張蓉，王玉生，楊麗梅，萬方浩,2，張桂芬,2

基于種特異性COI標(biāo)記的西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系一步雙重快速鑒定技術(shù)

張蓉1，王玉生1，楊麗梅3，萬方浩1,2，張桂芬1,2

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來入侵生物預(yù)防與控制研究中心，北京 100193；3北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 102602）

【】西花薊馬（）是世界性農(nóng)業(yè)和園藝作物害蟲，也是我國重要的對(duì)外對(duì)內(nèi)檢疫對(duì)象。西花薊馬具有兩個(gè)品系，即溫室品系（greenhouse race，GR）和羽扇豆品系（lupin race，LR），二者在寄主范圍、抗藥性、生存環(huán)境等方面均具有明顯差異，但外部形態(tài)相似，無法準(zhǔn)確鑒別?！尽恳晕骰ㄋE馬溫室品系和羽扇豆品系為靶標(biāo)，以田間常見的其他14種薊馬為參照，采用基于線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I，mtDNA COI）基因的種特異性（species-specific COI，SS-COI）PCR法，研究一步雙重品系快速檢測(cè)技術(shù)?！尽坎捎胢tDNA COI基因通用引物獲得西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系以及其他常見薊馬的COI序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果以及數(shù)據(jù)庫已公開數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)篩選獲得可同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)品系的特異性組合引物（TF6/GR32/LR12），其中TF6為品系通用上游引物，GR32為溫室品系特異性下游引物，LR12為羽扇豆品系特異性下游引物，其擴(kuò)增片段大小分別為溫室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp；對(duì)組合引物比例和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)，對(duì)組合引物的種/品系特異性和靈敏性/檢測(cè)閾值進(jìn)行檢驗(yàn)?！尽慨?dāng)組合引物TF6/GR32/LR12比例為1.0/0.2/0.8、退火溫度為44℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好。種/品系特異性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，該檢測(cè)技術(shù)僅對(duì)西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系具有擴(kuò)增能力，對(duì)田間常見的其他14種薊馬包括花薊馬（）、禾花薊馬（）、黃胸薊馬（）、大薊馬（）、棕櫚薊馬（）、煙薊馬（）、普通大薊馬（）、豆喙薊馬（）、草木樨近絹薊馬（）、蔗腹齒薊馬（）、稻簡(jiǎn)管薊馬（）、榕端寬管薊馬（）、榕母管薊馬（）和橫紋薊馬（）等不具有擴(kuò)增能力。靈敏性檢測(cè)結(jié)果顯示，該組合引物不僅對(duì)單一品系或混合品系的成蟲具有良好的擴(kuò)增效果，對(duì)單粒卵、1齡和2齡幼蟲以及預(yù)蛹和蛹均具有同樣的擴(kuò)增效能；對(duì)溫室品系的最低檢測(cè)閾值為35.90 pg·μL-1，相當(dāng)于1/10 240頭雌成蟲，對(duì)羽扇豆品系的最低檢測(cè)閾值為146.95 pg·μL-1，相當(dāng)于1/2 560頭雌成蟲；同時(shí)，對(duì)來自不同地域的同一品系不同單倍型的成蟲亦具有良好的擴(kuò)增效能?！尽拷⒌募夹g(shù)體系完全可以用于西花薊馬品系的快速鑒定及檢疫監(jiān)管，對(duì)有效阻截其進(jìn)一步傳播擴(kuò)散及靶向防控措施制定意義重大。

西花薊馬溫室品系；西花薊馬羽扇豆品系；一步雙重PCR；SS-COI標(biāo)記；品系特異性組合引物；快速鑒定

0 引言

【研究意義】西花薊馬（）又稱苜蓿薊馬，屬纓翅目（Thysanoptera）薊馬科（Thripidae）花薊馬屬（），是一種世界性檢疫性害蟲，也是我國重要的對(duì)外對(duì)內(nèi)檢疫對(duì)象。西花薊馬包括兩個(gè)品系，即溫室品系（greenhouse race，GR）和羽扇豆品系（lupin race，LR），二者在寄主植物范圍[1]、生存環(huán)境[2]、抗藥性[3]等方面均有明顯差異。相較于羽扇豆品系，溫室品系具有更廣的寄主植物范圍（溫室品系60余科，500余種[4-6]；羽扇豆品系18科，20余種[1,7-11]）、更強(qiáng)的殺蟲劑抗性[3]，更喜歡在溫暖干燥的環(huán)境下生存[2]，以及更強(qiáng)的繁殖能力和更快的發(fā)育速率[12]。西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系的快速檢測(cè)鑒定，對(duì)西花薊馬的檢疫監(jiān)管及其靶向性防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】西花薊馬原產(chǎn)于美國西北部[13]，是美國加州常見害蟲，之后隨花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及國際貿(mào)易活動(dòng)迅速擴(kuò)散，目前，在以色列[14]、南非[15]、馬來西亞[16]、日本[17]、澳大利亞[18]、韓國[19]、印度[20]等均有發(fā)生的報(bào)道。西花薊馬為多食性害蟲，寄主植物有60余科500多種，包括蔬菜、果樹、花卉及園林植物等，既可直接銼吸危害，亦可通過傳播植物病毒間接危害，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量以及花卉園林植物的觀賞價(jià)值，已成為一種世界性農(nóng)業(yè)和園藝作物害蟲[21-22]。2000年中國昆明國際花卉節(jié)上，我國首次在來自緬甸的盆景植物上檢疫到了西花薊馬[23]，2003年在北京市郊的溫室大棚中首次發(fā)現(xiàn)其嚴(yán)重危害辣椒[4]，目前已在我國北京、山東[24]、貴州[25]、湖南[26]、江蘇[27]、新疆[28]、西藏[29]、四川[30]及河北、山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、河南、云南、陜西、甘肅、寧夏[9,31]19個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)生危害。其中溫室品系在上述19個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)生危害，而羽扇豆品系目前僅在北京、山東、遼寧、吉林、黑龍江、云南、陜西、寧夏、甘肅9個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）有發(fā)現(xiàn)[8-9,31]。西花薊馬個(gè)體微小，雌成蟲體長(zhǎng)1.4—1.7 mm，雄成蟲體長(zhǎng)1—1.15 mm，且體色多變[21,32]。有研究認(rèn)為，深色型的西花薊馬更有可能是羽扇豆品系[1]。然而，鑒于煙薊馬（）的體色變化與溫度有關(guān)，溫度越低、體色越深[33]；因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為溫度應(yīng)該是昆蟲體色變化的主要誘因[34]。顯然，基于成蟲外部特征的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定法無法滿足植物檢疫和檢測(cè)監(jiān)測(cè)的基本需求，尤其當(dāng)樣本為幼體或殘?bào)w時(shí)?；趍tDNA COI[1-2,8-9,11,35]和COII基因[11]、rDNA 28S D2基因[1,8]，以及基于核蛋白編碼基因[1]等標(biāo)記技術(shù)，曾用于西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系的識(shí)別鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】然而上述標(biāo)記技術(shù)，或鑒定流程復(fù)雜、成本較高，或鑒定結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差。如基于COI和COII基因標(biāo)記的鑒定技術(shù)，需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育分析[1-2,24,29-31]；基于rDNA 28S D2基因的品系特異性檢測(cè)，雖然無需堿基序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析[1]，但實(shí)際應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)重復(fù)性差，無法擴(kuò)增出理想的品系特異性靶標(biāo)片段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系為靶標(biāo)，以田間常見的其他14種薊馬為參照，采用基于線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I，mtDNA COI）基因的種特異性（species-specific COI，SS-COI）PCR法，研究建立西花薊馬品系特異性一步雙重快速檢測(cè)技術(shù)體系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年7月至2019年2月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試蟲源

西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系為室內(nèi)飼養(yǎng)種群，田間常見的其他14種薊馬包括花薊馬（Frankliniella intonsa）、禾花薊馬（Frankliniella tenuicornis）、黃胸薊馬（Thrips hawaiiensis）、大薊馬（Thrips major）、棕櫚薊馬（Thrips palmi）、煙薊馬、普通大薊馬（Megalurothrips usitatus）、豆喙薊馬（Mycterothrips glycines）、草木樨近絹薊馬（Sussericothrips melilotus）、蔗腹齒薊馬（Fulmekiola serrata）、稻簡(jiǎn)管薊馬（Haplothrips aculeatus）、榕端寬管薊馬（Mesothrips jordani）、榕母管薊馬（Gynaikothrips ficorum）和橫紋薊馬（Aeolothrips fasciatus）均采自田間，具體信息詳見表1。

1.2 DNA提取

以西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系以及田間常見的其他14種薊馬為對(duì)象，取單頭雌成蟲，參照喬瑋娜等[36]的方法提取DNA，以20 μL超純水復(fù)溶，充分溶解后以超微量分光光度計(jì)（NanoPhotometerTMP330，Implen，Munich，Germany）測(cè)定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 COI基因擴(kuò)增與序列測(cè)定

分別以西花薊馬溫室品系、羽扇豆品系，以及上述14種其他薊馬共16種/品系薊馬DNA為模板，以DNA條形碼通用型引物L(fēng)CO1490（GGTCAACAAAT CATAAAGATATTGG），HCO2198（TAAACTTCAGG GTGACCAAAAAATCA）[37]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為710 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μL上樣緩沖液，以DNA Marker為參照，在含有染色劑Gel stain（北京全式金生物技術(shù)有限公司）的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離25 min（150 V），以凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTMXR+Imaging System Universal Hood II，Bio-Rad，USA）分析檢測(cè)結(jié)果；每種薊馬分別檢測(cè)10頭。電泳檢測(cè)質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物，直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向堿基序列測(cè)定。

表1 薊馬樣本信息

1.4 一步雙重品系特異性引物設(shè)計(jì)、篩選與體系優(yōu)化

DNAMAN（DNAMAN Version 9）比對(duì)分析顯示，西花薊馬兩個(gè)品系的堿基序列相似度為96.67%，堿基差異位點(diǎn)19個(gè)。以本研究獲得的其他14種薊馬以及數(shù)據(jù)庫中已公開的薊馬COI基因序列（包括西花薊馬所有單倍型）為參照，在兩個(gè)品系所有單倍型堿基序列相似度比較高的區(qū)段設(shè)計(jì)通用上游引物和通用下游引物各1條；然后，在兩個(gè)品系所有單倍型堿基序列差異位點(diǎn)比較集中且差異位點(diǎn)在同一品系不同單倍型間較保守的區(qū)段，分別靶向溫室品系和羽扇豆品系，設(shè)計(jì)6條品系特異性上游引物和3條品系特異性下游引物。即品系通用引物共計(jì)2條，其中品系通用上游引物1條，品系通用下游引物1條，分別命名為TF6和TR3。品系特異性引物共計(jì)18條，其中溫室品系特異性上游引物6條、下游引物3條，分別命名為GF1-GF6和GR1-GR3；羽扇豆品系特異性上游引物6條、下游引物3條，分別命名為L(zhǎng)F1-LF6和LR1-LR3；并據(jù)此構(gòu)建一步雙重PCR反應(yīng)體系。體系構(gòu)建時(shí)引物組合方式為，1條通用上游引物與2條特異性下游引物（溫室品系和羽扇豆品系各1條）或1條通用下游引物與2條特異性上游引物（溫室品系和羽扇豆品系各1條）組合，共計(jì)獲得組合45種。其中30種組合對(duì)兩個(gè)品系的擴(kuò)增片段大小基本一致，其混合擴(kuò)增產(chǎn)物無法在凝膠電泳上有效分離，不符合一步雙重PCR快速檢測(cè)的基本要求[38]，予以舍棄。對(duì)其余15種引物組合進(jìn)行品系特異性預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和引物優(yōu)化（基于特異性引物設(shè)計(jì)中GC含量需＞40%的原則，進(jìn)行AT→GC堿基轉(zhuǎn)換。優(yōu)化后品系特異性下游引物，溫室品系命名為GR32，羽扇豆品系命名為L(zhǎng)R12；優(yōu)化后品系特異性上游引物，溫室品系命名為GF62，羽扇豆品系命名為L(zhǎng)F52）以及再驗(yàn)證，對(duì)優(yōu)化后依然不能進(jìn)行品系特異性擴(kuò)增的引物組合予以舍棄，最終確定TF6/GR32/LR12為西花薊馬品系特異性一步雙重PCR檢測(cè)的最佳引物組合，其對(duì)溫室品系和羽扇豆品系的特異性擴(kuò)增片段大小分別為362和541 bp（表2）。然后，以該組合引物為靶標(biāo)進(jìn)行引物比例和退火溫度優(yōu)化。

表2 西花薊馬品系特異性引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

1.5 一步雙重品系特異性PCR檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化

為確定一步雙重品系特異性PCR檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系，對(duì)組合引物的比例和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化研究。PCR反應(yīng)體系為25 μL，引物組合共計(jì)11種，即TF6/GR32/LR12分別以1.0/0/1.0、1.0/0.1/0.9、1.0/0.2/0.8、1.0/0.3/0.7、1.0/0.4/0.6、1.0/0.5/0.5、1.0/0.6/0.4、1.0/0.7/0.3、1.0/0.8/0.2、1.0/0.9/0.1、1.0/1.0/0 μL的比例進(jìn)行組合（引物濃度為10 μmol·L-1），10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，梯度退火溫度（36—54℃）1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。電泳檢測(cè)方法同1.3。

1.6 品系特異性組合引物的種/品系特異性檢測(cè)

分別以西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系以及其他14種田間常見薊馬DNA為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)組合引物的種/品系特異性。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，最佳配比組合引物TF6/GR32/LR12共計(jì)2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，最佳退火溫度 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。電泳檢測(cè)方法同1.3。每種/品系薊馬分別檢測(cè)10頭。

1.7 品系特異性組合引物對(duì)不同蟲態(tài)的擴(kuò)增效果

以品系特異性組合引物為靶標(biāo)，以提取的單一品系不同蟲態(tài)（卵、1齡和2齡幼蟲、預(yù)蛹和蛹）與不同性別（雄成蟲、雌成蟲）DNA，以及混合品系（1﹕1）各蟲態(tài)/性別DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)方法同1.3。每種性別或蟲態(tài)分別檢測(cè)10頭。

1.8 品系特異性組合引物的檢測(cè)閾值

分別取兩個(gè)品系單頭雌成蟲DNA模板10 μL，以2倍遞減梯度稀釋至2-12倍，其中溫室品系初始DNA模板濃度為（18.38±5.40）×103pg·μL-1，最終稀釋濃度為4.49 pg·μL-1；羽扇豆品系初始DNA模板濃度為（18.81±5.71）×103pg·μL-1，最終稀釋濃度為4.59 pg·μL-1。分別取1 μL作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)方法同1.3。分別檢測(cè)10頭。

1.9 不同地理種群西花薊馬的檢測(cè)

以采自我國寧夏、陜西、山東、甘肅、吉林、云南、北京、河北8個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）10個(gè)不同地區(qū)的西花薊馬（表3）成蟲DNA（1 μL）為模板，以品系特異性組合引物TF6/GR32/LR12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)方法同1.3。根據(jù)標(biāo)本采集獲得情況，每個(gè)地理種群分別檢測(cè)2—25頭。電泳檢測(cè)質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行堿基序列測(cè)定。然后，用DnaSP 5.10軟件分析不同地理種群西花薊馬的單倍型組成。

2 結(jié)果

2.1 薊馬類昆蟲線粒體DNA COI基因序列擴(kuò)增與分析

以西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系及其他14種田間常見薊馬DNA為模板，以DNA條形碼通用型引物 LCO1490/HCO2198進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，16種/品系薊馬均能擴(kuò)增出一條清晰的靶標(biāo)片段（圖1），擴(kuò)增片段大小為629—681 bp，與數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)薊馬種類的堿基序列同源性為98.7%—100%。表明所有薊馬種類的mtDNA提取無誤，可以用于后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

表3 不同地理種群西花薊馬樣本信息

2.2 一步雙重品系特異性PCR檢測(cè)體系建立

2.2.1 組合引物比例的優(yōu)化 以篩選出的品系通用上游引物TF6以及溫室品系特異性下游引物GR32和羽扇豆品系特異性下游引物L(fēng)R12為靶標(biāo)，設(shè)置不同比例的引物組合，以兩個(gè)品系DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)組合引物TF6/GR32/LR12以1.0/0.2/0.8的比例進(jìn)行組合時(shí)，無論是溫室品系（圖2-A）還是羽扇豆品系（圖2-B）均能擴(kuò)增出清晰的靶標(biāo)條帶。

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化 分別以兩個(gè)品系DNA為模板，以優(yōu)化后的品系特異性引物組合（TF6/GR32/LR12配比為1.0/0.2/0.8），比較36—54℃不同退火溫度下的擴(kuò)增效果。結(jié)果顯示，當(dāng)退火溫度為44℃時(shí)，擴(kuò)增效果最好，擴(kuò)增出的分別靶向溫室品系（圖3-A）或羽扇豆品系（圖3-B）的特異性條帶最為清晰。

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1：西花薊馬溫室品系F. occidentalis greenhouse race；2：西花薊馬羽扇豆品系F. occidentalis lupin race；3：花薊馬F. intonsa；4：禾花薊馬F. tenuicornis；5：黃胸薊馬T. hawaiiensis；6：大薊馬T. major；7：棕櫚薊馬T. palmi；8：煙薊馬T. tabaci；9：普通大薊馬M. usitatus；10：豆喙薊馬M. glycines；11：草木樨近絹薊馬S. melilotus；12：蔗腹齒薊馬F. serrata；13：稻簡(jiǎn)管薊馬H. aculeatus；14：榕端寬管薊馬M. jordani；15：榕母管薊馬G. ficorum；16：橫紋薊馬A. fasciatus；17：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1—11：TF6/GR32/LR12比例分別為The ratios of TF6/GR32/LR12 are 1.0/0/1.0, 1.0/0.1/0.9, 1.0/0.2/0.8, 1.0/0.3/0.7, 1.0/0.4/0.6, 1.0/0.5/0.5, 1.0/0.6/0.4, 1.0/0.7/0.3, 1.0/0.8/0.2, 1.0/0.9/0.1, and 1.0/1.0/0 μL, respectively；12：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1—10：退火溫度分別為 Annealing temperatures are 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54℃, respectively；11：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

2.3 組合引物的種/品系特異性檢驗(yàn)

以西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系以及田間常見的其他14種薊馬DNA為模板，以優(yōu)化的一步雙重PCR反應(yīng)體系，檢驗(yàn)組合引物TF6/GR32/LR12的種/品系特異性。電泳檢測(cè)結(jié)果顯明，該組合引物的特異性強(qiáng)，當(dāng)以溫室品系為靶標(biāo)時(shí)，只擴(kuò)增出362 bp的溫室品系特異性條帶，當(dāng)以羽扇豆品系為靶標(biāo)時(shí)，只擴(kuò)增出541 bp的羽扇豆品系特異性條帶，對(duì)田間常見的其他14種薊馬沒有擴(kuò)增效果（圖4），表明該組合引物為西花薊馬的品系特異性引物。

2.4 品系特異性組合引物對(duì)不同蟲態(tài)的擴(kuò)增效果

分別以單一品系不同蟲態(tài)（卵、1齡和2齡幼蟲、預(yù)蛹和蛹）和不同性別（雄成蟲、雌成蟲）DNA，以及混合品系（1﹕1）各蟲態(tài)/性別DNA為模板，以品系特異性組合引物TF6/GR32/LR12進(jìn)行一步雙重PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)以單一品系DNA為模板時(shí)，溫室品系各蟲態(tài)/性別均能穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰的362 bp特異性條帶，羽扇豆品系各蟲態(tài)/性別均能穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰的541 bp特異性條帶（圖5-A）；當(dāng)以混合品系DNA為模板時(shí)，各蟲態(tài)/性別均能穩(wěn)定地同時(shí)擴(kuò)增出分別靶向溫室品系和羽扇豆品系的特異性條帶（圖5-B）。

2.5 品系特異性組合引物的檢測(cè)閾值

分別以不同濃度西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系的雌成蟲DNA為模板，進(jìn)行最低檢測(cè)閾值測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)以溫室品系為檢測(cè)靶標(biāo)時(shí)，其最低檢測(cè)濃度為35.90 pg·μL-1，相當(dāng)于1/10 240頭雌成蟲（圖6-A）；當(dāng)以羽扇豆品系為檢測(cè)靶標(biāo)時(shí)，其最低檢測(cè)濃度為146.95 pg·μL-1，相當(dāng)于1/2 560頭雌成蟲（圖6-B）。

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量DNA ladder；1：西花薊馬溫室品系F. occidentalis greenhouse race；2：西花薊馬羽扇豆品系F. occidentalis lupin race；3：花薊馬F. intonsa；4：禾花薊馬F. tenuicornis；5：黃胸薊馬T. hawaiiensis；6：大薊馬T. major；7：棕櫚薊馬T. palmi；8：煙薊馬T. tabaci；9：普通大薊馬M. usitatus；10：豆喙薊馬M. glycines；11：草木樨近絹薊馬S. melilotus；12：蔗腹齒薊馬F. serrata；13：稻簡(jiǎn)管薊馬H. aculeatus；14：榕端寬管薊馬M. jordani；15：榕母管薊馬G. ficorum；16：橫紋薊馬A. fasciatus；17：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

A：?jiǎn)我黄废礢ingle race；2—8：溫室品系Greenhouse race；9—15：羽扇豆品系lupin race；M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量DNA ladder；2、9：卵egg；3、10：1齡幼蟲1st instar larva；4、11：2齡幼蟲2nd instar larva；5、12：預(yù)蛹pre-pupa；6、13：蛹pupa；7、14：雄成蟲male adult；8、15：雌成蟲female adult；1、16：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)。B：混合品系Mixed races；M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量DNA ladder；1：卵egg；2：1齡幼蟲1st instar larva；3：2齡幼蟲2nd instar larva；4：預(yù)蛹pre-pupa；5：蛹pupa；6：雄成蟲male adult；7：雌成蟲female adult；8：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

2.6 不同地理種群西花薊馬的檢測(cè)鑒定

以采自我國8個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）10個(gè)不同地區(qū)的127頭西花薊馬成蟲DNA為模板，以品系特異性組合引物TF6/GR32/LR12進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測(cè)結(jié)果顯示，各地理種群均能擴(kuò)增出或靶向溫室品系（362 bp）、或靶向羽扇豆品系（541 bp）的COI基因片段，部分種群個(gè)體（10個(gè)地理種群45個(gè)個(gè)體）電泳檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。其中，114頭被鑒定為溫室品系，來自全部10個(gè)地理種群；13頭被鑒定為羽扇豆品系，分別來自寧夏銀川、陜西寶雞、山東煙臺(tái)、吉林四平和吉林長(zhǎng)春。進(jìn)一步的堿基序列測(cè)定和比對(duì)分析顯示，溫室品系和羽扇豆品系的堿基序列與數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)品系堿基序列的同源性分別為98.33%—100%和98.34%—100%；品系單倍型分析結(jié)果表明，114頭溫室品系包含有3種單倍型，13頭羽扇豆品系包含有2種單倍型（表4）。

3 討論

薊馬類為小型昆蟲，其物種鑒別主要依據(jù)成蟲外部形態(tài)特征，對(duì)于非專業(yè)從事薊馬分類的人員而言難以實(shí)現(xiàn)，而近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，這一難題迎刃而解。目前，已有多種DNA標(biāo)記技術(shù)用于薊馬類昆蟲的識(shí)別與鑒定，包括隨機(jī)多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記技術(shù)[39]、基于線粒體DNA COI/COII/COIII基因的DNA序列測(cè)序法[40-42]、基于COI和ITS-1/ITS-2序列的限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）標(biāo)記技術(shù)[40,43-45]、特征序列擴(kuò)增區(qū)域（sequence characterized amplified regions，SCAR）標(biāo)記技術(shù)[46]、種特異性PCR（species-specific PCR，SSP）擴(kuò)增技術(shù)[47-48]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)[49-51]、DNA條形碼技術(shù)[35-36,52-54]、基因芯片技術(shù)[55]等，并取得了顯著成效。其中，基于線粒體DNA COI基因的DNA條形碼技術(shù)在薊馬類以及其他昆蟲類群的識(shí)別鑒定中起到了重要作用[56-57]。

A：溫室品系 Greenhouse race；M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1—13：18.38×103, 9.19×103, 4.60×103, 2.30×103, 1.15×103, 574.38, 287.19, 143.59, 71.80, 35.90, 17.95, 8.97, and 4.49 pg·μL-1, respectively；14：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)。B：羽扇豆品系 Lupin race；M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1—13：18.81×103, 9.41×103, 4.70×103, 2.35×103, 1.18×103, 587.81, 293.91, 146.95, 73.48, 36.74, 18.37, 9.18, and 4.59 pg·μL-1, respectively；14：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

M：標(biāo)準(zhǔn)DNA分子質(zhì)量 DNA ladder；1—5：銀川YC；6—10：寶雞BJI；11—15：煙臺(tái)YT；16—20：敦煌DH；21、22：四平SP；24—28：長(zhǎng)春CC；29—33：臨滄LC；34—38：蘭州LZ；39—43：延慶YQ；44—46：廊坊LF；23、47：陰性對(duì)照（模板為超純水）negative control (ultrapure water)

表4 基于mtDNA COI基因的各單倍型在西花薊馬10個(gè)地理種群中的分布

線粒體DNA為多拷貝基因，具有分子量小、進(jìn)化速度快、遺傳自主性和嚴(yán)格的母系遺傳等特性，基于線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mtDNA COI）基因的DNA條形碼技術(shù)即由此發(fā)展而來[58]，目前已廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別鑒定、生物分類，以及分子進(jìn)化、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析等[56-57]。本研究采用基于線粒體DNA COI基因的SS-COI標(biāo)記技術(shù)，研發(fā)出了靶向西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系的一步雙重特異性組合引物TF6/GR32/LR12及其快速檢測(cè)鑒定方法。該組合引物特異性強(qiáng)，只對(duì)西花薊馬的溫室品系和羽扇豆品系具有擴(kuò)增效果，只需一步PCR反應(yīng)，即可獲得分別靶向溫室品系（362 bp）和羽扇豆品系（541 bp）的特異性條帶，對(duì)田間常見的14種其他種類薊馬（包括兩種花薊馬屬薊馬）不具有擴(kuò)增能力（圖4）。同時(shí)，該技術(shù)體系的檢測(cè)靈敏性高，無論單一品系還是混合品系，既對(duì)成蟲具有良好的擴(kuò)增效果，也對(duì)單粒卵、初孵幼蟲、2齡幼蟲、預(yù)蛹及蛹具有同樣的擴(kuò)增效能（圖5）；靶向溫室品系，其最低檢測(cè)閾值為35.90 pg·μL-1，相當(dāng)于1/10 240頭雌成蟲，靶向羽扇豆品系其最低檢測(cè)閾值為146.95 pg·μL-1，相當(dāng)于1/2 560頭雌成蟲（圖6）。進(jìn)一步的田間樣本檢測(cè)分析顯示，該技術(shù)體系能快速鑒定出來自不同省（自治區(qū)、直轄市）的西花薊馬（包括不同的單倍型）所屬的品系類型。此外，數(shù)據(jù)庫同源性比對(duì)分析結(jié)果表明，沒有任一同屬（）近緣種薊馬（包括東方花薊馬、花薊馬、首花薊馬、禾花薊馬、佛羅里達(dá)花薊馬、褐花薊馬、梳缺花薊馬、澳洲花薊馬、西印花薊馬、單色花薊馬，以及、、、、、、、、等19種）或其他種類的薊馬或昆蟲的DNA序列與西花薊馬溫室品系或羽扇豆品系特有的362 bp（同源性＜88%）或541 bp（同源性＜85%）片段完全一致，顯示該技術(shù)體系完全可用于西花薊馬品系的快速鑒定，以及國際國內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品（包括水果、蔬菜和花卉）貿(mào)易或調(diào)運(yùn)過程中的檢驗(yàn)檢疫和監(jiān)管。同時(shí)，還可用于指導(dǎo)田間西花薊馬品系靶向性防控措施的制定，如靶向抗性比較強(qiáng)的溫室品系單優(yōu)地域種群[3]，應(yīng)少用或不用化學(xué)農(nóng)藥；而靶向品系混發(fā)地域種群，應(yīng)采用劑量控制、合理用藥（輪用、混用等）等措施，延緩抗藥性產(chǎn)生。此外，兩個(gè)品系在危害程度、傳播病毒能力等方面是否存在差異，尚不得而知，而本研究的品系特異性快速檢測(cè)技術(shù)體系的建立，為單一品系種群建立及其后續(xù)研究提供了技術(shù)支撐。

一步多重PCR（multiplex PCR）又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是指在同一PCR反應(yīng)體系中添加兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，且每對(duì)引物只對(duì)應(yīng)一個(gè)靶標(biāo)片段[59]，與常用的RAPD技術(shù)（一對(duì)引物對(duì)應(yīng)多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物）[38]全然不同。多重PCR技術(shù)可用于病原微生物、昆蟲、軟體動(dòng)物等的檢測(cè)鑒定，所用的靶標(biāo)基因主要有COI基因、16S rDNA基因[60-64]和ITS基因[65]等。如基于16S rDNA[60-61]、EF1[66]等基因的一步雙重/多重PCR技術(shù)常用于細(xì)菌鑒定；基于病毒保守基因（DNA/RNA）的一步多重PCR技術(shù)常用于5種病毒的快速檢測(cè)[67-68]。同時(shí)，多重PCR技術(shù)在外來入侵種的檢測(cè)監(jiān)測(cè)中亦發(fā)揮了重要作用[69]。如Zhang等[70]基于SCAR標(biāo)記技術(shù)，研究構(gòu)建了靶向煙粉虱（）B隱種和西花薊馬的一步雙重快速檢測(cè)鑒定技術(shù)體系，只需一步PCR反應(yīng)，即可將兩種同域發(fā)生的重大入侵種區(qū)分開，無需堿基序列測(cè)定和比對(duì)分析；Kurata等[61]以COI基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建一步多重PCR擴(kuò)增體系，只需一步擴(kuò)增反應(yīng)即可有效區(qū)分入侵種煙粉虱（MEAM1，MED Q1，MED Q2隱種）和本地種煙粉虱（Asia II 6隱種）；Nakamura等[63]以COI基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建了一步多重PCR引物組合體系，用以快速鑒定5種斑潛蠅屬（）害蟲（包括、蔥斑潛蠅、南美斑潛蠅、美洲斑潛蠅和三葉草斑潛蠅等），并且針對(duì)美洲斑潛蠅存在隱存種或進(jìn)化支的現(xiàn)象，分別設(shè)計(jì)了靶向支系A(chǔ)和L的特異性上游引物，與潛蠅屬通用下游引物組合成新的多重PCR引物組合，用于鑒定美洲斑潛蠅的3個(gè)隱存種，取得了預(yù)期效果；Cooke等[62]以COI基因?yàn)榘袠?biāo)構(gòu)建多重PCR技術(shù)體系，無需測(cè)序即可快速鑒別入侵種福壽螺（）與當(dāng)?shù)貎煞N同屬近緣種蝸牛，即淡水蘋果蝸牛（）和?；赟S-PCR技術(shù)的種特異性一步雙重/多重PCR檢測(cè)鑒定技術(shù)，只需一步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，即可根據(jù)靶標(biāo)片段的大小快速地鑒定物種，無需堿基序列測(cè)定與比對(duì)分析，具有操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)、高效、系統(tǒng)性強(qiáng)等特性，適用于區(qū)分近緣種、隱存種等[38]。

本研究研發(fā)的一步雙重品系特異性SS-COI組合引物TF6/GR32/LR12及其快速檢測(cè)技術(shù)體系，提高了西花薊馬溫室品系和羽扇豆品系檢測(cè)鑒定的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，在西花薊馬品系檢測(cè)監(jiān)測(cè)及其靶向性防控中具有重要應(yīng)用價(jià)值。將本研究獲得的靶標(biāo)序列與數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，本研究溫室品系的靶標(biāo)片段與數(shù)據(jù)庫[71]中溫室品系其他單倍型（105種）的同源性為98.33%—100%，與羽扇豆品系（包括不同的單倍型）的同源性為95.03%—96.13%，而與其他近緣種的同源性＜87.68%；本研究羽扇豆品系的靶標(biāo)片段與數(shù)據(jù)庫中羽扇豆品系其他單倍型（104種）的同源性為98.34%—100%，與溫室品系（包括不同的單倍型）的同源性為96.12%—96.30%，而與其他近緣種的同源性＜84.73%。表明該檢測(cè)技術(shù)完全可以用于西花薊馬的溫室品系或羽扇豆品系鑒定，并且在同一品系不同單倍型間具有較好的通用性，在不同品系之間具有良好的特異性（圖7）。不過薊馬類昆蟲種類比較多，且同一種類（如西花薊馬）包含多種單倍型，有一些常見的種類/種群/單倍型本研究沒有涉及，因此該組合引物的特異性，尤其靶向同一品系不同單倍型的通用性以及靶向不同品系不同單倍型的特異性，還需進(jìn)一步驗(yàn)證；而有關(guān)該組合引物對(duì)溫室品系和羽扇豆品系最低檢測(cè)閾值的差異，可能與其擴(kuò)增的兩個(gè)品系靶標(biāo)片段的大小不同有關(guān)。

4 結(jié)論

采用種特異性SS-COI標(biāo)記法建立了西花薊馬品系一步雙重特異性快速檢測(cè)鑒定技術(shù)體系。該檢測(cè)鑒定技術(shù)體系特異性強(qiáng)，僅對(duì)西花薊馬的溫室品系和/或羽扇豆品系具有擴(kuò)增能力，對(duì)田間常見的其他14種薊馬不具有擴(kuò)增效能。靈敏度高，無論單一品系還是混合品系，或同一品系不同單倍型，不僅對(duì)成蟲、預(yù)蛹和蛹具有良好的擴(kuò)增效果，對(duì)單粒卵、1齡和2齡幼蟲亦具有同等的擴(kuò)增能力；對(duì)溫室品系的最低檢測(cè)閾值為35.90 pg·μL-1，相當(dāng)于1/10 240頭雌成蟲，對(duì)羽扇豆品系的最低檢測(cè)閾值為146.95 pg·μL-1，相當(dāng)于1/2 560頭雌成蟲。該檢測(cè)鑒定技術(shù)體系的建立對(duì)西花薊馬的檢疫監(jiān)管、有效阻截西花薊馬兩個(gè)品系的進(jìn)一步傳播擴(kuò)散及其靶向性防控措施制定具有重要意義。

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One-step duplex rapid identification technique ofgreenhouse and lupin races based on species-specific COI marker

ZHANG Rong1, WANG YuSheng1, YANG LiMei3, WAN FangHao1,2, ZHANG GuiFen1,2

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Key Laboratory of Integrated Pest Management of Crop, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Center for Management of Invasive Alien Species, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193;3Agricultural Technology Extension Station of Yufa, Daxing, Beijing 102602)

【Background】is one of the most important pests infesting agricultural and horticultural crops worldwide, also it is a national- and international-wide important quarantine pest.has two races, i.e., greenhouse race (GR) and lupin race (LR). There are significant differences between the two races in host plant species, pesticide resistance, living environments, etc. However, it is difficult to identify these two races because of their high similarity in morphological characteristics.【】In this study, a one-step duplex PCR procedure for rapid identification ofgreenhouse race and lupin race was developed by using species-specific COI (SS-COI) marker based on mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I (mtDNA COI) gene, and other 14 common thrips species in the field were used as the control.【】The COI sequences ofgreenhouse and lupin races, and other 14 thrips species were amplified using mtDNA COI gene universal primers. The race-specific primer combination system, TF6/GR32/LR12 (TF6, the universal forward primer; GR32, the greenhouse race-specific reverse primer; LR12, the lupin race-specific reverse primer), for one-step duplex amplification of the two races was established. The fragments amplified by the combined primers were 362 bp for the greenhouse race and 541 bp for the lupin race, respectively. The system and conditions (e.g., annealing temperature) were optimized. The species/race specificity and sensitivity/ detection threshold of the combined primers were evaluated.【】When the ratio of the combined primers (TF6/GR32/LR12) was 1.0/0.2/0.8 and the annealing temperature was 44℃, the amplification effect was the best. Species/race-specific tests performed with this set of combined primers indicated that allgreenhouse race and lupin race specimens were detected positively and no cross reaction with other 14 thrips species, including,,,,,,,,,,,,,and, was identified. The system was tested on individual male and female adults, individual prepupae and pupae, individual 1st and 2nd instar larvae, and even single egg, and demonstrated to be applicable for all these stages of greenhouse and lupin races of, either in single race or two races mixed together. The detection threshold for greenhouse race was 35.90 pg·μL-1, which was equivalent to 1/10 240 of a whole female adult. The detection threshold for lupin race was 146.95 pg·μL-1, which was equivalent to 1/2 560 of a whole female adult. Meanwhile, the system worked well in testing individuals from different geographic populations with different haplotypes within greenhouse race or lupin race of the thrips. 【】The one-step duplex PCR system developed here for rapid identification ofgreenhouse and lupin races could be useful in port quarantine and interception in national and international transportation of agricultural products, and should be significant in blocking further spreading and developing targeted prevention and control measures of.

greenhouse race;lupin race; one-step duplex PCR; SS-COI marker; race-specific combined primer set; rapid identification

2019-03-27；

2019-06-06

國家自然科學(xué)基金（31572067）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC1200600）

張蓉，E-mail：zhangrong0120@163.com。

張桂芬，E-mail：guifenzhang3@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）