韓德鵬 劉星月 王馨悅 羅 莎 付東輝 周慶紅

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西 南昌 330045)

土壤酸化是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素之一。 近年來,由于環(huán)境污染、酸雨沉降及化肥的大量施用導(dǎo)致我國耕地土壤酸化問題進(jìn)一步加劇[1]。據(jù)報道,我國酸性土壤面積約占國土總面積的21%,達(dá)到203 萬hm2,主要遍及14 個省區(qū),尤以南方分布面積最廣[2]。 江西省酸性耕地(pH 值介于4.5 ～5.5之間,平均為5.2)面積為237.48 萬hm2,占總耕地面積的84.22%,且酸化程度和面積均呈增加和擴(kuò)大趨勢[3]。 鋁(Al)毒是酸性土壤中限制作物生產(chǎn)的主要因素之一,能夠影響作物生長,進(jìn)而導(dǎo)致作物減產(chǎn)[4]。研究發(fā)現(xiàn)Al3+是植物受鋁毒脅迫的主要形式[5]。 植物對鋁毒害的反應(yīng)首先表現(xiàn)在根系上,鋁脅迫1 ～2 h 可觀察到植物根系的伸長受到明顯抑制[6]。 Kochian等[7]研究表明,鋁能夠與作物根尖細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜表面和細(xì)胞核等部位結(jié)合,從而抑制根尖細(xì)胞的伸長與分裂,進(jìn)而影響作物根系對水分、養(yǎng)分的吸收。 作物根系受到鋁脅迫后主根變粗變短,根尖膨大變褐,側(cè)根和根毛減少甚至消失；葉片受到鋁脅迫時癥狀為幼葉變小,葉緣卷曲,葉片變黃,光合作用降低[8-9]。 因此,通過研究鋁脅迫對植物根系形態(tài)和生理指標(biāo)的影響,可進(jìn)一步探討植物對鋁脅迫的生理反應(yīng)和植物的抗鋁機(jī)制。

油菜(Brassica napusL.)是我國重要的油料作物,屬于十字花科蕓薹屬。 我國是世界上最大的油菜生產(chǎn)國之一,年均播種面積和總產(chǎn)量均占世界總量的20%以上,我國90%以上油菜栽培于鋁毒危害較為嚴(yán)重的長江流域[10]。 研究表明,當(dāng)土壤pH 值小于5.8,鋁濃度大于15 mg·kg-1時油菜就會受到鋁毒脅迫,導(dǎo)致產(chǎn)量明顯下降[11]。 鋁毒危害已經(jīng)成為限制我國南方油菜產(chǎn)量的重要因素之一。 目前,前人對油菜幼苗耐鋁毒的研究多集中在不同油菜品種耐鋁毒方面,采用的試驗材料較為隨機(jī),旨在篩選油菜耐鋁相關(guān)形態(tài)和生理指標(biāo)鑒定[12-15]。 而關(guān)于鋁脅迫下油菜根系形態(tài)和生理指標(biāo)的系統(tǒng)性研究尚鮮見報道。 為此,本試驗基于公認(rèn)的耐鋁毒指標(biāo)(主根相對伸長率),前期從300份甘藍(lán)型油菜自交系群體中[16]篩選出的耐鋁毒差異顯著的2 個品種(R178 和S169),研究不同濃度鋁處理對R178 和S169 幼苗根系形態(tài)和生理指標(biāo)的影響,以期為耐鋁油菜資源篩選和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年1-4月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院人工氣候培養(yǎng)室(光照時間14 h、晝夜25℃/20℃)進(jìn)行。根據(jù)鋁脅迫下主根相對生長率和蘇木精染色結(jié)果,從300 份甘藍(lán)型油菜自交系群體中篩選出耐鋁毒差異顯著的2 個品種,分別為R178(耐鋁油菜品種)、S169(鋁敏感油菜品種)作為試驗材料,由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 脅迫處理 取2 個品種的種子,清洗浮選后分別播種在裝有純水的方形塑料盆中紗布上,5 d 后待子葉完全展開、側(cè)根還未從主根分化時,每個品種各選長勢一致的60 株幼苗轉(zhuǎn)入裝有1/4 營養(yǎng)液(pH 值5.8,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)葉菜B 配方[17])的方形盆中,培養(yǎng)3 d 后更換成1/2 營養(yǎng)液,再培養(yǎng)3 d 后轉(zhuǎn)入全營養(yǎng)液。 在全營養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d 后進(jìn)行鋁脅迫試驗,將植株從營養(yǎng)液中取出,轉(zhuǎn)移至0.5 mmol·L-1CaCl2溶液(pH 值4.5)中,處理12 h,分別移入鋁濃度為0(對照,CK)、50、100、150、200、300 μmol·L-1的營養(yǎng)液(pH值4.5) 中,每個處理設(shè)3 次重復(fù)。 鋁以氯化鋁(AlCl3)形式供給。

1.2.2 幼苗形態(tài)指標(biāo)的測定 鋁脅迫處理4 周后,取各材料根系,利用RhizoScan 原位根系掃描儀(加拿大Regent 公司)進(jìn)行根系掃描,得到根系原位圖并存入計算機(jī)轉(zhuǎn)換為數(shù)字化根系圖像后,采用根系圖像分析軟件WinRHIZO STD4800 LA2 400 分別計算總根長(cm)、根表面積(cm2)、根平均直徑(mm)、根體積(cm3)和根尖數(shù)(個)。 按照公式計算各材料根系主根相對伸長率：

1.2.3 幼苗生理指標(biāo)的測定 采用電導(dǎo)率法[18]測定植物細(xì)胞膜透性；酸性茚三酮顯色法[19]測定游離脯氨酸含量；氮藍(lán)四唑(nitroblue tetrazolium,NBT)法[20]測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性；愈創(chuàng)木酚法[21]測定過氧化物酶(peroxidase,POD)活性；分光光度法[22]測定過氧化氫酶(catalase,CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性；考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[23]測定可溶性蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007 整理數(shù)據(jù)；SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫對油菜幼苗根系形態(tài)指標(biāo)的影響

由圖1、圖2可知,R178 和S169 的根系形態(tài)存在明顯差異,同一鋁濃度處理下,與S169 相比,R178 在根系發(fā)育和地上部生長方面均表現(xiàn)出較強優(yōu)勢。

由表1可知,隨著鋁處理濃度的增加,2 個品種幼苗的主根相對伸長率均受到明顯抑制。 與CK 相比,R178 各處理的主根相對伸長率介于34.3%～95.6%之間,S169 的主根相對伸長率介于20.3%～81.8%之間。 50 μmol·L-1鋁處理下,R178 的主根相對伸長率略有降低,但與CK 間未達(dá)到顯著水平,而S169 與CK相比下降18.2 個百分點；300 μmol·L-1鋁處理下,R178 和S169 的主根相對伸長率分別為34.3%、20.3%,說明S169 根系受鋁脅迫影響更為嚴(yán)重。

隨著鋁處理濃度的增加,2 個品種的總根尖數(shù)均呈先增加后減少的趨勢。 其中,R178 在150 μmol·L-1鋁處理時根尖數(shù)最多,較CK 增加了31%,而S169 在50 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,較CK 增加了11%。說明在一定鋁濃度范圍內(nèi)油菜根尖數(shù)隨著鋁處理濃度的增加而增加,超過某一限度后油菜根尖數(shù)不再增加,這可能是低濃度鋁處理下主根生長受抑制,油菜總根數(shù)的增加,高濃度鋁處理下受鋁毒害的影響,側(cè)根數(shù)增多導(dǎo)致油菜總根數(shù)有所減少。 隨著鋁處理濃度的增加,油菜幼苗的總根長、總根體積、總根表面積和根系平均直徑均受到不同程度的影響。 50 μmol·L-1鋁處理時R178 的總根長、總根體積、總根表面積和根系平均直徑與CK 間均無顯著差異,而S169 分別較CK 下降8%、5%、13%、8%。 同一鋁濃度處理下,S169 各指標(biāo)的抑制效果均大于R178,200 μmol·L-1鋁處理下,與CK 相比,R178 的總根長、總根體積、總根表面積和根系平均直徑降幅分別為24%、19%、26%、18%,S169 的降幅分別為45%、31%、45%、35%。

圖1 鋁脅迫對2 個油菜品種幼苗生長的影響Fig.1 Effect of aluminum stress on seedling growth of two rapeseed varieties

圖2 不同濃度鋁處理濃度下油菜根系掃描圖Fig.2 The scan of rape root with different treatments of aluminum concentrations

表1 鋁對油菜根系形態(tài)指標(biāo)的影響Table1 Effect of aluminum on morphological index of root system of Brassica napus L.

2.2 鋁脅迫對油菜幼苗根系和葉片生理特性的影響

2.2.1 鋁脅迫對油菜幼苗根系和葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 由圖3可知,鋁處理下2 個油菜品種質(zhì)根系中的可溶性蛋白質(zhì)含量均呈先增加后減少的趨勢,100 μmol·L-1鋁處理時,R178 根系中可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大,為CK 的155%；50 μmol·L-1鋁處理時,S169 根系中可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大,為CK 的121%；300 μmol·L-1鋁處理時R178 和S169 根系中可溶性蛋白質(zhì)含量分別降低為CK 的78%和45%,其中S169 根系中可溶性蛋白質(zhì)積累受到明顯抑制。 2 個品種葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鋁處理濃度的增加均呈不斷下降的趨勢。

圖3 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of aluminum on soluble protein content in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

2.2.2 鋁脅迫對油菜幼苗根系和葉片脯氨酸含量的影響 在生物體內(nèi),脯氨酸不僅是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),而且可作為膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑。由圖4可知,R178 和S169 根系中脯氨酸含量隨著鋁處理濃度的增加均呈先增加后減少的趨勢,150 μmol·L-1鋁處理時二者根系中脯氨酸含量均達(dá)到最大,分別為CK 的155%和136%。 2 個品種葉片中脯氨酸含量均呈不斷增加的趨勢,且均在300 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,其中R178 較CK 增加了一倍,S169 的增幅為66%。 綜上表明,油菜根系受鋁毒脅迫較葉片嚴(yán)重,無論是根系還是葉片中,R178 的耐鋁毒抗性均優(yōu)于S169。

圖4 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of aluminum on proline content in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

2.2.3 鋁脅迫對油菜幼苗根系和葉片細(xì)胞質(zhì)膜透性的影響 植物細(xì)胞膜對維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝具有重要的作用。 當(dāng)植物受到逆境影響時,細(xì)胞膜遭到破壞,膜透性增大,從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲,電導(dǎo)率增大。 由圖5可知,鋁處理下2 個油菜品種幼苗根系質(zhì)膜透性均有所增加,各處理下R178 根系相對電解質(zhì)外滲率較CK 分別增加了2、13、29、47 和54個百分點,除50 μmol·L-1鋁處理外,R178 根系相對電解質(zhì)外滲率與CK 間均差異顯著。 S169 根系相對電解質(zhì)外滲率的變化趨勢與R178 相同,200、300 μmol·L-1Al3+處理時2 個品種間均無顯著差異,100 μmol·L-1鋁處理時R178 和S169 根系相對電解質(zhì)外滲率分別較CK 顯著增加14 和38 個百分點。 50 μmol·L-1鋁處理時,R178 的葉片相對電解質(zhì)外滲率與CK 間無顯著差異,而其他鋁處理下其相對電解質(zhì)外滲率均顯著高于CK。 300 μmol·L-1鋁處理時,S169 葉片的相對電解質(zhì)外滲率達(dá)到最大,但與200 μmol·L-1鋁處理時無顯著差異。

圖5 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)質(zhì)膜透性的影響Fig.5 Effect of aluminum on membrane permeability in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

2.3 鋁脅迫對油菜幼苗根系及葉片保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 鋁脅迫對油菜幼苗根系及葉片SOD 活性的影響 由圖6可知,R178和S169根系中SOD活性隨著鋁處理濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢,各鋁處理濃度下R178 根系SOD 活性均高于S169。 R178 葉片中SOD 活性隨著鋁處理濃度的增加維持在較高水平,但無明顯的變化規(guī)律；300 μmol·L-1鋁處理時,R178 葉片中SOD 活性較CK 顯著增加35%；300 μmol·L-1鋁處理時,S1690 葉片的SOD 活性顯著低于其他鋁處理,但仍較CK 顯著增加16%。

圖6 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)SOD 活性的影響Fig.6 Effect of aluminum on SOD activity in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

2.3.2 鋁脅迫對油菜幼苗根系及葉片POD 活性的影響 由圖7可知,鋁處理下2 個品種油菜根系中POD活性均遠(yuǎn)高于葉片,且隨著鋁處理濃度的增加均呈先增加后降低的趨勢。 其中,根系中R178 的POD 活性在100 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,相對CK 的增幅達(dá)到22%,與150 μmol·L-1鋁處理間無顯著差異,但與其他鋁處理間均差異顯著；100 μmol·L-1鋁處理時S169 根系POD 活性最大,但仍顯著低于R178。 R178葉片POD 活性在100 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,較CK 高53%,鋁處理濃度為150 和200 μmol·L-1時R178 葉片POD 活性無顯著差異。 S169 葉片POD 活性在50 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,相對CK 的增幅為40%,且與其他鋁處理間均差異顯著,鋁處理濃度大于50 μmol·L-1時POD 活性顯著降低。

2.3.3 鋁脅迫對油菜幼苗根系及葉片CAT 活性的影響 由圖8可知,鋁脅迫下R178 根系的CAT 活性急劇升高,在100 μmol·L-1鋁處理時達(dá)到最大,較CK 顯著增加了86%,當(dāng)鋁脅迫濃度大于100 μmol·L-1時其活性逐漸降低,在300 μmol·L-1鋁處理時最小,但與CK 間無顯著差異。 S169 根系CAT 活性的變化趨勢與R178 相同,除CK 外,同一鋁處理濃度下,S169 根系CAT 活性顯著低于R178。 R178 葉片中CAT 活性在不同鋁處理下較CK 分別顯著增加了85%、96%、51%、33%和11%,S169 葉片中CAT 活性較CK 分別增加了34%、64%、25%、19%和5%。

圖7 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)POD 活性的影響Fig.7 Effect of aluminum on POD activity in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

圖8 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)CAT 活性的影響Fig.8 Effect of aluminum on CAT activity in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

2.3.4 鋁脅迫對油菜幼苗根系及葉片APX 活性的影響 由圖9可知,除50、200 μmol·L-1鋁處理外,相同鋁處理下2 個品種根系中APX 活性均無顯著差異。50 μmol·L-1鋁處理時,R178 葉片的APX 活性與CK間無顯著差異,當(dāng)鋁處理濃度高于50 μmol·L-1時,隨著鋁處理濃度的增加,APX 活性呈先升高再降低趨勢,300 μmol·L-1鋁處理時較CK 顯著降低32%。 S169葉片APX 活性在50 μmol·L-1鋁處理時較CK 顯著增加16%,100 μmol·L-1鋁 處 理 時 達(dá) 到 最 大,但 與150 μmol·L-1鋁處理間無顯著差異,300 μmol·L-1鋁處理時較CK 顯著降低33%。

3 討論

研究表明,植物根尖(根冠、分生組織、伸長區(qū))是植物鋁積累的主要部位,也是鋁毒害的最初作用部位[24]。 鋁能夠與作物根尖細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜表面和細(xì)胞核等部位結(jié)合,從而抑制根尖細(xì)胞的伸長與分裂,作物根系受到鋁毒害后會導(dǎo)致主根變粗變短,根尖膨大變褐,側(cè)根和根毛減少甚至消失[25-26]。 本研究發(fā)現(xiàn)隨著鋁濃度的增加,油菜幼苗主根相對伸長率顯著降低,這與熊潔等[27]和崔雪梅等[28]研究鋁毒脅迫下油菜主根相對根長逐漸減小的結(jié)論一致。 周楠等[29]研究表明,鋁脅迫下,油菜根系形態(tài)發(fā)生變化,根長和根體積均受到抑制,這與本研究結(jié)果基本一致。 本研究中,低濃度鋁處理(50 μmol·L-1)對耐鋁油菜品種R178 的主根相對伸長率、總根長、總根表面積、根系平均直徑和總根體積均無顯著影響,但與CK 相比S169的相關(guān)指標(biāo)均受到明顯抑制；高濃度鋁處理下,2 個品種根系生長均受到顯著抑制,且隨著鋁處理濃度的增加S169 根系生長受抑制程度較R178 明顯,說明R178對鋁毒抗性顯著優(yōu)于S169。 綜上,R178 可作為深入研究油菜耐鋁機(jī)制的重要材料。

圖9 鋁對油菜根系(A)和葉片(B)APX 活性的影響Fig.9 Effect of aluminum on APX activity in root (A) and leaf (B) of Brassica napus L.

逆境脅迫下,植物會通過自身代謝變化(如增加脯氨酸含量)抵抗逆境脅迫,脯氨酸可以通過調(diào)節(jié)及維持細(xì)胞滲透壓來增加植物的抗逆性[30]。 本研究發(fā)現(xiàn)除50 μmmol·L-1鋁處理外,S169 根系和葉片中的脯氨酸含量均顯著高于CK,2 個油菜品種根系中脯氨酸含量隨著鋁處理濃度的增加均呈先增加后減少的趨勢,葉片中則呈不斷增加的趨勢；除50 μmmol·L-1鋁處理外,2 個品種的葉片中脯胺酸含量無顯著差異外,其他鋁處理下R178 根系和葉中的脯氨酸含量均顯著高于S169,說明R178 可以通過積累較多的脯氨酸來抵抗鋁毒害。 可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì),通過提高細(xì)胞的保水能力對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用,可作為反映植物抗性的指標(biāo)之一[31-32]。 本研究中,2 個油菜品種根系中的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鋁處理濃度的增加均呈先增加后減少的趨勢,這可能是由于低濃度鋁處理刺激了可溶性蛋白質(zhì)的快速合成和積累以抵抗不良環(huán)境(鋁脅迫),高濃度的鋁阻礙了蛋白質(zhì)的合成并導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。 前人研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫下,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、細(xì)胞表面離子環(huán)境以及跨膜離子通道環(huán)境發(fā)生改變[33],從而引起胞內(nèi)的離子、氨基酸、糖類等外滲,質(zhì)膜透性增加[25]。 本研究中,鋁處理濃度低于200 μmol·L-1時R178 根系質(zhì)膜透性明顯低于S169,50 μmol·L-1鋁處理時R178 根系和葉片的相對電解質(zhì)外滲率與CK 間均無顯著差異,說明同一鋁處理下R178 能夠使體內(nèi)的活性氧含量維持在較低水平,以減少活性氧對質(zhì)膜的破壞。

SOD 是植物體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子,通過歧化反應(yīng)將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2[34]；POD 可以清除體內(nèi)過量的H2O2和過氧化物[35]；CAT 是植物細(xì)胞內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶,可以將H2O2分解成H2O 和O2[36]；APX 是葉綠體內(nèi)專一清除H2O2的關(guān)鍵酶,在響應(yīng)逆境脅迫中起到重要作用[37],這些抗氧化酶相互作用,組成一個完整的防氧化系統(tǒng),可以及時清除植物體內(nèi)多余的活性氧(reactive oxygen species,ROS),減少細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。 王志穎等[38]研究發(fā)現(xiàn)油菜葉片中SOD 活性隨著鋁濃度的增加呈先減少后增加的趨勢,POD 和APX活性均呈增加的趨勢,當(dāng)鋁處理濃度為50 μmol·L-1時CAT 活性達(dá)到最大值,隨著鋁濃度繼續(xù)增加,CAT 活性迅速降低,這與本研究結(jié)果不同。 本研究中,2 個油菜品種幼苗根系中SOD、POD、CAT 及葉片中POD、CAT、APX 活性隨著鋁處理濃度的升高均呈先升高后降低的趨勢；100 μmol·L-1鋁處理時2 個品系根系和葉中的CAT 活性均達(dá)到最大值,隨后迅速降低。 造成上述差異的原因可能與供試油菜品種和處理時間有關(guān)。 本研究中,低濃度的鋁促進(jìn)了保護(hù)酶活性的升高以抵抗逆境,同一處理下耐鋁品種R178 的保護(hù)酶活性顯著高于敏感品種S169,但保護(hù)酶清除活性氧的能力是有限的,當(dāng)鋁濃度過高時,植物體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生速率大于清除速率,活性氧無法及時被清除進(jìn)而導(dǎo)致大量積累,對植物的細(xì)胞膜細(xì)胞器造成傷害,進(jìn)而使保護(hù)酶活性不斷降低。 這與韋東萍等[39]的研究結(jié)論相同。 本研究還發(fā)現(xiàn),與油菜根系相比,隨著鋁濃度的增加油菜葉片中SOD 仍可以維持較高活性,說明葉片受脅迫的傷害較根系輕。

4 結(jié)論

鋁脅迫對2 個油菜品種幼苗根系生長均有一定抑制作用,耐鋁油菜品種R178 通過更多的可溶性蛋白和脯氨酸積累及保護(hù)酶活性抵制鋁毒脅迫。 本研究結(jié)果進(jìn)一步解析了鋁毒脅迫對油菜幼苗生長影響的生理機(jī)制,耐鋁油菜品種R178 可用于深入開展油菜耐鋁分子機(jī)制相關(guān)研究。