張曉敏,何志勇,2,曾茂茂,秦 昉,陳 潔,2,*

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品安全國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇無錫 214122)

大豆廣泛生長在世界各地,大豆的蛋白質(zhì)含量很高,約占大豆總含量35%～40%。大豆蛋白含有人體所需的各種氨基酸,比例合理,營養(yǎng)價值高,是最具發(fā)展?jié)摿Φ闹参锏鞍譡1]。大豆蛋白不僅在營養(yǎng)方面有很多優(yōu)點,在功能性質(zhì)上也有出色的表現(xiàn)。大豆蛋白的凝膠性可以用于肉類、豆腐等食品的制作,乳化性可以用于咖啡伴侶中,而起泡性則是制作蛋糕、充氣糖果和冰淇淋等泡沫體系食品的重要功能性質(zhì)。但是天然的大豆蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性并不是特別理想,不能滿足實際應(yīng)用的需要。目前常用物理改性[2]、化學(xué)改性[3]、酶法改性[4]等方法改善大豆蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。

泡沫和乳液等食品分散體系的形成和穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)在界面處的吸附和其它動態(tài)界面行為(例如膜粘彈性)息息相關(guān)。目前,常用界面流變學(xué)技術(shù)研究界面處蛋白質(zhì)的吸附形成過程以及吸附層中分子間的相互作用[5]。7S是大豆蛋白中的一個重要組分,其乳化性和起泡性明顯優(yōu)于11S。胃蛋白酶選擇性水解可以保留大豆蛋白的7S組分,水解11S組分。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)大豆蛋白經(jīng)選擇性水解11S后的產(chǎn)物，其乳化性卓越,可以媲美酪蛋白酸鈉[6]。但是其起泡性的研究并沒有進(jìn)行,所以在此基礎(chǔ)上,本文使用配備有Du Noüy環(huán)的旋轉(zhuǎn)流變儀研究大豆分離蛋白(SPI)、β-伴大豆球蛋白(7S)、大豆蛋白選擇性水解物(SPSH)及大豆蛋白限制性水解物(SPLH)在空氣-水界面處的吸附層界面剪切流變行為和攪打性質(zhì),并與蛋清蛋白(EW)作對比。通過界面剪切流變學(xué)獲得大豆蛋白的空氣-水界面性質(zhì),分析不同結(jié)構(gòu)對大豆蛋白界面剪切流變學(xué)行為和攪打性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(臺灣292)、雞蛋 無錫歐尚超市;木瓜蛋白酶(>2000 U/mg) 生工生物工程(上海)股份有限公司;胃蛋白酶(3000～3500 U/mg) 上海斯信生物科技有限公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(14.4～97.4 kDa) 上海升正生物技術(shù)有限公司;正己烷、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、鹽酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸氫鈉、氯化鈉等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JZ7114型粉碎機(jī) 上海朝陽微電機(jī)廠;Avanti J-26XP高速離心機(jī) 美國Beckman公司;GL-10MD大容量高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;LGJ-25C冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;HAAKE MARS Ⅲ流變儀 德國Thermo Scientific公司;Mini-PROTEAN3Cell凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司;DDQ-A40A1型電動打蛋器 小熊電器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白及其水解產(chǎn)物和蛋清蛋白的制備 按照Diftis等[7]的方法制備大豆分離蛋白(SPI)。將大豆去皮、粉碎,用正己烷∶無水乙醇=10∶1 (v/v)脫脂2 h,料液比1∶3 (w/v),使用真空循環(huán)水泵抽提,在通風(fēng)廚內(nèi)風(fēng)干過夜,得到脫脂豆粉。脫脂豆粉加10倍(w/v)的水,用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0,室溫攪拌2 h,離心(6500 r/min,20 min),取上清,將上清液用2 mol/L HCl調(diào)至pH至4.5,靜置30 min,離心(3750 r/min,10 min),取沉淀,將沉淀加水復(fù)溶,調(diào)節(jié)pH至7.0,冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

根據(jù)Ruíz-Henestrosa等[8]的方法稍作修改制備β-伴大豆球蛋白(7S)。將大豆去皮、粉碎、脫脂,脫脂豆粉加15倍(w/v)的水,用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5,室溫攪拌2 h,離心(6500 r/min,20 min)。在上清液中加入0.98 g/L亞硫酸氫鈉,用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至6.4,4 ℃靜置過夜。離心(6500 r/min,20 min),在上清液中加入0.25 mol/L NaCl,用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0,4 ℃攪拌1 h,再次離心(6500 r/min,20 min)。上清液加1倍(v/v)的水稀釋,用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.8,攪拌1 h,離心(6500 r/min,20 min)。沉淀用去離子水清洗3遍,加水復(fù)溶,調(diào)節(jié)pH至7.0,冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

大豆蛋白選擇性水解產(chǎn)物(SPSH)由大豆蛋白分離物制備,根據(jù)Li等[6]的方法稍作修改。將7%(w/v)SPI溶液在55 ℃變性30 min,用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0。將SPI溶液在37 ℃下用胃蛋白酶(E/S=1%)水解3 h。酶反應(yīng)完成后,立即用2 mol/L NaOH將混合物調(diào)節(jié)pH至7.0,進(jìn)行巴氏殺菌。離心(6500 r/min,20 min)后,將上清液冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

大豆蛋白限制性水解產(chǎn)物(SPLH)由大豆蛋白分離物制備,根據(jù)Li等[6]的方法稍作修改。將5%(w/v)SPI溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,在50 ℃的條件下加入木瓜蛋白酶(E/S=0.2%)水解至pH-stat法測得水解度為1.0%時停止水解。水解結(jié)束后將水解產(chǎn)物在沸水中加熱10 min,并在冰水中冷卻至室溫。離心(6500 r/min,20 min)后,將上清液冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱備用。

用分蛋器分開蛋清和蛋黃,蛋清液除去系帶,在較低轉(zhuǎn)速下攪拌均勻,制備蛋清蛋白(EW)。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE在4%濃縮膠和12%分離膠下進(jìn)行。使用pH8.0的緩沖液,緩沖液中含有0.01 mol/L Tris-HCl,2% SDS,10%甘油和0.02%溴酚藍(lán)。將濃度為0.2%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW分別與等體積的緩沖液混合,在沸水中加熱3 min,然后冷卻。將試樣(20 μL)上樣到凝膠上。將樣品用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1 h,并用脫色液(甲醇∶乙酸∶水=2∶3∶35)脫色,直至背景褪色。

1.2.3 界面剪切流變學(xué)測量 根據(jù)Li等[6]的方法,使用配備有鉑/銥(Pt/Ir)Du Noüy環(huán)的HAAKE MARS III流變儀測量待測樣品在空氣-水界面處的界面流變學(xué)。使用的Du Noüy環(huán)的直徑為19.450 mm,厚度為0.379 mm。將20 mL濃度為0.5%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW溶液分別置于燒杯(直徑38 mm)中,將Du Noüy環(huán)降低至與溶液表面剛好接觸。在開始每一系列測量之前執(zhí)行慣量校準(zhǔn)和MSC(微應(yīng)力控制)校準(zhǔn)以優(yōu)化測量結(jié)果。

先進(jìn)行第一次動態(tài)時間掃描,以γ=1%的應(yīng)變振幅(在線性區(qū)域中)和ω=1 rad/s的角頻率掃描1 h,記錄彈性模量(G′)、粘性模量(G″)和復(fù)數(shù)粘度(η)隨時間的變化。之后在ω=1 rad/s下,在γ=0.01%～100%的范圍內(nèi)進(jìn)行動態(tài)應(yīng)變掃描,記錄彈性模量(G′)隨應(yīng)變振幅的變化。最后,進(jìn)行第二次動態(tài)時間掃描,參數(shù)和第一次動態(tài)時間掃描一致,以觀察應(yīng)變掃描后的結(jié)構(gòu)恢復(fù),記錄復(fù)數(shù)粘度(η)隨時間的變化。所有測量均在室溫下進(jìn)行。

1.2.4 攪打起泡性測定 根據(jù)Li等[9]的攪打方法測量泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩(wěn)定性(FS)。將50 mL濃度為16%(w/v)的SPI、7S、SPSH、SPLH和EW溶液分別轉(zhuǎn)移至500 mL塑料量筒中,然后用電動打蛋器以最高檔攪打10 min。泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩(wěn)定性(FS)計算如下:

其中:V0是液體的初始體積;V1是泡沫的體積;V2是靜置30 min后的泡沫體積。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本文數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次重復(fù);顯著性差異使用Statistix 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計;圖片使用Origin 8.5軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白及其水解物的SDS-PAGE

圖1顯示了SPI、7S、大豆蛋白選擇性水解產(chǎn)物(SPSH)、大豆蛋白限制性水解物(SPLH)和蛋清蛋白(EW)的SDS-PAGE圖譜。大豆分離蛋白(SPI)主要由7S和11S組成。7S是由α′(71 kDa),α(67 kDa)和β(50 kDa)三個亞基組成的糖蛋白,通過非共價鍵結(jié)合。從SDS-PAGE圖譜中可以看出,自提的7S純度不是特別高,還存在部分11S組分。11S由酸性亞基A(約35 kDa)和堿性亞基B(約20 kDa)組成,兩個亞基通過二硫鍵形成穩(wěn)定的AB亞基。SPI經(jīng)胃蛋白酶水解得到的SPSH,11S亞基帶消失,7S的三個亞基仍然存在,實現(xiàn)了大豆蛋白的選擇性水解。SPI經(jīng)木瓜蛋白酶水解得到的SPLH控制了水解度至1%,僅留下分子量約10 kDa的多肽鏈,幾乎沒有二級結(jié)構(gòu)。蛋清中蛋白質(zhì)種類很多,從SDS-PAGE中可以看出三個比較明顯的條帶。EW在35～45 kDa有一個很寬的條帶,主要是卵白蛋白、卵球蛋白G2和卵球蛋白G3,70 kDa左右的條帶為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,而10 kDa左右的條帶為溶菌酶。

圖1 大豆蛋白及其水解物的SDS-PAGE圖譜

2.2 大豆蛋白及其水解物的界面剪切流變學(xué)行為

2.2.1 蛋白質(zhì)吸附過程中的模量變化 泡沫的形成和穩(wěn)定很大程度上取決于蛋白質(zhì)在界面的吸附、展開、重排以及它們的相互作用。時間掃描實驗可以監(jiān)測界面處蛋白質(zhì)的動態(tài)吸附過程[6]。圖2顯示了第一次時間掃描空氣-水界面處蛋白質(zhì)層的界面彈性模量(G′)和粘性模量(G″)隨時間的變化。

圖2 蛋白質(zhì)的彈性模量(G′)和粘性模量(G″)隨時間的變化

從吸附開始,SPI和7S的彈性模量G′總是大于粘性模量G″,表明SPI和7S在空氣-水界面處的界面膜一直是以彈性為主導(dǎo)的。而SPSH和SPLH,最初G″大于G′,但G″的增長速率較慢,G′迅速增加,增長幅度大于G″,并持續(xù)一段時間,在那之后,G′超過G″。不同結(jié)構(gòu)的蛋白在界面吸附時的表現(xiàn)不同,SPI和7S為球狀蛋白質(zhì),吸附至界面展開所需的能量較大,所以吸附速度較慢,而經(jīng)過酶解的SPSH和SPLH分子量降低,多肽的結(jié)構(gòu)更加靈活,所以開始時的G′比較小,但是可以快速地吸附至界面上,迅速增加粘彈性模量。Baldursdottir等[10]指出,球狀蛋白質(zhì)會在界面處展開和結(jié)構(gòu)重排。G′和G″的增加有可能是界面處的蛋白質(zhì)分子通過疏水相互作用建立網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[11],也可能是多層吸附結(jié)構(gòu)的形成。球狀蛋白質(zhì)在界面處的相互作用更強,導(dǎo)致形成的界面膜粘彈性高于SPLH,而SPSH同時存在7S組分和多肽,既可以快速地吸附至界面,同時形成粘彈性強的界面膜。蛋清蛋白(EW)的G′和G″比SPI,7S,SPSH和SPLH大一個數(shù)量級,并且G′總是大于G″,表明由EW形成的界面膜在吸附過程中主要表現(xiàn)出彈性,粘彈性很強。隨著吸附時間的增加,EW的G′和G″迅速增加,達(dá)到穩(wěn)定,表明EW在吸附到界面后迅速產(chǎn)生結(jié)構(gòu)重排,達(dá)到吸附平衡。EW具有較大的粘彈性模量和較快的吸附平衡,表明EW可以快速在空氣-水界面形成強粘彈性界面膜,防止氣泡積聚,從而保持泡沫的高穩(wěn)定性。

2.2.2 吸附層結(jié)構(gòu)斷裂情況 為了研究蛋白質(zhì)吸附層可能的結(jié)構(gòu)斷裂機(jī)理,進(jìn)行了應(yīng)變掃描實驗。圖3展示了不同蛋白質(zhì)在空氣-水界面處的彈性模量(G′)隨應(yīng)變的變化。

圖3 蛋白質(zhì)的彈性模量(G′)隨應(yīng)變振幅的變化

SPI和7S在空氣-水界面處的吸附層表現(xiàn)出幾乎相同的斷裂機(jī)制。SPI的彈性模量略大于7S的彈性模量,差別不大,均約為10 mN/m。SPI和7S的線性粘彈性區(qū)域幾乎沒有顯著差異,均約9%的應(yīng)變幅度。曾有報道稱大豆蛋白在空氣-水界面處的線性粘彈性區(qū)的應(yīng)變幅度小于0.2%[12]。SPSH的彈性模量大于SPI和7S,約為20 mN/m,表明一些小分子肽可以增加界面的粘彈性,但SPSH的線性粘彈性區(qū)小于SPI和7S,約6%的應(yīng)變幅度。SPSH可以通過形成堅固的高粘彈性界面膜維持泡沫穩(wěn)定性。雖然SPLH的彈性模量小于SPI和7S,但線性粘彈性區(qū)域大,超過10%,表明SPLH具有很強的抗變形能力,這可能是SPLH形成的泡沫穩(wěn)定性高的原因。通常,線性粘彈性區(qū)域越長,凝膠結(jié)構(gòu)越緊密,系統(tǒng)越穩(wěn)定。EW具有約50 mN/m的彈性模量,顯著高于SPI,7S,SPSH和SPLH,表明由EW形成的空氣-水界面膜具有很強的機(jī)械強度。因此,蛋清蛋白在劇烈機(jī)械攪打后可形成長期穩(wěn)定且大量的泡沫。

2.2.3 吸附層結(jié)構(gòu)恢復(fù)能力 在應(yīng)變掃描后快速進(jìn)行第二次時間掃描,并且通過比較第一次和第二次時間掃描的復(fù)數(shù)粘度的變化來檢測界面膜結(jié)構(gòu)破壞后的恢復(fù),結(jié)果如圖4所示。復(fù)數(shù)粘度η是彈性模量和粘性模量的綜合反映,可用于描述界面膜的總粘彈性變化。

圖4 蛋白質(zhì)的復(fù)數(shù)粘度(η)隨時間的變化

SPI,7S,SPSH,SPLH和EW的第二次吸附的復(fù)數(shù)粘度恢復(fù)非?？?并且最終的復(fù)數(shù)粘度都可以恢復(fù)到第一次吸附時的原始值。除EW外,其他四種蛋白質(zhì)在時間掃描的60 min內(nèi)無法達(dá)到吸附平衡。SPSH達(dá)到平衡所需的時間最長,其次是SPI和7S,SPLH最短。可能因為SPLH主要含有低分子量肽,幾乎沒有二級結(jié)構(gòu),所以達(dá)到吸附平衡時間最短。SPI和7S的分子量大,界面處的結(jié)構(gòu)重排復(fù)雜,而SPSH含有大分子量7S和小分子量肽,蛋白和多肽相互競爭吸附,需要更多能量才能部分?jǐn)U展到界面上,并且吸附在界面也是最復(fù)雜的。通常,更快的吸附速率表示更快地覆蓋空氣-水界面,有助于防止泡沫形成期間的聚集并促進(jìn)更小氣泡的形成。

2.3 大豆蛋白及其水解物的攪打起泡性質(zhì)

泡沫的形成取決于空氣-水界面處蛋白質(zhì)分子的遷移,解析和重排。通過攪打法測量不同蛋白質(zhì)的泡沫膨脹率(FE)和泡沫穩(wěn)定性(FS)如圖5所示。蛋白質(zhì)的起泡性質(zhì)基本上與它們在空氣-水界面的吸附及其形成薄膜的性質(zhì)有關(guān)[13]。對于SPI,泡沫膨脹率(FE)為450%,泡沫穩(wěn)定性(FS)是88.89%。7S的FE為400%,7S的FS為87.5%。從界面剪切流變學(xué)也可以看出SPI和7S在空氣-水界面的吸附速率很慢,導(dǎo)致SPI和7S的FE比較小。SPI和7S在空氣-水界面形成的界面膜最終G′分別為10.73 mN/m和8.766 mN/m,粘彈性模量較高,這是因為SPI和7S為球狀蛋白,分子間相互作用強,形成了以彈性為主導(dǎo)地位的界面膜,維持了泡沫的穩(wěn)定性,泡沫穩(wěn)定性較高。

圖5 通過攪打法測量的不同蛋白質(zhì)的泡沫膨脹率和泡沫穩(wěn)定性

與天然大豆蛋白相比,通過酶處理可以大大提高大豆蛋白的起泡性能。酶水解改善了大豆蛋白的起泡性質(zhì),其對蛋白質(zhì)的三種主要結(jié)構(gòu)變化為:平均分子量的降低,疏水區(qū)域的打開,以及可電離基團(tuán)的增加[14]。這些結(jié)構(gòu)變化影響水解產(chǎn)物中肽之間的分子間相互作用,從而影響它們的起泡和界面行為。向日葵分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性也可以通過有限的水解而增加[15]。限制性水解產(chǎn)物SPLH的FE有所提高,為700%,FS為90%。這是因為SPLH主要含有小分子多肽,可以快速地吸附至界面上,迅速增加粘彈性模量,從而提高SPLH的FE。但多肽的相互作用比球蛋白弱,所以SPLH的粘彈性模量比SPI和7S低。SPLH的線性粘彈區(qū)很大,超過10%,表明SPLH具有較強的抗變形能力,這可能是SPLH的FS增加的原因。選擇性水解產(chǎn)物SPSH同時含有7S和多肽,多肽可以快速地吸附至界面,球蛋白則可以增加粘彈性模量,所以SPSH的FE也有所提高,為680%,界面膜的粘彈性強度則提供了SPSH穩(wěn)定的泡沫穩(wěn)定性。EW的泡沫膨脹率很大,這是因為EW可以在空氣-水界面快速吸附完成結(jié)構(gòu)重排,達(dá)到吸附平衡,并且界面膜的彈性模量很大,有很強的機(jī)械強度。因此,蛋清蛋白在劇烈機(jī)械攪打后可形成大量長期穩(wěn)定的泡沫。Dabestani等[16]使用糖果混合器攪拌和轉(zhuǎn)移泡沫至玻璃漏斗稱重的方式計算泡沫膨脹率,測得的數(shù)值比本方法低,本方法的操作簡單,并與蛋糕制作的攪打過程類似,可以為將來大豆蛋白在蛋糕應(yīng)用過程中提供更多參考。

3 結(jié)論

本文使用配備有Du Noüy環(huán)的旋轉(zhuǎn)流變儀測定了大豆蛋白及其水解物在空氣-水界面處的吸附層界面剪切流變學(xué)行為,并揭示了其與攪打起泡性質(zhì)之間的關(guān)系。不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在空氣-水界面表現(xiàn)出不同的界面剪切流變學(xué)行為,SPI和7S為球狀蛋白質(zhì),吸附速度較慢,SPLH主要含小分子量多肽,可快速吸附至界面上。SPSH同時存在7S和多肽,既可快速吸附至界面,又能形成粘彈性強的界面膜。增加吸附至界面的速度有利于提高泡沫膨脹率。泡沫穩(wěn)定性與界面膜粘彈性模量大小和線性粘彈性區(qū)域大小密切相關(guān),增加粘彈性模量和線性粘彈區(qū)都可以增加泡沫穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明水解可以大大提高大豆蛋白的攪打起泡性質(zhì),為大豆蛋白在蛋糕、充氣糖果和冰淇淋等充氣食品的應(yīng)用開發(fā)提供了實際意義。