任大勇，高良鋒，楊柳，劉宏妍，于寒松，沈明浩

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，長春 130118)

辣白菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，微生物的代謝賦予其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和獨(dú)特的風(fēng)味[1-3]。傳統(tǒng)辣白菜的發(fā)酵通過白菜及其配料所攜帶的微生物來完成[4]，這種工藝存在著發(fā)酵時間長、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等缺陷[5,6]，不利于商業(yè)化產(chǎn)品的推廣。利用發(fā)酵劑來縮短生產(chǎn)周期、控制產(chǎn)品質(zhì)量是目前發(fā)酵蔬菜行業(yè)所公認(rèn)的有效手段[7]，但我國目前對辣白菜發(fā)酵劑及發(fā)酵工藝的研究報道較少。

辣白菜發(fā)酵過程由多種微生物共同作用，研究結(jié)果表明發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種主要包括明串珠菌屬、魏斯氏菌屬以及乳桿菌[8]。其中明串珠菌屬作為發(fā)酵劑被研究的較為廣泛，但植物乳桿菌對辣白菜的影響卻被忽視，乳桿菌屬中的植物乳桿菌是辣白菜發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種[9，10]，在發(fā)酵過程中起到重要的作用。本研究利用植物乳桿菌作為發(fā)酵劑，研究它在不同發(fā)酵條件下對辣白菜感官品質(zhì)的影響，并進(jìn)一步通過響應(yīng)面試驗探討了發(fā)酵劑(植物乳桿菌)與發(fā)酵因素間的交互作用，為了解植物乳桿菌在辣白菜發(fā)酵過程中的作用及為辣白菜發(fā)酵劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：植物乳桿菌L12，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全實(shí)驗室。

白菜、辣椒粉、大蒜、姜、食鹽、白糖等：市售；亞硝酸鹽、硫酸亞鐵、乙酸鋅、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸乙二胺：分析純試劑；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型 pH計 上海佑科儀器儀表有限公司；5804R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；BSA2245-CW型電子天平 德國Sartorus公司；DS-11型超微量分光光度計 美國Denovix公司；TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辣白菜的基本制作流程

去老葉→切分→稱重→腌制→清洗→抹料→發(fā)酵→保藏。

將新鮮白菜去老葉，切分成4份，以質(zhì)量為基重，用不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%，g/g)食鹽腌制24 h后，用清水清洗，瀝干，待用。用適量的熱水燙辣椒粉去苦，冷卻。將蘋果、梨、姜、蒜用搗碎機(jī)打碎成泥狀，按表1中的配料比例調(diào)制成辣白菜醬料，按每份占白菜總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)分配醬料，根據(jù)醬料質(zhì)量加入不同濃度菌液(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%，mL/g)，混勻。將醬料均勻涂抹在每片菜葉上，放在塑料保鮮盒中密封，于不同溫度(1，4，7，10，13，16 ℃)發(fā)酵，發(fā)酵時間控制在1，3，5，7，9，11，13，15 d，檢測發(fā)酵結(jié)束后各理化指標(biāo)及感官評價。

表1 配料表Table 1 The list of ingredients g

1.3.2 感官評價

挑選30名接受過感官評價培訓(xùn)課程并考核通過的人員，對產(chǎn)品進(jìn)行感官評價，以色澤、氣味、味道和質(zhì)構(gòu)特性4個因素作為感官品質(zhì)的基本評價指標(biāo)，評定標(biāo)準(zhǔn)(見表2)參考DB22/T 1758-2012[11]，以累積得分總和作為感官評價得分。

表2 辣白菜感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation standard of spicy cabbage

1.3.3 亞硝酸鹽檢測

依照國標(biāo)GB 5009.33-2016中第二法分光光度法執(zhí)行操作[12]。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)分析[13]

選擇圓形探頭，觸發(fā)力1000 N，速度1 mm/s，形變量45%，抬起高度30 mm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

單因素試驗每組重復(fù)10次，利用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以均值±方差的形式表示；響應(yīng)面試驗重復(fù)30組，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸方程分析及響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵劑接種量對辣白菜感官品質(zhì)的影響

圖1 發(fā)酵劑接種量對辣白菜感官評分的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of starter on sensory score of spicy cabbage

微生物在辣白菜的發(fā)酵過程中對風(fēng)味及口感均產(chǎn)生影響，發(fā)酵劑的添加量會影響原有微生物的生長及代謝，對感官品質(zhì)產(chǎn)生直接影響。由圖1可知，pH值隨發(fā)酵劑添加量的增加呈下降趨勢，可以反映出各樣品正處于不同的發(fā)酵階段；同時從感官評分上分析，發(fā)酵結(jié)束時，接種量在0%～3%時，樣品尚未完全達(dá)到發(fā)酵成熟期，酸積累量不高，辣白菜滋味豐富，酸度比較適宜；接種量在3%～6%時，感官評分呈下降趨勢，pH迅速下降，之后又呈上升趨勢，此階段酸的累積量增加，乳酸菌受到顯著抑制，酵母菌等開始增長，從而使樣品酸度回升，但風(fēng)味受到嚴(yán)重破壞。這與Jeong等[14]對辣白菜微生物代謝的研究結(jié)果相一致。由于在接菌量為2%時感官評分較高，所以后續(xù)試驗菌以2%的接菌量為標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2 腌制鹽濃度對辣白菜感官品質(zhì)的影響

圖2 腌制鹽濃度對辣白菜感官評分的影響Fig.2 Effect of salt concentration on sensory score of spicy cabbage

辣白菜前期腌制時所采用的鹽濃度直接影響原料初始階段的口感及風(fēng)味，同時對發(fā)酵初始階段的原料所攜帶的微生物和發(fā)酵過程中微生物的代謝都有著很大影響。由圖2可知，鹽濃度在1%～8%范圍內(nèi)，pH值隨鹽濃度增加而呈上升趨勢，說明較高的鹽濃度會抑制乳酸菌代謝，使其產(chǎn)酸量減少；鹽度在5%～7%時，因鹽度過高，適口性較差，由于鹽濃度較高對菜葉脫水作用較為明顯，使菜葉質(zhì)地偏軟，同時高鹽濃度抑制了部分微生物生長，導(dǎo)致發(fā)酵風(fēng)味不足；鹽濃度較低時，各種微生物代謝菌比較活躍，同樣乳酸菌也容易過量繁殖，易導(dǎo)致產(chǎn)品酸化。

2.1.3 發(fā)酵溫度對辣白菜感官品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵溫度對辣白菜感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score of spicy cabbage

Park Seong-Eun 等[15]研究表明，溫度對于微生物的生長和代謝都有著重要的影響，辣白菜多采用低溫發(fā)酵，所以發(fā)酵劑必須具備在較低溫度下代謝生長的能力。由圖3可知，隨發(fā)酵溫度的升高，樣品pH值不斷降低，說明植物乳桿菌隨溫度升高代謝活躍，產(chǎn)酸量增加，酸的積累量增加，導(dǎo)致pH降低；感官評分在溫度4～10 ℃范圍內(nèi)不斷升高，在較低溫度下發(fā)酵脆度較好，但乳酸菌及其他微生物代謝緩慢，發(fā)酵風(fēng)味不足；當(dāng)溫度高于10 ℃時，乳酸菌的代謝量增加，酸的累積量同樣增加，導(dǎo)致部分風(fēng)味被酸味所掩蓋。所以，當(dāng)發(fā)酵溫度為10 ℃時，能得到較好的感官評分。

2.1.4 發(fā)酵時間對辣白菜感官品質(zhì)的影響

圖4 發(fā)酵時間對辣白菜感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score of spicy cabbage

發(fā)酵時間反映出發(fā)酵進(jìn)程中微生物代謝產(chǎn)物的累積過程，由圖4可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸的累積量不斷增加，pH值不斷降低，當(dāng)發(fā)酵到13天時pH降至最低點(diǎn)，之后有所回升，表明該階段乳酸菌受到抑制，耐酸性菌株代謝消耗體系中的酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH有所回升；而在發(fā)酵初期，主要以好氧微生物代謝為主，該階段微生物種類最多，所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也較為豐富；當(dāng)體系中氧耗盡后，厭氧微生物(以乳酸菌為主)逐漸占據(jù)優(yōu)勢，有機(jī)酸開始積累，當(dāng)有機(jī)酸積累到一定量時開始對感官品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

以上述試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗，研究發(fā)酵劑植物乳桿菌L12的接種量與發(fā)酵溫度、腌制鹽濃度和發(fā)酵時間3個因素間的交互作用，試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表3。

表3 辣白菜發(fā)酵工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process of spicy cabbage

2.2.2 方差結(jié)果分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，對表3中數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，并對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，結(jié)合感官評分與接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、腌制鹽濃度(C)和發(fā)酵時間(D)得到回歸方程：

感官評分=76.39+0.54A+2.61B-0.96C-0.30D-0.16AB+0.65AC+0.95AD+0.15BC-2.20BD-0.23CD-1.81A2-3.13B2-3.35C2-2.85D2。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

續(xù) 表

注：“*”(P<0.05)表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著；“**”(P<0.01)表示差異極顯著。

結(jié)合表4分析，模型項P<0.01，回歸模型差異極顯著；失擬項P=0.0813(P>0.05)，失擬差異不顯著，說明模型存在統(tǒng)計學(xué)意義；R2=0.9701、RAdj2=0.9403說明該模型擬合度良好，適用于辣白菜的發(fā)酵條件預(yù)測和分析。響應(yīng)面方差因素A、AD、A2對感官評分的影響存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明該發(fā)酵劑對發(fā)酵有顯著性影響；但發(fā)酵劑與其他各因素間作用關(guān)系不能單純通過線性關(guān)系表示，存在顯著性的交互作用。

2.2.3 響應(yīng)面分析

發(fā)酵劑接種量與發(fā)酵溫度、腌制鹽濃度及發(fā)酵時間之間的交互作用對感官評分的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵劑接種量與3個因素的交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface of interaction function for starter inoculation amount and three factors on the sensory score

圖5中S1、S2和S3直觀地反映出發(fā)酵劑的接種量與發(fā)酵溫度、腌制鹽濃度、發(fā)酵時間交互作用所形成的響應(yīng)面坡面陡峭，交互作用明顯，對所得產(chǎn)品的感官評分影響較大。由圖5中S1可知，低溫、低接種量在選定的時間范圍內(nèi)辣白菜的感官評分明顯較低，低溫不利于微生物代謝活動，增加初始階段微生物數(shù)量能有效提高代謝產(chǎn)物的積累，但可能會因為發(fā)酵劑接種量過大而直接抑制其他微生物的生長，從而使感官評分降低；由圖5中S2可知，高鹽度、低接種量所得感官評分偏低，高鹽度造成產(chǎn)品咸味過重，菜葉變軟，同時導(dǎo)致包括發(fā)酵劑在內(nèi)的菌株不能正常生長代謝，也不能產(chǎn)生足夠的風(fēng)味物質(zhì)。胡會萍等[16]的研究表明，雖然低鹽度發(fā)酵所得產(chǎn)品更有利于健康，但低鹽度對產(chǎn)品風(fēng)味也會造成影響，同時會造成體系中微生物變化更快，增加產(chǎn)品質(zhì)量的控制難度；由圖5中S3可知，響應(yīng)面坡度相對較小，但等高線跨度較大，說明接種量與發(fā)酵時間的交互作用顯著，說明發(fā)酵劑能明顯改變發(fā)酵時間，且更容易得到最佳的發(fā)酵時間節(jié)點(diǎn)，發(fā)酵時間過短，微生物代謝產(chǎn)物積累量較少，風(fēng)味不足；發(fā)酵時間過長，代謝產(chǎn)物累積過量，從而使感官評分下降。

2.2.4 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件計算，得到理論最佳接菌發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量2.05%，發(fā)酵溫度11.48 ℃，腌制鹽濃度3.88%，發(fā)酵時間6.54 d；由于試驗受操作條件限制，選擇最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量2%，發(fā)酵溫度11 ℃，腌制鹽濃度4%，發(fā)酵時間7 d。參照此條件進(jìn)行3組重復(fù)性試驗，接種發(fā)酵樣品pH值為5.04，感官評分為76.8±1.5，與預(yù)測結(jié)果相似。通過與自然發(fā)酵樣品和2種市售樣品相對比(見表5)，各樣品亞硝酸鹽含量均明顯低于國家標(biāo)準(zhǔn)(20 mg/kg)，但自然發(fā)酵樣品亞硝酸鹽含量稍高，說明植物乳桿菌在辣白菜的發(fā)酵過程中能起到降低亞硝酸鹽的作用；可溶性糖含量相差不大，但自然發(fā)酵樣品可溶性糖相比于接種發(fā)酵含量偏低，可能是因為植物乳桿菌降解了辣白菜中的不可溶性纖維素，導(dǎo)致可溶性糖含量增加，但乳酸菌降解纖維素的能力較差，所以兩者間差異并不顯著；通過感官評分結(jié)果可知，接種發(fā)酵與自然發(fā)酵相比，接種發(fā)酵能有效提高辣白菜的咀嚼性，并對風(fēng)味有一定改善作用；與市售產(chǎn)品的品質(zhì)間有所差別，接種發(fā)酵樣品酸味上更容易被消費(fèi)者所接受，亞硝酸鹽含量和可溶性糖含量相差不大，脆度更好，咀嚼性明顯優(yōu)于市售樣品。

表5 接種發(fā)酵樣品與自然發(fā)酵樣品、市售樣品比較結(jié)果Table 5 The comparison result s of inoculated fermented, natural fermented and commercial samples

3 結(jié)論

本研究利用植物乳桿菌L12作為發(fā)酵劑發(fā)酵辣白菜，通過接種量與發(fā)酵溫度、腌制鹽濃度、發(fā)酵時間3個因素對發(fā)酵體系微生物有較大影響的單因素研究，表明植物乳桿菌L12能改變發(fā)酵進(jìn)程，有效地縮短發(fā)酵時間；利用響應(yīng)面法進(jìn)一步研究了接種量與其他3個因素間存在著明顯的交互作用，發(fā)酵時間與發(fā)酵劑接種量間交互作用差異顯著，發(fā)酵劑接種量對發(fā)酵時間能起到顯著的效果，同時得到了植物乳桿菌L12作為發(fā)酵劑的最佳發(fā)酵條件為：接種量2%，腌制鹽濃度4%，發(fā)酵溫度11 ℃，發(fā)酵時間7 d；通過接種發(fā)酵與2種市售產(chǎn)品相對比，表明接種發(fā)酵的辣白菜咀嚼性明顯優(yōu)于市售產(chǎn)品；與自然發(fā)酵樣品相比，辣白菜的咀嚼性顯著提高，風(fēng)味也明顯得到改善。

雖然辣白菜發(fā)酵體系中微生物種類繁多，演變及代謝過程復(fù)雜，很難通過單一菌株詮釋整個發(fā)酵過程，但從研究結(jié)果可以看出，植物乳桿菌L12作為辣白菜發(fā)酵劑，能干預(yù)自然發(fā)酵過程中微生物變化，從而縮短發(fā)酵時間，實(shí)現(xiàn)快速發(fā)酵，同時提高產(chǎn)品的感官品質(zhì)，符合辣白菜發(fā)酵劑的使用要求。但發(fā)酵體系中微生物的復(fù)雜性和代謝產(chǎn)物的豐富性，還不能完全被單菌株發(fā)酵取代，后續(xù)以該試驗為基礎(chǔ)，挑選對風(fēng)味改善更明顯或具有較強(qiáng)功能性的菌株與之復(fù)配，進(jìn)一步提高產(chǎn)品品質(zhì)，研發(fā)更優(yōu)質(zhì)的復(fù)合型發(fā)酵劑。