李豐超 尚祥 秦小萍

摘要 [目的]探索植物對(duì)其根際解鉀菌解鉀活性的影響。 [方法]從環(huán)境相似度較高的紅壤生境選取6種植物，篩選根際解鉀菌并以鉀長石為底物進(jìn)行搖瓶解鉀試驗(yàn)。[結(jié)果]分離得到6株解鉀菌，6株菌株經(jīng)4 d搖瓶培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基解鉀量為（16.875±3.173）mg/L，加富培養(yǎng)基解鉀量為（242.878 3±142.851）mg/L。[結(jié)論] 來源于不同種類植物根際土壤的解鉀菌解鉀能力不全相同，植物水浸液對(duì)相應(yīng)根際解鉀菌解鉀能力有明顯促進(jìn)作用，植物水浸液與根際解鉀菌協(xié)同解鉀能力存在差異。

關(guān)鍵詞 植物水浸液;解鉀菌;根際

中圖分類號(hào) S154.36文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0149-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.046

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Aqueous Extract of Plants on Activity of Potassiumsolubilizing Bacteria in Rhizosphere

Abstract [Objective] To explore the relationship between plants and potassiumsolubilizing bacteria in? rhizosphere.[Method] Potassiumlysing bacteria strains were screened from 6 plants which were selected from the red soil habitats with high environmental similarity，and test of potassiumdissolving were carried out using potassium feldspar as substrate. [Result] The amount of potassium was （16.875±3.173） mg/L in the basal medium and （242.878 3±142.851） mg/L in the rich medium after 4 days of culture in shake flasks cultured by 6 strains of potassiumdissolving bacteria which were isolated in rhizosphere. [Conclusion] The potassiumdissolving ability of potassiumdissolving bacteria derived from the different kinds of Rhizosphere is not the same. The aqueous extract of plant can promote the potassiumdissolving ability of potassiumdissolving bacteria in rhizosphere of corresponding. Synergistic ability of aqueous extract of plant and potassiumdissolving bacteria in rhizosphere of corresponding were differences.

Key words Aqueous extract of plant;Potassiumsolubilizing bacteria;Rhizosphere

基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660541）。

作者簡介 李豐超（1975—），男，河南新密人，講師，碩士，從事環(huán)境微生物研究。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物源農(nóng)藥研究。

收稿日期 2019-02-19

植物[1-3]通過改變土壤生態(tài)系統(tǒng)的微生物組成、土壤酶活性和土壤養(yǎng)分，創(chuàng)造對(duì)自身生長有利的土壤環(huán)境，提高自身對(duì)土壤養(yǎng)分的利用能力，以保證其種群順利繁殖，維持其競爭優(yōu)勢。植物種類被認(rèn)為是土壤微生物變化的重要驅(qū)動(dòng)力[4]。三葉鬼針草[5]對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、叢枝菌根真菌等土壤微生物具有較強(qiáng)的聚集能力，且其根際土壤聚集的微生物類群與該地植物種類密切相關(guān)。根際解鉀菌[6-8]具有較高的解鉀活性且對(duì)植物有促生作用。為了明確植物水浸液對(duì)根際解鉀菌解鉀活性的影響，筆者以云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山紅壤撂荒地天然植物群落中常見種（紫莖澤蘭、鬼針、桉樹幼苗、商陸、薹草、大薊）為研究對(duì)象，分離篩選根際解鉀菌，以相應(yīng)的植物莖葉水浸液添加入培養(yǎng)基，分析發(fā)酵液鉀含量對(duì)植物水浸液添加的響應(yīng)，以揭示植物與根際解鉀菌相互作用關(guān)系，為根際解鉀菌的富集、解鉀活性發(fā)掘提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 撂荒地紅壤。

在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山撂荒地選取與所研究植物生境環(huán)境相似度[9]較高的10個(gè)地點(diǎn)，各采集約1 kg表層土壤樣品（0～10 cm），自然風(fēng)干后挑出礫石，然后用木棒研碎使全部通過孔徑2 cm的土樣篩。所有土樣混合均勻后采用4分法獲取代表性土樣，篩分后測定級(jí)配及各粒徑鉀含量。

1.1.2 植物。

在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山撂荒地挑選長勢異常茂盛的紫莖澤蘭、薹草、桉樹幼苗、大薊、鬼針、商陸，收割莖葉后自然風(fēng)干用于制備植物水浸液。

1.1.3 植物根際土壤樣品。

將收割莖葉后的植株連根拔起，用抖落法收集須根間的根際土壤樣品，自然風(fēng)干后用于分離篩選根際解鉀菌。

1.1.4 供試培養(yǎng)基。

①鉀細(xì)菌富集及篩選培養(yǎng)基。

富集培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L，10%Fecl3溶液5滴，Na2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，硅酸鉀1 g/L，去離子水。篩選培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基+瓊脂15 g/L。

②解鉀能力測定培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖5 g/L，10%FeCl3溶液5滴，Na2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，鉀長石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（100目）2 g/L。加富培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基100 mL+5 mL植物莖葉水浸液。

③LB培養(yǎng)基[10]：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 0 g/L，瓊脂15 g/L，去離子水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 根際高效解鉀菌分離、篩選。

分別稱取不同植物根際風(fēng)干土樣5 g，加入滅菌后的100 mL/250 mL富集培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d。

用滅菌去離子水以10倍稀釋法依次配制10-1～10-6濃度梯度樣液，取10-5、10-6 2個(gè)濃度梯度的樣液100 μL，涂布于鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基平板，3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2 d左右。挑取圓形、透明、表面濕潤黏稠的大型菌落，進(jìn)行平板劃線純化，反復(fù)進(jìn)行3次，同時(shí)用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養(yǎng)。將純化后的菌株接入100 mL鉀細(xì)菌富集培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d后測定上清液鉀濃度，篩選高效解鉀菌。高效解鉀菌株用LB斜面培養(yǎng)基4 ℃保存并標(biāo)記。

1.2.2 植物水浸液制備。

分別稱取各植物10 g莖葉風(fēng)干樣，用剪刀剪碎至1 cm×1 cm大小，加入75 mL去離子水，室溫下（3～16 ℃）以120 r/min振蕩24 h，3 000 r/min離心5 min后取上清液。

1.2.3 搖瓶解鉀試驗(yàn)。

將6株純化后的根際解鉀菌接入100 mL滅菌后的解鉀能力測定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床擴(kuò)大培養(yǎng)4 d后作為接種液。在250 mL錐形瓶中裝入100 mL解鉀能力測定培養(yǎng)基（基礎(chǔ)或加富），在125 ℃下滅菌30 min，接種量5%，3次重復(fù)。搖床培養(yǎng)72 h后開始并間隔24 h停止振蕩30 min后抽取上清液5 mL，采用火焰光度計(jì)法測定溶液中鉀含量。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

①硅酸鉀、鉀長石及土壤。

全鉀采用氫氧化鈉熔融法[11]浸提;速效鉀采用中性乙酸銨溶液浸提，緩效鉀采用熱硝酸浸提[12];鉀含量采用火焰光度計(jì)法測定。

②植物水浸液。

植物水浸上清液鉀含量采用火焰光度計(jì)法測定。

③液態(tài)培養(yǎng)基。

搖床培養(yǎng)瓶靜置沉淀后用滅菌吸量管吸取2 mL上清液，去離子水稀釋后用火焰光度計(jì)法測定，解鉀菌解鉀能力分析時(shí)扣除所添加植物水浸液鉀貢獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0非參數(shù)分析中的Friedman檢驗(yàn)進(jìn)行K個(gè)相關(guān)樣本檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)根際解鉀菌株來源對(duì)解鉀能力的影響是否存在顯著差異，若存在顯著差異，再采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行兩配對(duì)樣本檢驗(yàn);采用非參數(shù)分析中的Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)各菌株2種培養(yǎng)基構(gòu)成的配對(duì)樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，以檢驗(yàn)植物水浸液對(duì)根際解鉀菌株解鉀能力的影響是否存在顯著差異。用Origin9.1制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀含量

土壤、硅酸鉀、鉀長石鉀含量見表1。由表1可知，土壤鉀淋溶損失程度取決于土壤風(fēng)化分解強(qiáng)度[13]，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山紅壤撂荒地鉀淋溶損失嚴(yán)重，鉀素供應(yīng)水平相對(duì)較低。紫莖澤蘭、鬼針、桉樹幼苗、商陸、薹草、大薊水浸液鉀含量分別為1 679.26、764.76、424.48、2 338.56、1 275.18、2 806.44 mg/L。在環(huán)境相似度極高的紅壤生境中，植物莖葉水浸液鉀濃度因植物種類不同而異，植物體內(nèi)全鉀含量差異可能與植物根際速效鉀供應(yīng)差異有關(guān)[14]。

2.2 根際高效解鉀細(xì)菌的分離、篩選

從6種受試植物根際分別篩選出一株高效解鉀菌，分別命名為KZ、KG、KA、KS、KT、KJ。其中，KA、KG菌株在鉀細(xì)菌富集培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)時(shí)，從第3天開始培養(yǎng)液變?yōu)槿榘咨こ頎?。商陸和鬼針根際初篩解鉀菌菌落特征見圖1。

2.3 各菌株發(fā)酵液鉀濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化特征

由圖2可知，除基礎(chǔ)培養(yǎng)基菌株KA、KG發(fā)酵液在第3天鉀濃度低于初始濃度外，各菌株發(fā)酵液鉀濃度均高于初始濃度;除基礎(chǔ)培養(yǎng)基菌株KS發(fā)酵液鉀濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長持續(xù)增加外，各菌株發(fā)酵液鉀濃度隨培養(yǎng)時(shí)間呈上下波動(dòng)，可能與解鉀菌對(duì)鉀的利用有關(guān);各菌株2種培養(yǎng)基發(fā)酵液鉀濃度隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢不同，且添加植物水浸液后發(fā)酵液鉀濃度更高。6株菌株經(jīng)4 d搖瓶培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基解鉀量為（16.875±3173）mg/L，加富培養(yǎng)基解鉀量為（242.878 3±142.851）mg/L。

采用Friedman檢驗(yàn)對(duì)6株菌株基礎(chǔ)培養(yǎng)基鉀濃度進(jìn)行分析，χ2=17.853，P=0.003<0.05，6株根際解鉀菌解鉀能力不全相同;采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.050），菌株KA與KZ、KT、KJ、KS，菌株KG與KZ、KJ間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Friedman檢驗(yàn)對(duì)6株菌株加富培養(yǎng)基鉀濃度進(jìn)行分析，χ2=21.8，P=0.001<0.05，6株根際解鉀菌在添加植物水浸液后解鉀能力不全相同;采用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.050），除菌株KA、KT、KG間，菌株KS、KZ間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余菌株間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)6株菌株在2種培養(yǎng)基經(jīng)4 d培養(yǎng)后鉀濃度進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，t=-3.919，P=0.011<0.05，表明添加植物水浸液4 d搖瓶培養(yǎng)后解鉀量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 植物水浸液對(duì)解鉀活性的影響

從圖3可以看出，添加植物水浸液后發(fā)酵液鉀濃度遠(yuǎn)高于對(duì)照，表明植物水浸液對(duì)根際解鉀菌解鉀活性影響較大。由圖4可知，植物水浸液加劇了菌株間解鉀能力差異，表明植物水浸液與相應(yīng)根際解鉀菌協(xié)同作用存在差異。

對(duì)各菌株基礎(chǔ)與加富培養(yǎng)基鉀濃度進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量Z=-2.023，P=0.043<0.05，說明植物水浸液添加前后培養(yǎng)液鉀濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明植物水浸液對(duì)相應(yīng)根際解鉀菌解鉀能力有明顯促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，在環(huán)境相似度較高且鉀素供應(yīng)水平較低的紅壤生境，植物莖葉水浸液鉀濃度因植物種類不同而異，可能與植物根際速效鉀供應(yīng)差異有關(guān);來源于不同種類植物根際土壤的解鉀菌解鉀能力不全相同，添加植物水浸液后培養(yǎng)基鉀濃度顯著升高，植物水浸液對(duì)相應(yīng)根際解鉀菌解鉀能力有明顯促進(jìn)作用;植物水浸液加劇了菌株間解鉀能力的差異，植物水浸液與相應(yīng)根際解鉀菌的協(xié)同解鉀作用存在差異。

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