陳智慧　譚麗珊　郭慧　馬美春

【摘要】 目的：探討乳腺癌組織冰凍與否對(duì)其常用免疫組織化學(xué)結(jié)果的影響。方法：收集近年來60例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌根治手術(shù)的病理組織蠟塊（必須有術(shù)中冰凍病理檢查），時(shí)間為2016年1月-2017年12月，將標(biāo)本分別對(duì)應(yīng)分類為冰凍組織與冰剩組織，分別制作成冰凍芯片與冰剩芯片，采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53陽性表達(dá)情況，并對(duì)比術(shù)中冰凍病理結(jié)果與術(shù)后石蠟病理的符合率。結(jié)果：冰凍芯片與冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。冰剩組織與術(shù)后石蠟病理對(duì)比，組織學(xué)大小≤3 cm符合率93.75%，組織學(xué)大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學(xué)級(jí)別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：乳腺癌組織冰凍會(huì)影響乳腺癌標(biāo)記物的陽性表達(dá)，建議病理醫(yī)師選擇冰剩組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，從而為患者提供更精準(zhǔn)的結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】 免疫組織化學(xué); 冰凍芯片; 乳腺癌組織; 冰剩芯片

【Abstract】 Objective：To discuss the impact of frozen breast cancer tissues on the immunohistochemical analysis results.Method：The pathological tissue paraffin blocks about 60 invasive ductal carcinoma patients underwent the radical operation（the frozen pathological examination was required during surgery）from January 2016 to December 2017 were collected.The specimens of the frozen tissues and remaining frozen tissues were made as the frozen paraffin block and remaining frozen paraffin block.The immunohistochemistry（S-P）method was used to detect the positive rate of estrogen receptor（ER），progesterone receptor（PR），cerbB-2 protein，Ki-67 and P53，the pathological coincidence rate of frozen paraffin block during surgery and postoperative paraffin block after surgery was compared.Result：The positive results of cerbB-2 protein，Ki-67，P53，ER and PR in frozen chips were significantly different from those in frozen chips（P<0.05）.Compared with paraffin pathology after operation，the coincidence rate of histological size ≤3 cm was 93.75%，and that of histological size >3 cm was 100%，there was significant difference between two groups（字2=6.398，P=0.011<0.05），and the overall coincidence rate was 95.00%（57/60）.At histological level，the overall coincidence rate was 91.67%（55/60），which was significantly different from that of frozen section（P<0.05）.Conclusion：The positive expressions of breast cancer markers are affected by the frozen breast cancer tissues.In order to improve the diagnosis accuracy，the pathologist shall take the remaining tissues to do the immunohistochemical staining.

【Key words】 Immunohistochemistry; Frozen paraffin block; Breast cancer tissues; Reaming frozen paraffin block

First-authors address：Shaoguan First Peoples Hospital，Shaoguan 512000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.14.031

乳腺癌在我國婦女中較為高發(fā)，發(fā)病率占婦女腫瘤的31%。早在20世紀(jì)50年代有學(xué)者就提出，對(duì)于乳腺癌，僅進(jìn)行手術(shù)治療是不夠的，需要進(jìn)行系統(tǒng)性的輔助治療[1]。近年來針對(duì)cerbB-2等標(biāo)記物表達(dá)的靶向治療方案在乳腺癌輔助治療中成為研究熱點(diǎn)。當(dāng)前乳腺癌常用的標(biāo)記物有雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、細(xì)胞增殖抗原標(biāo)記物（Ki-67）、cerbB-2及P53等，而各種標(biāo)記物的陽性百分率將直接影響患者的選擇用藥及預(yù)后判斷。通常乳腺癌手術(shù)會(huì)行術(shù)中冰凍切片，在送檢組織中將選取部分腫物制作冰凍切片（冰凍組織），剩余腫物（冰剩組織）將待冰凍切片完成后一同固定制作組織蠟塊用于常規(guī)病理診斷。而后，病理科將面臨如何選擇組織蠟塊行免疫組化，冰凍組織還是冰剩組織，以便為患者提供更精準(zhǔn)的結(jié)果目前鮮有報(bào)道。本研究中將采用回顧性研究，采用成熟的組織芯片技術(shù)，在同等條件下，對(duì)比近年來本科室乳腺癌冰凍組織與冰剩組織對(duì)應(yīng)的常用免疫組化結(jié)果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取60例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，時(shí)間為2016年1月-2017年12月，患者均行乳腺浸潤性導(dǎo)管癌根治手術(shù)?；颊呔鶠榕?，年齡35～66歲，平均（56.8±3.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;術(shù)前未進(jìn)行過放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤;有精神病史。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 由副主任醫(yī)師及以上職稱人員進(jìn)行取材或指導(dǎo)取材，選取可疑病變處進(jìn)行取材，所有標(biāo)本均為術(shù)中送檢的未固定新鮮組織。在送檢組織中將選取部分腫物制作冰凍切片（冰凍組織），剩余腫物（冰剩組織）將待冰凍切片完成后一同固定制作組織蠟塊，分別制作成冰凍芯片與冰剩芯片。

1.2.1 冰凍切片制作 取新鮮組織平放于冷凍頭上，放入OCT包埋劑適量，進(jìn)行冷凍操作，速凍后切成厚4～5 μm的切片，將其貼在防脫載玻片上。70 ℃預(yù)熱丙酮固定液，切片置于其內(nèi)固定2 min后，進(jìn)行HE染色，由病理科醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行病理診斷，30 min內(nèi)發(fā)出冰凍報(bào)道后，將冰剩組織做成常規(guī)石蠟切片，并與冰凍切片結(jié)果比較。

1.2.2 組織芯片制作 （1）HE切片于顯微鏡下明確并標(biāo)記癌巢;（2）借助HE切片于供體蠟塊的相應(yīng)部位標(biāo)記為取材部位;（3）將普通病理石蠟融化，進(jìn)行3次的反復(fù)沉淀，加入3%精制蜂蠟，制作成空白蠟塊，大小4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，室溫冷卻;（4）設(shè)計(jì)10×8點(diǎn)組織列陣，制成模塊，從供體蠟塊的選定部位用直徑0.6 mm的打孔針將組織芯逐個(gè)取出，放入預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模塊中，于60 ℃保溫箱中放置制成的組織芯片模塊，輕壓模塊使其排平。將模塊切成薄片，厚3 ?m裱于防脫玻片上，60～70 ℃ 1 h。

1.2.3 檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)條件：用全自動(dòng)免疫組化機(jī)器對(duì)各芯片進(jìn)行染色，每次完成一個(gè)抗體標(biāo)記物，即保證標(biāo)記每一抗體的所有芯片一次性完成試驗(yàn)，所有步驟均由機(jī)器自動(dòng)化完成。所需設(shè)備：全自動(dòng)免疫組化機(jī)器（生產(chǎn)廠家：瑞士羅氏公司，型號(hào)：Benchmark XT）;試劑：全套羅氏二抗檢測(cè)試劑ultraView Universal DAB;各種一抗標(biāo)記物（北京中杉公司）：ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53等;羅氏免疫機(jī)所需各種反應(yīng)試劑：EZprep、LCS、SSC、Reaction Buffer、CC1。

1.3 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Ki-67、P53陽性部位為細(xì)胞核，棕黃色，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%為弱陽性（+），陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為陽性（++），陽性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽性（+++）[2]。cerbB-2陽性細(xì)胞為膜著色;細(xì)胞數(shù)>10%為陽性，著色中等部分不連續(xù)為陽性（++），著色弱且不連續(xù)為弱陽性（+），著色強(qiáng)且連續(xù)為強(qiáng)陽性（+++）[3-4]。ER和PR以核出現(xiàn)棕黃色為陽性，著色細(xì)胞數(shù)<10%為陽性（+），10%～50%為弱陽性（++），著色細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽性（+++）[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種標(biāo)記物的陽性結(jié)果 病例間各標(biāo)記物陽性表達(dá)存在重疊現(xiàn)象，冰剩芯片cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結(jié)果均高于冰凍芯片，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.738、6.446、5.567、5.584、5.567，P<0.05），見表1。

2.2 術(shù)中冰凍切片與術(shù)后病理診斷比較 在組織學(xué)大小上，術(shù)后病理標(biāo)本共有48例組織學(xué)大小≤3 cm，其中38例組織學(xué)大小是一致的，符合率為79.17%，組織學(xué)大小>3 cm的12例患者，與術(shù)后診斷相符者11例，符合率為91.67%。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.273，P=0.012<0.05），整體符合率為81.67%（49/60）。在腫瘤組織學(xué)級(jí)別上，術(shù)中冰凍與術(shù)后石蠟病理總符合率為78.33%（47/60），Ⅰ級(jí)符合率為69.23%（9/13），Ⅱ級(jí)符合率78.79%（26/33），Ⅲ級(jí)符合率為85.71%（12/14）。術(shù)中冰凍病理相比于術(shù)后石蠟病理組織學(xué)級(jí)別升高者4例（6.67%），分級(jí)下降者9例（15.00%），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。冰剩組織與術(shù)后石蠟病理對(duì)比，組織學(xué)大小≤3 cm符合率93.75%（45/48），組織學(xué)大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學(xué)級(jí)別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2～5。

3 討論

乳腺癌以浸潤性導(dǎo)管癌居多，在我國婦女中發(fā)病率較高，病死率亦較高。近年來靶向治療在臨床上的發(fā)展較快，且取得較滿意的成效。通過標(biāo)記免疫組化，將為臨床靶向藥物的選擇、病情的預(yù)后判斷和鑒別診斷提供指導(dǎo)。當(dāng)前國內(nèi)外以靶向藥物的篩選為主要研究方向，常用的標(biāo)記物有ER、PR、cerbB-2（her2）、Ki-67、P53等。ER、PR是具有特定功能的蛋白，屬于核受體超家族中的甾體激素受體，對(duì)乳腺癌的生長、分化有調(diào)節(jié)作用。研究顯示，PR蛋白合成受ER調(diào)控，兩者均屬于表面核受體類，當(dāng)其結(jié)合不同的配體后，受體蛋白轉(zhuǎn)錄活性因子發(fā)揮作用，兩者共同表達(dá)時(shí)采取輔助內(nèi)分泌治療往往能夠獲益[6]。對(duì)ER（+）和/或PR（+）患者，對(duì)雌激素合成進(jìn)行抑制，阻斷雌激素與ER合成，降低雌激素水平，可抑制激素依賴性腫瘤的細(xì)胞生長，從而發(fā)揮治療作用。因而，了解乳腺癌患者ER、PR的陽性表達(dá)情況對(duì)指導(dǎo)輔助治療有重要意義。

cerbB-2是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是185 kD的跨膜糖蛋白，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)。臨床研究顯示，乳腺癌CerbB-2受體過表達(dá)的患者，采取單克隆抗體類藥物Herceptin治療有效，而陰性患者則治療無效，表明其是乳腺癌治療的有效靶點(diǎn)[7]。Ki-67抗原是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，其存在于除G0期以外的G1期、S期、G2期及M期。其開始于細(xì)胞周期G1期，隨著細(xì)胞周期的進(jìn)展其表達(dá)逐漸增加，至M期達(dá)峰值，之后逐漸下降，在細(xì)胞分裂期很快消失。研究表明，Ki-67表達(dá)的高低對(duì)研究腫瘤的生物學(xué)行為、評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)、判斷其危害性有重要意義，且還可作為乳腺癌化療敏感性指標(biāo)，相比于腫瘤腫塊的縮小，腫瘤細(xì)胞增殖率的降低更能反映腫瘤對(duì)化療敏感性[8-10]。P53位于17號(hào)染色體短臂上，P53基因突變可能是腫瘤進(jìn)展惡化的重要因素。研究表明，50%的癌癥患者均有P53基因的突變，乳腺癌P53突變率為20%～60%[11-13]。

目前，靶向治療藥物常常費(fèi)用昂貴，因而對(duì)乳腺癌常見的標(biāo)記物表達(dá)情況進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)乳腺癌術(shù)后規(guī)范治療有重要意義[14-17]。術(shù)中快速冰凍切片是判斷腫瘤性質(zhì)的重要方法，能夠?yàn)榕R床治療提供指導(dǎo)，但術(shù)中冰凍片仍存在一定的局限性，如冷凍技術(shù)影響切片質(zhì)量等，而影響檢測(cè)結(jié)果[18-20]。本研究中通過前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，冰凍芯片與冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），以冰剩組織的陽性表達(dá)更為明顯。提示快速冰凍技術(shù)會(huì)影響乳腺癌標(biāo)記物的陽性表達(dá)，原因分析為在快速冷凍的情況下，因溫度在短期內(nèi)劇烈變化而導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生跨膜結(jié)構(gòu)破壞，從而影響一些標(biāo)記物的陽性表達(dá)定位，陽性強(qiáng)度減弱，在切片中出現(xiàn)彌散，定位不準(zhǔn)確。因而在工作中應(yīng)盡量避免使用快速冷凍后的樣本進(jìn)行標(biāo)記物檢測(cè)，盡量選擇冰剩組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)，本研究中，術(shù)中送檢冰凍切片檢查的組織大小及組織學(xué)分級(jí)與術(shù)后石蠟病理結(jié)果符合率仍有待提高，進(jìn)一步提示術(shù)中冰凍切片存在一定局限性，易出現(xiàn)漏診及誤診的風(fēng)險(xiǎn)，但冰凍技術(shù)具有快捷、高效的優(yōu)點(diǎn)，相比于除石蠟切片診斷以外的其他手段，準(zhǔn)確率仍較高。冰剩組織與術(shù)后石蠟病理對(duì)比，組織學(xué)大小≤3 cm符合率93.75%，組織學(xué)大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學(xué)級(jí)別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示冰剩組織可提供更精準(zhǔn)的結(jié)果。

綜上所述，乳腺癌組織冰凍會(huì)影響乳腺癌標(biāo)記物的陽性表達(dá)，建議病理醫(yī)師選擇冰剩組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，為患者提供更精準(zhǔn)的結(jié)果。

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（收稿日期：2019-03-01） （本文編輯：程旭然）