李永江 張盼 張曉輝 張瑩瑩 宋俊喬 盧道文

摘要 分子生物技術(shù)是食用菌研究的一個重要手段，在食用菌中的應用已經(jīng)相當廣泛。根據(jù)近年來國內(nèi)外文獻報道，綜述了分子生物學在食用菌品種選育、菌種鑒定、食用菌遺傳多樣性、功能基因定位、基因編輯等方向的應用，為進一步促進食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了參考。

關(guān)鍵詞 分子生物技術(shù);品種選育;菌種鑒定;遺傳多樣性;功能基因定位;基因編輯

中圖分類號 S646文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0004-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract Molecular biology technique is a vital tool for edible fungi， which has been extensively applied in edible fungi. Based on domestic and foreign literature in recent years reported， we focused on application of molecular biology in edible fungi breeding， variety identification， edible fungi genetic polymorphism， gene mapping， gene editing technologies， which provided reference for further promoting the development of edible fungi industry.

Key words Molecular biology techniques;Variety breeding;Variety identification;Genetic polymorphism;Gene mapping;Gene editing

作者簡介 李永江（1987—），男，河南濮陽人，研究實習員，碩士，從事食用菌的栽培與育種工作。*通信作者，副研究員，從事玉米育種研究。

收稿日期 2019-03-06

食用菌是一類具有巨大經(jīng)濟效益的大型真菌，我國是食用菌栽培種類和產(chǎn)量最多的國家[1]，自Devries 1972年第一次分離出裂褶菌（Schizophyllum commune Franch）的原生質(zhì)體以來，分子生物技術(shù)在食用菌研究中的應用已經(jīng)相當廣泛[2]。分子生物技術(shù)作為遺傳領(lǐng)域的一種強有力工具，克服了傳統(tǒng)育種易受環(huán)境影響的缺陷，為食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展開拓了更廣闊的前景。筆者綜合近年來分子生物學在食用菌研究中的相關(guān)報道，分析其在食用菌品種選育、菌種分類鑒定、食用菌遺傳多樣性、食用菌基因定位、基因編輯等方向的應用，以期促進食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 食用菌品種選育

品種是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，我國食用菌菌種大規(guī)模自主選育是從20世紀70年代末80年代初發(fā)展起來的，育種方法主要有自然選育、人工馴化、雜交育種、誘變育種和原生質(zhì)體技術(shù)育種等[3]，其中雜交育種在食用菌育種中應用最廣、效果最顯著，分子標記輔助育種是食用菌雜交育種的重要手段，應用較廣泛的標記有隨機擴增多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequenceralated amplified polymorphism，SRAP）、內(nèi)部簡單重復序列（inter simple sequence repeats，ISSR）、特征序列擴增區(qū)域標記（sequence characterized amplified region，SCAR）。

白靈菇，學名白靈側(cè)耳（Pleurotus nebrodensis），是一種營養(yǎng)價值極高的食藥用真菌，近年來菌種退化、生產(chǎn)周期和育種時間長阻礙了白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。李莎[4]利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)處理白靈菇菌株，通過拮抗試驗將得到的39個單核菌株分為24個正極性菌株和15個負極性菌株，利用ISSR和SRAP標記單核菌株和親本，根據(jù)不同極性菌絲的特異片段，開發(fā)SCAR標記，設(shè)計特異引物，在白靈菇育種中可以快速篩選出不同極性單核菌株，提高育種效率，使育種工作更精確;同樣通過ISSR和SRAP技術(shù)對白靈菇親本和單孢雜交獲得的雜交子標記，聚類分析構(gòu)建UPGMA樹，選取遺傳距離與親本較遠和較近的雜交子進行栽培試驗，初步推斷雜交子與親本遺傳距離越近則表現(xiàn)型越近，利用分子標記快速篩選與親本性狀相似的雜交子。

草菇屬于同宗結(jié)合的菌絲，菌絲多核且無鎖狀聯(lián)合[5]，雜交種鑒定缺乏切實可行的方法[6]，隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記逐漸應用在草菇雜交后代鑒定，陳劍等[7]通過RAPD技術(shù)對草菇親本和雜交后代標記，成功鑒定出雜交產(chǎn)物;傅俊生等[8]通過SRAP標記篩選親本單26和親本單28的4條差異條帶，轉(zhuǎn)化為SCAR標記，設(shè)計特異SCAR引物，成功鑒定了草菇2628的雜種性。草菇喜溫，菌絲生長最適溫度為32～35 ℃，較高的溫度要求限制了自然條件下草菇的生產(chǎn)周期，選育耐低溫草菇菌種是一個研究方向，趙妍等[9]利用RAPD標記選出與低溫菌株遺傳距離較遠的草菇菌種作為親本，單孢雜交配對，溫度試驗淘汰不耐低溫的菌株，通過特異性交配型分子標記判斷雜交子的真實性，出菇試驗選育出耐低溫草菇雜交菌株。譚偉等[10]利用ISSR標記單孢雜交得到側(cè)耳菌株，結(jié)果顯示雜交菌株與親本具有遺傳差異。

2 菌種鑒定

食用菌生產(chǎn)中，由于部分從業(yè)者缺乏菌種保護意識或為了經(jīng)濟利益隨意冠名品種，導致菌種管理混亂，同物異名、同名異物現(xiàn)象嚴重，對于菌種快速準確鑒定勢在必行。由于形態(tài)學鑒定易受生長環(huán)境影響，親緣關(guān)系相近的品種拮抗試驗無差異，菌種不同生長時期同工酶試驗結(jié)果是不一樣的，因此同工酶分析不準確，而分子生物學能直接反映菌種DNA序列遺傳關(guān)系，不受環(huán)境和生育時期的影響，較傳統(tǒng)方法更加準確和客觀，已經(jīng)廣泛應用于菌種分類鑒定，常用的分子標記有簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）、細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因（cytochrome c oxidase subunit I gene，COI）。

2.1 SSR

SSR標記因其數(shù)量多、基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性豐富、易于檢測和共顯性標記等優(yōu)點，被作為優(yōu)良的遺傳標記應用到遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、分子生態(tài)學和進化學等研究領(lǐng)域[11-13]。葉翔等[14]利用SSR標記商業(yè)栽培的25份香菇品種，除了申香10號和申香12號不能區(qū)分，通過SSR條帶可以清晰鑒定出其余23個品種，為構(gòu)建香菇主栽品種特異指紋圖譜提供了依據(jù);董慧等[15]選取51株香菇為供試菌株，通過24對SSR引物標記供試菌株，篩選出9對SSR引物構(gòu)建指紋圖譜，實現(xiàn)了45株商業(yè)菌株的鑒定，結(jié)果表明SSR標記能夠準確鑒定香菇品種。

2.2 SNP

SNP是第三代分子標記，具有數(shù)量多、突變率低，在基因組中穩(wěn)定存在，分布密度高的優(yōu)點。王大莉等[16]通過SNP標記實現(xiàn)了對香菇菌種的快速鑒定，根據(jù)香菇uck、mapk和exg1功能基因序列，設(shè)計SNP引物，對15個香菇3個功能基因PCR擴增，擴增序列測序比對分析，綜合分析3個基因的SNP類型可以完全區(qū)分開15個香菇栽培菌株，SNP能夠?qū)崿F(xiàn)香菇的快速鑒定。

2.3 ITS

ITS是核糖體DNA序列，具有序列小、種間變異率低、應用范圍廣等優(yōu)點，在真菌分類鑒定上起到了重要作用。2011年第四屆國際生命條形碼大會上正式將其推薦為真菌的首選DNA條形碼，在隨后的2012年12月美國真菌研討會上，進一步確立了ITS作為真菌DNA條形碼的研究任務[17-18]。王曉娥等[19]對22株木耳菌株ITS序列測序，以黑耳為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示ITS序列能夠區(qū)分不同木耳屬菌種;黃晨陽等[20]采用形態(tài)學鑒定新疆采集的野生真菌阿魏蘑，結(jié)果顯示符合刺芹側(cè)耳托里斯變種的特征，ITS序列分析進一步驗證了該菌株與歐洲已報道的Pleurotus nerbrodensis 為不同種，該野生菌株是刺芹側(cè)耳獨立進化的一支，學名為刺芹側(cè)耳托里斯變種P.eryngii var.tuoliensis;黃晨陽等[21]對側(cè)耳屬16個種38個菌株的ITS序列擴增測序，分析不同菌種的趨異度，說明ITS序列可以完成大多數(shù)側(cè)耳屬種類的鑒定工作;ITS序列被廣泛應用于香菇[22-23]、靈芝[24-25]、雙孢蘑菇[26-27]、蟲草[28]等菌種鑒定。

2.4 COI

2003年加拿大分類學家Hebert 等[29]首次提出利用COI基因作為條形碼進行動物物種的快速鑒定，COI基因在動物和紅藻物種分類鑒定中被廣泛應用[30]，但在食用菌研究中報道較少。宋馳等[31]以15個側(cè)耳屬菌種為材料，在GenBank中查詢菌種COI序列信息，設(shè)計引物，經(jīng)過2輪PCR擴增，根據(jù)擴增條帶的大小和有無實現(xiàn)了15個側(cè)耳屬菌種的快速鑒定。

3 食用菌遺傳多樣性

種質(zhì)資源是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，豐富多樣的種質(zhì)資源決定著優(yōu)良菌株和高效功能基因的開發(fā)，分子生物技術(shù)是食用菌遺傳多樣性研究的重要工具。近年來應用

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）、目標起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）等分子技術(shù)研究食用菌遺傳多樣性成為熱點。

3.1 AFLP

AFLP是一種可以檢測整個基因組多態(tài)性的標記，具有分辨率高、重復好、可靠性強等特點。陳立佼等[32]利用AFLP標記分析了羊肚菌分離的49個單孢菌株的DNA多態(tài)性，為更深入的分子研究提供了理論基礎(chǔ);許曉燕等[33]對19株毛木耳進行AFLP標記，將菌株聚類為4組，揭示了毛木耳遺傳多樣性;李榮春[34]應用AFLP標記，分析了雙孢蘑菇的20個野生菌株和5個栽培菌株的遺傳多樣性，結(jié)果表明20個野生菌株具有豐富的遺傳多樣性，其遺傳變異大于栽培菌株。

3.2 TRAP

TRAP是2003年由HU等[35]從SRAP技術(shù)改進而來的新型分子標記，邱成書[36]通過篩選的28組TRAP引物對20株真姬菇菌株分析，揭示了菌株間具有豐富的遺傳多樣性;TRAP標記在香菇種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中也有應用[37];李黎[38]將TRAP標記應用到我國主栽的32個木耳菌株遺傳多樣性研究中。

3.3 SCoT

SCoT標記是2009年Collard等[39]新開發(fā)的一種目的基因分子標記，該標記能夠獲得與性狀相關(guān)的目的基因，趙夢然等[40]首次利用SCoT標記分析我國不同地理來源的63株野生白靈菇的遺傳多樣性，表明白靈菇遺傳多樣性與地理位置分布密切相關(guān)。

4 功能基因定位

食用菌大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀如菌絲生長速度、酶活性、質(zhì)量以及產(chǎn)量等都是數(shù)量性狀，表現(xiàn)為連續(xù)變異，是由多個數(shù)量基因座位（quantitative trait loci，QTL）和環(huán)境控制的，食用菌育種都是以獲得優(yōu)良農(nóng)藝性狀為目標的，常規(guī)育種方法難以實現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳改良，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，尋找與數(shù)量性狀位點緊密連鎖的分子標記，是QTL研究的基本方法[41]。龔文兵等[42]根據(jù)香菇全基因組序列開發(fā)出InDel標記，結(jié)合SRAP和TRAP分子標記，構(gòu)建香菇遺傳連鎖圖譜，定位了6個與香菇雙核體菌絲生長速度相關(guān)的QTLs，為香菇分子輔助育種和菌絲生長速度調(diào)控研究提供了依據(jù);GAO等[43]根據(jù)雙孢蘑菇全基因組序列，開發(fā)出SNP標記，構(gòu)建了SNP標記遺傳連鎖圖譜，定位了雙孢蘑菇抗機械損傷的關(guān)鍵因子，為抗褐變雙孢蘑菇分子育種提供了依據(jù)。

5 基因編輯

生命科學的迅速發(fā)展將人們帶到了后基因組時代，基因編輯成為了生命科學重要的研究領(lǐng)域，人們發(fā)明了第一代鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）[44]、第二代類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALEN）[45]、第三代 CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9）[46]基因編輯技術(shù)，與ZFNs和TALEN相比，CRISPR/Cas9設(shè)計簡單、操作方便、靶向效率高，被廣泛用于擬南芥、玉米、水稻、土豆[47]基因組定向編輯，在食用菌研究中報道較少。多酚氧化酶（PPO）是引起蘑菇褐化的一種酶類，Yangyi Nong課題組利用基因編輯技術(shù)，敲除了雙孢蘑菇6個PPO基因中的1個，使多酚氧化酶活性降低了30%，抑制了蘑菇的褐化，這是首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對大型真菌基因編輯的報道[48];靈芝能夠合成多種抗菌、抗腫瘤的活性物質(zhì)，但靈芝中URA3 基因阻礙了靈芝酸的合成;2017年HAO等[49]成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，在靈芝的基因組中形成雙鏈斷裂，誘導非同源末端連接，促進了URA3 基因的破壞，產(chǎn)生了更多靈芝酸。

6 小結(jié)與展望

隨著分子生物學和基因組學的迅速發(fā)展，DNA分子標記正由隨機標記（RDMs，random DNA markers）如RFLP、RAPD、AFLP向目的基因標記（GTMs，gene targeted markers）和功能性標記（FMs，functional marker）如SCoT、SRAP、SNP發(fā)展[50]，由對功能基因的測序、定位、克隆到對目標基因定向刪除、替換、插入的基因編輯，食用菌基礎(chǔ)科學研究進入了新的時代，越來越多簡單、低價、高效的分子標記被開發(fā)出來，更多重要功能基因被定位、克隆，基因編輯技術(shù)研究更加深入，將為整個食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來嶄新的一頁。

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