武玉祥 萬合鋒 封天洪 李永霞 文光琴 聶飛

摘要 [目的]充分利用藍(lán)莓葉資源，研究藍(lán)莓葉內(nèi)藥效活性物質(zhì)蘆丁的含量，建立一種檢測(cè)藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁含量的方法。[方法]采集裁剪后的藍(lán)莓葉經(jīng)清洗、水分晾干、低溫預(yù)冷凍、真空冷凍干燥、甲醇回流提取、過濾、甲醇定容后，采用高效液相色譜法測(cè)定蘆丁含量，色譜柱為Diamonsil RP-18e（250 mm×4.0 mm，5 μm），以乙腈-四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃/磷酸水溶液的體積比為5∶95，pH 3.0）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，進(jìn)樣量20 μL。[結(jié)果]10個(gè)品種的藍(lán)莓裁剪葉內(nèi)蘆丁的平均含量為11.52 mg/g，其中蘆丁含量最高的品種藍(lán)雨為12.837 mg/g，蘆丁含量最低的品種芭爾德溫為10.600 mg/g。蘆丁量在0.402 8～4.028 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。蘆丁平均回收率為98.41%，RSD為1.59%。[結(jié)論]裁剪后的藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁含量豐富，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、重現(xiàn)性好，可用于藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁的含量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 藍(lán)莓葉;蘆丁;含量;檢測(cè)

中圖分類號(hào) TS255.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.058

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]In order to make full use of the resources of blueberry leaves and research the content of rutin in blueberry leaves，a method for the determination of rutin in abandoned blueberry leaves was established.[Method]Gathering the cut blueberry leaves，and then cleaning，air drying，low temperature prefreezing;vacuum freeze drying，methanol circumfluence extraction，filtration，methanol constant volume，rutin content was determined by HPLC.The column was Diamonsil RP18e（250 mm×4.0 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitriletetrahydrofuran phosphoric acid solution （the volume ratio of tetrahydrofuran/ phosphoric acid solution was 5 μm，pH 3.0），the flow rate was 1mL/min，the column temperature was 35 ℃，the detection wavelength was 350 nm，the injection dose was 20 μL.[Result]The average content of rutin in cut leaves of 10 varieties of blueberry was 11.52 mg/g.The highest rutin content was 12.837 mg/g in Bluerain，and the lowest was 10.6 mg/g in Biloxi.There was good linear relationship when the content of rutin was in the range of 0.402 8-4.028 0 μg，respectively.The average recovery ratio of rutin was 98.41% and RSD was 1.59%.[Conclusion]The cut blueberry leaves are rich in rutin content.The method is simple，accurate，high precision and reproducible.It can be used to detect the quality of rutin in blueberry leaves.

Key words Blueberry leaves;Rutin;Content;Detection

基金項(xiàng)目 貴州省重大科技專項(xiàng)“山地藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（黔科合重大專項(xiàng)字〔2015〕6013）;貴州省平臺(tái)建設(shè)“貴州藍(lán)莓工程技術(shù)研究中心建設(shè)”（黔科合平臺(tái)人才〔2016〕5202號(hào)）;貴州省院合作專項(xiàng)“高叢藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化高效栽培技術(shù)研究及示范”（黔科院SY字〔2016〕03-1）;貴州科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（黔科J合字〔2017〕14號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 武玉祥（1985—），男，山東臨沂人，碩士，助理研究員，從事分子生物學(xué)研究。 *通信作者，研究員，從事小漿果種質(zhì)資源培育、繁殖與栽培研究。

收稿日期 2019-01-10

藍(lán)莓，英文名：blueberry（Vaccinium Spp），雙子葉植物，屬杜鵑花科（vacciniaceae）越桔屬（Vaccinium），多年生落葉或常綠灌木[1]，其成熟果實(shí)為藍(lán)色，因富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和花青素等生物活性物質(zhì)而備受廣大消費(fèi)者喜愛，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and agriculture organization of the united nations）譽(yù)為“人類五大健康食品之一”[2]。目前對(duì)藍(lán)莓的研究主要集中在藍(lán)莓栽培、品種繁育、果實(shí)花青素及果實(shí)深加工等方面[3]。

近年來，隨著我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，對(duì)藍(lán)莓葉的研究也逐漸增多[2]，藍(lán)莓葉內(nèi)富含多糖、原花青素、花色苷、黃酮類等多種生物活性物質(zhì)和微量元素[4]，對(duì)藍(lán)莓葉的研究主要集中在葉內(nèi)生物活性物質(zhì)的提取、功能性飲料研發(fā)、藍(lán)莓葉鞣制茶等[5-6]，這些產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)后反響較好[7]。但由于藍(lán)莓葉開發(fā)的產(chǎn)品主要以藍(lán)莓嫩葉、嫩芽作為原料，就藍(lán)莓而言[8]，為增加產(chǎn)量及果實(shí)質(zhì)量（果粉厚度、果實(shí)顏色等），大多在定株時(shí)只保留3～5個(gè)主枝，樹心中空以保證透光性，目的是增加果實(shí)的產(chǎn)值，沒有過多的嫩葉、嫩芽可用于采摘[9-10]。嫩葉、嫩芽的采摘期主要集中在春季和夏季，這2個(gè)季節(jié)正是藍(lán)莓生長(zhǎng)旺盛期，大部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、養(yǎng)分等都是經(jīng)光合作用、蒸騰作用等產(chǎn)生[11]，在這一時(shí)期采集嫩芽、嫩葉會(huì)減少植株整體葉片數(shù)量，進(jìn)而降低光合作用速率和蒸騰作用能力，對(duì)植株生長(zhǎng)和果實(shí)的發(fā)育造成不良影響[12]。每年藍(lán)莓采摘后1個(gè)月左右進(jìn)入藍(lán)莓裁剪季節(jié)，大量的藍(lán)莓枝葉被丟棄或被焚燒，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4]，被摒棄的藍(lán)莓枝上大多是健康的藍(lán)莓葉，可利用資源（生物活性物質(zhì)）較多，其中黃酮類化合物蘆?。≧utin）、蕓香苷等含量豐富，在藍(lán)莓葉內(nèi)含量可達(dá)13.12 mg/g[1]，蘆丁及其合成物曲克蘆丁具有廣泛的藥理活性，可降低毛細(xì)血管的通透性和脆性，保持和恢復(fù)毛細(xì)血管彈性，臨床主要用于防治高血壓、腦溢血、糖尿病、視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等心腦血管疾病，也可用作食品抗氧化劑和色素[8]。

筆者對(duì)裁剪丟棄的藍(lán)莓枝條上的葉片進(jìn)行蘆丁的提取并利用高效液相色譜法測(cè)定蘆丁的含量，旨在為藍(lán)莓葉的資源利用和藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁藥材質(zhì)量檢測(cè)方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-10N，北京亞星儀器科技有限公司）;高效液相色譜儀（U3000， 德國賽默飛世爾公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Re-205，上海予華公司）;電子分析天平（ME104E，德國梅特勒托利多公司;ALC-210.4， 瑞士沙多利斯公司）;優(yōu)普超純水儀（H03，成都優(yōu)普有限公司）;電子調(diào)溫電熱套（98-1-B，天津泰斯特儀器有限公司）;循環(huán)水真空泵（SHB，鄭州長(zhǎng)城科技有限公司）;超聲波清洗器（KQ-1000DE，昆山舒美公司）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-AB，天津泰斯特公司）;超低溫冰箱（DW-86L102，澳柯瑪公司）;研缽、pH計(jì)（PHS-25，上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

藍(lán)莓葉采自貴州省麻江縣瑞藍(lán)果業(yè)有限公司，采集時(shí)間為2018年9月中旬，采集裁剪藍(lán)莓枝葉，品種共10個(gè)，分別為藍(lán)雨（Blue-rain）、奧尼爾（ONeal）、密斯提（Misty）、夏普藍(lán)（Sharpblue）、萊格西（Legacy）、頂峰（Climax）、芭爾德溫（Baldwin-T-117）、早藍(lán)（Earliblue）、燦爛（Britewell）、粉藍(lán)（Powderblue），其中供試品是藍(lán)雨品種葉片。采集無病害、新鮮健康葉片。對(duì)照品來源：蘆丁對(duì)照品購自美國Sigma公司，純度 ≥ 96%;甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為去離子水（pH 7.2）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制。

1.3.1.1 對(duì)照品溶液。

精密稱取真空干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.07 mg，置于25 mL的滅菌后烘干容量瓶中，加分析甲醇至刻度線，充分搖勻，得質(zhì)量濃度為0.402 8 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

1.3.1.2 供試品溶液。將采摘的新鮮藍(lán)莓葉用滅菌去離子水沖洗干凈，在滅菌15 min后的超凈工作臺(tái)上晾干葉片表面水分，置于-60 ℃的超低溫冰箱中預(yù)凍12 h，然后轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)，真空度10 Pa，冷阱溫度-50 ℃，隔板加熱溫度25 ℃，連續(xù)干燥24 h至恒重，取出后迅速放入預(yù)冷研缽（研缽置于-20 ℃預(yù)冷30 min）快速研磨，粉末過50目篩，密封于50 mL離心管中再放入可封口樣品袋中，-60 ℃保存?zhèn)溆?。精密稱量在干燥器中平衡過夜的藍(lán)莓葉粉末0.501 5 g，置于索氏提取器中，加入甲醇100 mL，55 ℃水浴加熱，回流提取3 h，將液體過濾，回收濾液，將濾液揮發(fā)，用甲醇定容到10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液備用。

1.3.2 方法學(xué)試驗(yàn)。

1.3.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。

選用 Diamonsil RP-18e（250 mm×4.0 mm，5 μm）色譜柱;以乙腈/四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃∶磷酸水溶液=5∶95，V/V，pH 3.0）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。在選定條件下，蘆丁與雜質(zhì)峰基線分離，分離度（R）>1.5，蘆丁塔板數(shù) >3 000。

1.3.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取質(zhì)量濃度為0.402 8 mg/mL對(duì)照品溶液，按“1.3.2.1”色譜條件分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL測(cè)定峰面積，以峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.3.3 精密度試驗(yàn)。

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，均按照“1.3.2.1”色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)5次對(duì)照品峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取對(duì)照品溶液、供試品溶液各1份，室溫下分別放置0、2、4、12、24、48 h后，依“1.3.2.1”色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)。

取藍(lán)莓葉6份，按照“1.3.1.1”樣品處理方法，按照“1.3.2.1”色譜條件，每份進(jìn)2針，每針20 μL，計(jì)算蘆丁的含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），要求RSD<3%。

1.3.6 加樣回收率試驗(yàn)。

根據(jù)線性范圍設(shè)計(jì)蘆丁含量高、中、低3種水平，精密吸取已測(cè)知蘆丁含量的藍(lán)莓葉適量，分低、中、高3個(gè)水平，每水平3份，再分別按要求精密加入一定量的對(duì)照品，按“1.3.2.1”測(cè)定蘆丁含量，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性。由圖1可知，蘆丁對(duì)照品在16.310 3 min處出現(xiàn)最大吸收峰，主峰峰形尖銳無雜峰;樣品密斯提在16.500 min處出現(xiàn)最大吸收峰，且主峰峰形尖銳，無雜峰;樣品藍(lán)雨、奧尼爾分別在16.510 2和16.620 2 min出現(xiàn)最大吸收峰，主峰峰形尖銳無雜峰。各樣品與對(duì)照品最大吸收峰時(shí)間十分接近，都在16.5 min左右，對(duì)照品和樣品分別進(jìn)樣2針，峰形重疊良好。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。按“1.3.2.1”色譜條件分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 185.3 x+22.383，R2=0.999 9，表明蘆丁含量在0.402 8～4.0280 μ g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.1.3 精密度。按照“1.3.2.1”色譜條件操作，蘆丁的RSD=1.36%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性。按照“1.3.2.1”色譜條件，獲得蘆丁的RSD=0.809%，表明樣品供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性。按照“1.3.5”進(jìn)行操作，獲得蘆丁RSD=1.48%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.1.6 加樣回收率。由表1可知，蘆丁的加樣平均回收率為98.41%，RSD值為1.59%，表明加樣回收率符合要求。

2.2 樣品中蘆丁含量的測(cè)定結(jié)果

取10個(gè)品種的藍(lán)莓葉，按照供試品溶液制備方法操作，每批平行操作2份，結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)可以計(jì)算得出，10個(gè)品種的藍(lán)莓裁剪葉內(nèi)蘆丁的平均含量為11.517 5 mg/g。

3 結(jié)論與討論

藍(lán)莓富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和花青素、多酚、黃酮等生物活性成分，具有保護(hù)視力、提高免疫力、預(yù)防抑制癌癥等多種保健功效，因而備受廣大消費(fèi)者歡迎[2]。截止到2018年，貴州省藍(lán)莓栽培總面積超過1.33萬hm2[13]，占全國藍(lán)莓種植面積的1/3，年產(chǎn)量3萬t，均居全國首位;產(chǎn)值20億元，帶動(dòng)農(nóng)民增收10億元，帶動(dòng)旅游、運(yùn)輸、冷藏、包裝等多行業(yè)發(fā)展，產(chǎn)業(yè)鏈總產(chǎn)值超過30億元。藍(lán)莓在貴州省經(jīng)濟(jì)中占較大比重，是農(nóng)民脫貧、致富的重要支撐產(chǎn)業(yè)[13]。

每年藍(lán)莓采摘后（9月份）進(jìn)入藍(lán)莓修剪期，這一時(shí)期藍(lán)莓枝葉生長(zhǎng)旺盛，近年來課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著貴州省藍(lán)莓種植規(guī)模擴(kuò)大，大量的藍(lán)莓枝葉被堆積、丟棄、焚燒，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等問題，給藍(lán)莓種植戶和種植企業(yè)造成極大困擾，是目前藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)中亟待解決的問題。蘆丁因具有較強(qiáng)的藥理活性，毒性低，具有抑制出血、治療輕度腹瀉、保護(hù)血管等作用[14]，在自然界植物中廣泛存在[15]，其中越桔屬植物藍(lán)莓，其葉內(nèi)蘆丁含量豐富[2]，我國東北地區(qū)民間常用野生藍(lán)莓葉煮水治療腹瀉。

不同品種的藍(lán)莓枝葉中蘆丁的含量存在差異[11，16-17]，該試驗(yàn)選取貴州地區(qū)主要栽培藍(lán)莓品種中的南高叢品種密斯提（Misty）、奧尼爾（O' Neal）、夏普藍(lán)（Sharpblue），北高叢藍(lán)莓品種早藍(lán)（Earliblue）、萊格西（Legacy），兔眼藍(lán)莓粉藍(lán)（Powderblue）、芭爾德溫（Baldwin-T-117） 、頂峰（Climax）、燦爛（Britewell）[5，18]，雜交品種藍(lán)雨（Blue-rain）為研究對(duì)象，測(cè)定不同品種藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁含量，為開發(fā)藍(lán)莓葉蘆丁提供重要依據(jù)。研究表明：不同的干燥方式（熱風(fēng)干燥、真空干燥、微波干燥、真空冷凍干燥等）對(duì)藍(lán)莓葉內(nèi)蘆丁分離含量和抗氧化活性影響較大[8，19-21]，其中真空冷凍干燥獲得的蘆丁含量最高（10.20 mg/g），抗氧化活性最強(qiáng)。利用微乳液相色譜法分離測(cè)得藍(lán)莓葉內(nèi)的蘆丁含量較高，達(dá)13.12 mg/g。該試驗(yàn)選取最佳干燥方式中低溫、低氧分壓的真空冷凍干燥法分離藍(lán)莓葉內(nèi)的蘆丁，保證了蘆丁的活性，采集裁剪后的藍(lán)莓葉，避免了資源的浪費(fèi)和焚燒等不當(dāng)處理帶來的環(huán)境污染。再采用索氏甲醇回流提取的方法，將溫度上限設(shè)置至55 ℃，減少蘆丁活性損失。經(jīng)多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以乙腈/四氫呋喃磷酸水溶液（四氫呋喃/磷酸水溶液=5∶95，V/V，pH 3.0）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm時(shí)，出峰最多，峰形最佳[22]。

采用高效液相色譜法測(cè)定了10個(gè)品種藍(lán)莓葉內(nèi)的蘆丁含量，平均值為11.52 mg/g，其中含量最高的品種藍(lán)雨為12.837 mg/g，含量最低的品種芭爾德溫為10.600 mg/g。通過該方法處理后，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉HPLC共有峰6個(gè)，可為藍(lán)莓葉HPLC指紋圖譜建立提供一定依據(jù)。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性、回收率均符合要求，可用于藍(lán)莓葉藥材質(zhì)量的控制。

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