MEA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)、玉米粉瓊脂(corn meal agar，CMA)、沙氏葡萄糖瓊脂(sabouraud dextrose agar，SDA)和察氏瓊脂(czapek dox agar，CDA)，青島海博生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒(DP305)、1×TaqPCR Mastermix、DNA純化試劑盒(DP204)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，天根生化科技(北京)有限公司；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司。

Illumina Miseq PE300二代測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；HWY-2112型恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力滅菌鍋、SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；Nanodrop 2000/2000C 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PowerPac通用電泳儀電源、C1000 Touch PCR儀、CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀、ChemiDoc成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 DNA提取

大曲微生物宏基因組的提取參考本研究室的前期研究[13-14]。

1.3 PCR擴(kuò)增、Illumina Miseq測(cè)序和高通量數(shù)據(jù)分析

通過(guò)真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)1區(qū)研究真菌種群結(jié)構(gòu)，利用ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)為引物對(duì)ITS1區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠回收、定量后，依據(jù)所需數(shù)據(jù)深度進(jìn)行文庫(kù)制備，然后在Illumina Miseq PE300平臺(tái)上進(jìn)行2×150 bp雙端測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Qiime (v1.8.0)處理后，再對(duì)序列進(jìn)行拼接，并根據(jù)接頭序列將不同樣本進(jìn)行分類。隨后依次去除序列上的接頭序列、標(biāo)簽和引物序列，并去除低質(zhì)量序列和嵌合體序列，得到優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)(clean data)。再利用UCLUST將全部?jī)?yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)按照97%序列相似度聚類，進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)劃分，提取代表序列，并得到OTU表[15]。將OTU代表序列與NCBI nt數(shù)據(jù)庫(kù)和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)(v 6.0)進(jìn)行比對(duì)[16]，獲得OTU物種分類信息。

“我這橫刀也不同意！”胖捕快走到兩排桌子之間，擺出了橫刀十三式的起手式，鐵氣激袖，刀光生寒，令他由怕老婆女兒的班頭，頓時(shí)變成威嚴(yán)肅殺、令人可畏的名捕。

1.4 熒光定量PCR

真菌18S rRNA基因的相對(duì)豐度定量參考ROUSK等[17]的研究。引物Fung(5′-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′)和NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)用于擴(kuò)增真菌18S rRNA基因部分序列[18]。通過(guò)擴(kuò)增一系列濃度梯度的含有釀酒酵母18S rRNA基因全長(zhǎng)拷貝的質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)體系參考QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書。使用CFX96 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行所有qPCR反應(yīng)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃、2 min。

1.5 絲狀真菌的純培養(yǎng)

取10 g曲粉加入到盛有90 mL無(wú)菌生理鹽水的250 mL錐形瓶中，并在搖床中以200 r/min振蕩1 h。然后將大曲生理鹽水混合物稀釋至終濃度為1 g/L，取200 μL均勻涂布于5種不同的真菌培養(yǎng)基上，并放置于28、37 和50 ℃培養(yǎng)。每種大曲在不同培養(yǎng)基和溫度條件下重復(fù)3次。

1.6 絲狀真菌鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)純培養(yǎng)獲得的絲狀真菌的ITS全長(zhǎng)序列進(jìn)行擴(kuò)增[19]。50 μL的PCR反應(yīng)體系包括：1×Taq PCR Mastermix、0.5 μmol/L引物、50 ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物使用通用DNA純化試劑盒純化后進(jìn)行測(cè)序分析。利用NCBI BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)將獲得核酸序列進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)，并使用MEGA (version 6.0)軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[20]。最后將獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)iTOL進(jìn)行可視化[21]。

1.7 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶基因擴(kuò)增

通過(guò)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶表達(dá)基因進(jìn)行擴(kuò)增，研究大曲絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力。使用簡(jiǎn)并引物(表2)擴(kuò)增的次級(jí)代謝物合成基因包括非核糖體多肽類合成酶(non-ribosomal peptides synthase，NRPSs)、I型聚酮類合成酶(type I polyketide synthase，PKS I)、III型聚酮類合成酶(type III polyketide synthase，PKS III)、PKS-NRPS雜合類合成酶和萜烯類合成酶(terpene synthase，TPS)5種。25 μL的PCR反應(yīng)體系包括：1×Taq PCR Mastermix、0.5 μmol/L引物、100 ng基因組DNA。每種基因的擴(kuò)增包含1組陽(yáng)性對(duì)照和2組陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照使用包含上述所有5種基因的A.parasiticus(CGMCC 3.6155)基因組；陰性對(duì)照除了使用無(wú)菌水作為擴(kuò)增模板，還使用Saccharomycescerevisiae基因組作為擴(kuò)增模板，因?yàn)樵撐锓N基因組不含任何上述5種次級(jí)代謝物合成基因[22]。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

表2 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因及其簡(jiǎn)并引物

注：簡(jiǎn)并堿基符號(hào)：B=C/G/T；D=A/G/T；i=肌酐(inosine)；K=G/T；M=A/C；R=A/G；S=C/G；Y=C/T。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序比較不同大曲中絲狀真菌的群落結(jié)構(gòu)

通過(guò)利用高通量測(cè)序技術(shù)，在ZW、AGW和GW 3種大曲樣品中分別檢測(cè)到了217、235和207個(gè)真菌OTU。其中，絲狀真菌在3種大曲樣本中所占的比例穩(wěn)定在25.6%～26.4%(表3)，說(shuō)明絲狀真菌的物種比例在不同類型的大曲中非常穩(wěn)定，基本不受大曲類型的影響。

表3 大曲真菌及絲狀真菌多樣性分析

進(jìn)一步將豐度高于1%的OTU序列使用NCBI BLAST進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)，獲得OTU在種水平的物種分類信息。如圖1所示，不同樣本之間絲狀真菌的組成差異非常明顯。Aspergillus屬是絲狀真菌中主要的微生物屬，該屬在ZW、ZGW和GW樣本中比例分別為85%、58%和31%。Aspergillus屬是環(huán)境中廣泛存在的1種絲狀真菌，文獻(xiàn)報(bào)道該屬能高效產(chǎn)生葡糖淀粉酶(2 463±343 U/g)和α-淀粉酶(1 491±324U/g)[23]。

圖1 大曲中絲狀真菌種群結(jié)構(gòu)(種水平)

Fig.1 Taxonomic classification of filamentous fungal reads at species level based on ITS1 region

2.2 大曲中絲狀真菌定量分析

大曲中絲狀真菌的數(shù)量通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)確定。首先利用一系列濃度梯度的含有釀酒酵母18S rRNA基因全長(zhǎng)拷貝的質(zhì)粒建立RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2-A所示，良好的擴(kuò)增效率(97%，通過(guò)E=10-1/斜率-1計(jì)算而來(lái))和線性關(guān)系(R2=0.994 9)表明了標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。然后根據(jù)絲狀真菌的序列數(shù)占真菌總序列數(shù)的比例，計(jì)算出絲狀真菌在不同大曲中的數(shù)量。從圖2-B可以看出，ZW樣本有最多數(shù)量的真菌(1.73×107個(gè))和絲狀真菌(1.07×106個(gè))，GW樣本真菌(1.38×106個(gè))和絲狀真菌(2.08×105個(gè))最少，說(shuō)明大曲中真菌和絲狀真菌的數(shù)量隨大曲發(fā)酵最高溫度的升高而減少，原因可能是因?yàn)檩^少的微生物可以在高溫環(huán)境下存活。

a-RT-PCR定量曲線;b-真菌與絲狀真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)

圖2 RT-PCR結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)確定大曲中絲狀 真菌數(shù)量

Fig.2 Quantification of the filamentous fungi by using real- time PCR coupled with pyrosequencing

2.3 基于可培養(yǎng)的方法研究大曲中絲狀真菌的物種多樣性

本研究選擇GW樣本來(lái)研究絲狀真菌的物種多樣性，一方面，由于GW樣本中絲狀真菌序列數(shù)占真菌序列總數(shù)的比例最大，因而篩選到絲狀真菌的可能性更高；另一方面，來(lái)自極端環(huán)境的微生物產(chǎn)生天然產(chǎn)物的可能性更高。因?yàn)檫@些微生物可能是系統(tǒng)發(fā)育上全新的微生物，并且為了適應(yīng)獨(dú)特的環(huán)境，還可能存在全新的天然產(chǎn)物合成途徑[25]。

由于不同類型的絲狀真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求可能不同，因此為了獲得盡可能多的絲狀真菌物種，使用5種不同類型的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。在篩選過(guò)程中，對(duì)于具有相似形態(tài)和生長(zhǎng)特征的絲狀真菌，僅保留1株。最終共篩選獲得50株絲狀真菌(表4)，其中有45株是在28 ℃培養(yǎng)條件下獲得(PDA培養(yǎng)基24株，MEA培養(yǎng)基7株，CMA培養(yǎng)基3株，SDA培養(yǎng)基5株，CDA培養(yǎng)基6株)，在37 ℃培養(yǎng)條件下并未獲得絲狀真菌單菌落，剩下5株在50 ℃培養(yǎng)條件下獲得(PDA培養(yǎng)基3株，MEA培養(yǎng)基2株)。

進(jìn)一步對(duì)絲狀真菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，50株分離株大部分與已報(bào)道的菌株具有99%以上的相似度，除了PDA-7和PDA-16分別只有98%和97%的相似度，說(shuō)明PDA-7和PDA-16可能是分類上新的微生物種。這50株菌株由散囊菌目(Eurotiales)、毛霉目(Mucorales)、炭角菌目(Xylariales)和格孢菌目(Pleosporales)4個(gè)微生物目組成，共分為曲霉屬(Aspergillus)、紅曲霉屬(Monascus)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、橫梗霉屬(Lichtheimia)、根毛霉屬(Rhizomucor)、毛霉屬(Mucor)、節(jié)菱孢屬(Arthrinium)、鏈格孢屬(Alternaria)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)和Rasamsonia十個(gè)屬，其中Aspergillus屬絲狀真菌的種類最為豐富，共30株分離株屬于該微生物屬，隸屬于19個(gè)不同的種。

過(guò)去的研究曾采用單一培養(yǎng)基對(duì)高溫大曲中的絲狀真菌進(jìn)行過(guò)篩選，但是僅能獲得有限種類的絲狀真菌(P.variotii、A.oryzae、P.namyslowskii、R.microsporus、Microascuscirrosus、Monascuspurpureus、P.chrysogenum和A.terreus[23])。而本研究中，同樣在高溫大曲中，篩選鑒定出至少28個(gè)不同的絲狀真菌種，說(shuō)明大曲中絲狀真菌的物種豐富度可能被嚴(yán)重低估。

另外還發(fā)現(xiàn)，雖然大部分絲狀真菌分離株能在高通量測(cè)序結(jié)果中找到對(duì)應(yīng)的微生物屬，但仍然有少數(shù)絲狀真菌僅能通過(guò)純培養(yǎng)獲得，例如Mucor和Arthrinium屬的微生物，其原因可能是用于高通量測(cè)序的通用引物的選擇性和覆蓋范圍限制了對(duì)所有物種的完整表征[26]。

表4 基于純培養(yǎng)獲得的絲狀真菌的物種多樣性和分類群信息

基于以上結(jié)果可以說(shuō)明，大曲中絲狀真菌的物種豐富度可能被顯著低估，同時(shí)基于純培養(yǎng)的方法在目前微生物群落研究中仍然發(fā)揮著不可替代的作用。

2.4 大曲絲狀真菌來(lái)源的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因多樣性分析

為了進(jìn)一步探究大曲來(lái)源的絲狀真菌合成天然生物活性物質(zhì)的遺傳潛力，利用簡(jiǎn)并引物對(duì)篩選得到的50株絲狀真菌的NRPSs、TPS、PKS-NRPS、I型和III型PKSs 5種次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因進(jìn)行了擴(kuò)增。從圖3可以看出，50株分離株全部含有至少1個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因。其中48%的絲狀真菌(24株)含有所有靶基因；32%(16株)含有4個(gè)靶基因；16%(8株)含有3個(gè)靶基因；2%(1株)含有2個(gè)靶基因；2%(1株)僅含有1個(gè)靶基因。結(jié)果表明，大曲來(lái)源的絲狀真菌具有合成多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的遺傳潛力。

圖3 GW來(lái)源的絲狀真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因分布

Fig.3 Phylogenetic tree of filamentous fungi derived from GW coupled with presence of genes involved in synthesis of bioactive compounds

注：不同的形狀代表不同的次級(jí)代謝物合成基因；填充的形狀表示含有2個(gè)以上的SM合成基因，無(wú)填充的形狀表示僅含有1個(gè)SM合成基因，空缺代表沒(méi)有相應(yīng)的SM合成基因。

另外，與前人研究發(fā)現(xiàn)真菌含有多種PKS基因的結(jié)果相一致[27]，本研究幾乎在所有分離株中都觀察到至少1個(gè)I型和III型PKSs基因。文獻(xiàn)報(bào)道，PKS基因參與多種天然產(chǎn)物的合成，例如，I型PKS基因能夠合成大量具有藥理學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括紅霉素、免疫抑制劑FK506以及抗寄生蟲的阿維菌素類化合物[28]，因此近年來(lái)PKS基因受到了廣泛的關(guān)注[25, 27]。

相同微生物種的絲狀真菌也有可能含有不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因，如Lichtheimiaramosa(PDA-10、CMA-21和CDA-22)和A.sydowii(CDA-3、CDA-4、PDA-17、SDA-43和MEA-49)。YU等[12]從海綿中篩到的8株Aspergillusterreus，也顯示出能夠產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物的現(xiàn)象。造成這一現(xiàn)象的原因可能是真菌的次級(jí)代謝基因簇通過(guò)多次重排、重復(fù)或丟失而迅速進(jìn)化[29]。大曲中的絲狀真菌在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，可能丟失或者獲得了一些次級(jí)代謝基因。

為驗(yàn)證真菌天然產(chǎn)物的合成，仍需通過(guò)模擬大曲發(fā)酵環(huán)境對(duì)分離株進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)鑒定和細(xì)胞毒性測(cè)試，以證實(shí)大曲來(lái)源的絲狀真菌是否能夠合成天然生物活性物質(zhì)。

3 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序手段對(duì)3種不同類型的成品曲中的絲狀真菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，觀察到Thermomyces和Aspergillus屬的豐度在不同類型的大曲中差異非常明顯，能用于區(qū)分不同類型的大曲；另外利用純培養(yǎng)的手段對(duì)高溫大曲中絲狀真菌進(jìn)行了篩選，共獲得了來(lái)自10個(gè)不同屬的50株絲狀真菌，表明大曲中絲狀真菌的物種豐富度被低估；進(jìn)一步對(duì)這50株絲狀真菌基因組中參與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫大曲來(lái)源的絲狀真菌具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成潛力。但是由于在大多數(shù)情況下，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因是沉默的，因此仍需有針對(duì)性的檢測(cè)大曲以及白酒中的生物活性成分，并分析這些物質(zhì)的微生物來(lái)源。綜合以上結(jié)論可以看出，大曲是一種優(yōu)良的微生物庫(kù)和基因庫(kù)，包含豐富的微生物資源和功能基因資源。