唐思煜,翁云丹,毛 舸,蔡成崗,2,3,*,毛建衛(wèi),2,3,*

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023;2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

燕麥?zhǔn)枪阮愔凶詈玫娜珒r(jià)營養(yǎng)食品之一,能夠治療和預(yù)防心腦血管疾病[1]、糖尿病[2]和肥胖病[3],同時(shí)還具有改善便秘[4]、促進(jìn)傷口愈合[5]、預(yù)防骨質(zhì)疏松的功效。燕麥中蛋白質(zhì)含量一般為13%～17%[6],氨基酸的含量均衡,且賴氨酸含量高;燕麥籽粒脂肪[7]含量約為5%～7%,其中非不飽和脂肪酸所占比例大[8];燕麥還含有豐富的膳食纖維和維生素E、B1和B2等,具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值。

食用植物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、谷豆類、海藻類、藥食兩用本草類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[9-12]。隨著人們保健意識的增強(qiáng),酵素受到了廣泛關(guān)注,酵素種類呈多樣化發(fā)展。發(fā)酵加工不僅保留了原料本身的營養(yǎng)成分,而且在發(fā)酵過程中通過菌種生長代謝產(chǎn)生新的活性物質(zhì),如氨基酸、酶、維生素、酚類等[13-14],促進(jìn)谷物酵素抗氧化、調(diào)節(jié)腸道平衡、增強(qiáng)免疫、減肥、解酒、抗菌、促進(jìn)傷口愈合等[15-19]功能。此外,發(fā)酵加工可以延長谷物產(chǎn)品的貨架期,改善品質(zhì)結(jié)構(gòu)和口感,提高食品的營養(yǎng)價(jià)值,同時(shí)產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)[20],使其更容易被大眾接受,是一種具有研發(fā)前景的高附加值加工方法。

目前國內(nèi)外的燕麥產(chǎn)品除了燕麥片、燕麥粥之外,還有通過發(fā)酵制得的燕麥乳酸飲料、燕麥面包、燕麥酸奶、燕麥啤酒[21-26]等,但是以裸燕麥種子為單一原料進(jìn)行酵母發(fā)酵生產(chǎn)酵素的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以裸燕麥種子為原料,添加純種酵母菌促進(jìn)酵解,添加糖類成分加速發(fā)酵,同時(shí)對比不添加糖類成分的裸燕麥種子發(fā)酵,選擇多酚含量為功能性成分指標(biāo)、還原糖和酒精含量為發(fā)酵進(jìn)程指標(biāo),并對基本營養(yǎng)成分可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測試,以考察不同發(fā)酵階段各物質(zhì)成分的變化情況,為新型裸燕麥酵素工藝優(yōu)化及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌種:安琪活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;山西裸燕麥 太谷縣綠寶種業(yè)有限公司;蔗糖 市售;中性-α-淀粉酶(10000 U/g)、糖化酶(100000 U/g)、福林酚、沒食子酸、DNS、氫氧化鈉、重蒸酚、無水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、考馬斯亮藍(lán)、磷酸、乙醇(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;叔丁醇(色譜純) 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;RHP-600型高速多功能粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司;UV-5500紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;PHS-3C 數(shù)顯酸度計(jì) 杭州奧利龍儀器有限公司;GC-2010 Pro 島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸燕麥酵素的制作 將揀過雜質(zhì)、碎粒的裸燕麥種子粉碎,過20目篩,按1∶10加入去離子水,在80 ℃下水浴糊化20 min,加入淀粉酶(相對底物數(shù)量添加的酶量為12 U/g),在60 ℃、pH6.0下液化50 min,調(diào)節(jié)pH至4.5,加入糖化酶(相對底物數(shù)量添加的酶量為100 U/g),在65 ℃下糖化50 min。糖化結(jié)束后121 ℃高溫殺菌20 min,確保樣品接種酵母菌后保持純種發(fā)酵狀態(tài)。將滅菌后的樣品分為六個(gè)平行,每三個(gè)平行為一組,每個(gè)平行約10 L,分別裝入20 L發(fā)酵罐中,各組皆加入5%的活化酵母菌(W/W),一組全加糖(9%,W/W),一組全不加糖,在28 ℃的環(huán)境下發(fā)酵168 h,每24 h取樣。樣品在8000 r/min下離心15 min,取上清液-20 ℃下冷凍保存,待測。

1.2.2 指標(biāo)檢測方法

1.2.2.1 還原糖含量測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:吸取0.05、0.01、0.15、0.2、0.25、0.3 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL)于10 mL試管中,用去離子水補(bǔ)至1 mL,加入3 mL的DNS試劑,混勻后在沸水浴中加熱5 min,冷卻后定容至10 mL,放置30 min,在520 nm下測定吸光度,以去離子水作為空白對照。

樣品測定:準(zhǔn)確吸取待測液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測定吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中還原糖含量(以葡萄糖計(jì))。

1.2.2.2 pH測定 使用PHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)進(jìn)行測定,每個(gè)樣品平行三次。

1.2.2.3 酒精含量測定 參照GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》[27]中方法進(jìn)行測定。

1.2.2.4 可溶性蛋白含量測定 裸燕麥酵素中可溶性蛋白含量(以牛血清蛋白計(jì))測定采用考馬斯亮藍(lán)法[28]。準(zhǔn)確吸取0、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL 1 mg/mL牛血清蛋白溶液,加入0.15 mg/L的NaCl溶液至1 mL,加入考馬斯亮藍(lán)試劑5 mL,避光反應(yīng)10 min,于595 nm波長下測定吸光度。樣品測定:準(zhǔn)確吸取待測液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測定吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中可溶性蛋白含量(以牛血清蛋白計(jì))。

1.2.2.5 總酚含量測定 參照文獻(xiàn)[29]方法稍作修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:配制0、100、200、300、400、500 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,取0.1 mL于10 mL離心管中,加入5 mL去離子水,0.5 mL 1 mol/L Folin-Ciocalteau試劑,混勻靜置8 min后,加入7.5 g/100 mL的Na2CO3溶液4 mL,充分混勻后在25 ℃水浴遮光靜置1 h,于765 nm波長處測定其吸光度,以去離子水做空白。樣品測定:準(zhǔn)確吸取待測液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作測定吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中總酚含量(以沒食子酸計(jì))。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中每個(gè)樣品做三個(gè)平行,每個(gè)處理重復(fù)三次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn),采用SPSS 24.0數(shù)據(jù)處理,使用T檢驗(yàn)、相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 還原糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖1所示,還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.0236x-0.1268(R2=0.9997)。

圖1 還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 酒精含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖2所示,乙醇/叔丁醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0039x-0.0163(R2=0.9996)。

圖2 乙醇/叔丁醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 可溶性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖3所示,得可溶性蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.9544x+0.2326(R2=0.9999)。

圖3 可溶性蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.4 多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖4所示,得回歸方程為y=1.5315x+0.0183(R2=0.99895)。

圖4 總酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 添加蔗糖對裸燕麥酵素中理化指標(biāo)和活性成分的影響

2.2.1 添加蔗糖對裸燕麥酵素中還原糖含量的影響 添加蔗糖對裸燕麥酵素中還原糖含量變化見圖5。發(fā)酵0 h時(shí)添加蔗糖與不添加蔗糖的發(fā)酵液中還原糖濃度差最大,為16.53 mg/mL,之后濃度差減小。這是因?yàn)榻湍妇M(jìn)入對數(shù)生長期,種群數(shù)量劇增,營養(yǎng)消耗劇大,還原糖濃度迅速下降,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,加糖裸燕麥酵素在72 h到達(dá)最低點(diǎn),還原糖含量為4.45 mg/mL,之后有略微回升。這可能是因?yàn)檎崽堑奶砑哟偈菇湍妇敝乘俣燃涌?相比不加糖樣品更快進(jìn)入發(fā)酵后期,酵母菌死亡速度超過繁殖速度,糖類物質(zhì)消耗速度減緩,死亡的菌體溶解于發(fā)酵液導(dǎo)致還原糖含量有所上升。而不加糖酵素在48 h后趨勢平緩下降,168 h時(shí)樣品中還原糖含量達(dá)到3.15 mg/mL。蔗糖添加與否對于裸燕麥酵素還原糖含量變化影響不明顯。

圖5 添加蔗糖對裸燕麥酵素中還原糖含量的影響

沈昌等[30]接種10%的酵母菌發(fā)酵糙米汁、麥芽汁和黃豆芽汁混合液48h,還原糖含量在18 h達(dá)到最低,之后趨于穩(wěn)定。杜慶爽[31]在紅棗汁中接種5%的不同酵母于27 ℃下發(fā)酵7 d,結(jié)果表明,10種酵母菌發(fā)酵液中還原糖含量變化趨勢相同,在0～2 d內(nèi)還原糖含量急劇下降,之后速度趨緩,直至基本保持不變。這些研究均與本文結(jié)果一致。在生長初期,酵母菌需要利用還原糖使自身菌體濃度增加,酵母菌的大量繁殖也促使還原糖進(jìn)一步被快速消耗。

2.2.2 添加蔗糖對裸燕麥酵素pH的影響 添加蔗糖對裸燕麥酵素pH含量影響的變化如圖6所示。高溫處理后,加糖的燕麥溶液pH較不加糖溶液pH低,可能是高溫滅菌過程中,蔗糖水解成部分的葡萄糖,進(jìn)一步解離成葡萄糖酸,降低了溶液中的pH,另外可能是蔗糖與燕麥中其他成分反應(yīng)等原因降低了溶液的pH,其原因需要進(jìn)一步探討。發(fā)酵過程中加糖裸燕麥酵素的pH在發(fā)酵過程中始終低于不加糖裸燕麥酵素,兩者變化趨勢相似,在24 h時(shí)pH分別由4.37、5.42降到3.48、4.16,且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長趨于穩(wěn)定。不加糖裸燕麥酵素pH穩(wěn)定在4左右,而加糖裸燕麥酵素pH在3.5上下浮動。酵母菌通過糖酵解途徑和三羧酸循環(huán),在生長期產(chǎn)生大量有機(jī)酸等酸類物質(zhì),導(dǎo)致pH驟降[30]。

圖6 添加蔗糖對裸燕麥酵素pH的影響

2.2.3 添加蔗糖對裸燕麥酵素酒精含量的影響 添加蔗糖對裸燕麥酵素發(fā)酵過程中酒精含量的變化對比見圖7。由圖7可知,不加糖裸燕麥酵素酒精含量發(fā)酵48 h時(shí),從0.09%上升到1.48%,48 h后趨于穩(wěn)定。加糖裸燕麥酵素在72 h時(shí),酒精含量達(dá)到最大值5.26%,之后逐漸降低,168 h時(shí)酒精含量為4.03%。杜慶爽[31]研究10種酵母菌發(fā)酵紅棗酒過程中酒精度變化趨勢發(fā)現(xiàn),4 d后酒精含量變化較平緩,7 d時(shí)酒精含量最高為8.2%,高于本試驗(yàn)所做的裸燕麥酵素。

圖7 添加蔗糖對裸燕麥酵素酒精含量的影響

2.2.4 添加蔗糖對裸燕麥酵素可溶性蛋白的影響 圖8為添加蔗糖對裸燕麥酵素中可溶性蛋白含量變化的影響。由圖8可知,蔗糖含量的添加對裸燕麥酵素發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量有非常明顯的影響。發(fā)酵48 h,加糖裸燕麥酵素的可溶性蛋白含量相比發(fā)酵前增加23.98%,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,可溶性蛋白含量緩慢上升,發(fā)酵168 h時(shí),增加量達(dá)到41.52%。與加糖裸燕麥酵素不同,不加糖裸燕麥酵素的可溶性蛋白含量在發(fā)酵48 h時(shí)下降54.24%,在48 h以后可溶性蛋白含量有所回升,但總體呈下降趨勢。蔗糖的添加降低了酵母對燕麥底物營養(yǎng)物質(zhì)的利用,相比于不加糖樣品,酵母菌繁殖后產(chǎn)生大量菌體蛋白,同時(shí)大分子蛋白水解成小分子溶于發(fā)酵液中,因此整體呈現(xiàn)上升趨勢。

圖8 添加蔗糖對裸燕麥酵素中可溶性蛋白的影響

沈昌等[30]研究發(fā)現(xiàn),以糙米為主要原料的富硒酵母發(fā)酵液在發(fā)酵過程中,可溶性蛋白含量迅速降低,18 h后緩慢上升。發(fā)酵初期,可溶性蛋白被菌種利用,導(dǎo)致其含量迅速下降,之后含量有所上升,可能是因?yàn)榫N死亡自溶引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)溢出。羅建成等[32]以玉米秸稈為原料經(jīng)多菌體發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白與發(fā)酵前相比,增幅為112.4%,與本試驗(yàn)結(jié)論類似,說明通過菌種發(fā)酵加工可以提高發(fā)酵產(chǎn)品中可溶性蛋白的含量。

2.2.5 添加蔗糖對裸燕麥酵素多酚含量的影響 添加蔗糖對裸燕麥酵素發(fā)酵過程中多酚含量的變化見圖9。發(fā)酵0 h時(shí),多酚含量結(jié)果相差(0.053±0.01) mg/mL,即(0.053±0.01) g/L,由于試驗(yàn)采用20 L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵,初始成分含量差異可能是由系統(tǒng)誤差引起的。由圖9可知,添加蔗糖可使裸燕麥酵素多酚含量明顯增加。隨著發(fā)酵時(shí)間延長,168 h時(shí)加糖發(fā)酵的裸燕麥酵素中多酚含量增加12.10%;不加糖發(fā)酵的裸燕麥酵素在發(fā)酵過程中多酚含量總體呈下降趨勢,發(fā)酵168 h時(shí)多酚含量下降4.13%,此時(shí)加糖裸燕麥酵素多酚含量比不加糖裸燕麥酵素高24.23%。

圖9 添加蔗糖對裸燕麥酵素中多酚含量的影響

發(fā)酵初始,加糖發(fā)酵液還原糖濃度為52.98 mg/mL,不加糖發(fā)酵液還原糖濃度為36.45 mg/mL。多酚含量的增加可能是因?yàn)樘砑诱崽翘岣吡税l(fā)酵液中糖的濃度,促進(jìn)燕麥中多酚等成分析出;糖類物質(zhì)促使酵母菌發(fā)酵降解燕麥,也使得發(fā)酵液中多酚含量增加。沒有添加蔗糖的發(fā)酵液中碳源相對于添加蔗糖組的少,因此后者樣品中有效成分,如多酚類物質(zhì)可能被酵母菌利用而導(dǎo)致其濃度降低。張敏[33]在酵母菌發(fā)酵蜂蜜酒研究中發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后蜂蜜酒中總酚和總黃酮含量均上升,分別達(dá)56.6%和55.4%,隨著初始糖度的增加,蜂蜜酒總酚和總黃酮的相對變化量呈逐漸減小趨勢。在酸茶釀制過程中,任翠娟等[34]發(fā)現(xiàn)釀制至21 d,隨著蔗糖添加量的增加,添加量為10%、13%的試驗(yàn)組釀制品茶多酚含量整體呈上升趨勢,其余試驗(yàn)組釀制品茶多酚含量隨著釀制時(shí)間延長呈下降趨勢。

王吉成等[35]通過接種冠突散囊菌孢子對桑葉進(jìn)行固、液態(tài)發(fā)酵,研究表明發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物中總多酚含量均降低,而對于桑葉水提取物,固態(tài)發(fā)酵降低其總多酚含量,液態(tài)發(fā)酵則無顯著影響。這與本文研究結(jié)果不同,可能是相比于酵母菌發(fā)酵,冠突散囊菌發(fā)酵處理使桑葉中的化合物被轉(zhuǎn)化類型有所不同。

2.3 裸燕麥酵素發(fā)酵過程中各指標(biāo)的相關(guān)性分析

添加蔗糖使燕麥中物質(zhì)含量的相關(guān)性產(chǎn)生變化(表1、表2)。多酚與可溶性蛋白(r=0.723)在加糖發(fā)酵樣品中具有顯著正相關(guān)性(p<0.05),而在不加糖樣品中兩者不存在相關(guān)性或者相關(guān)性極低,多酚與還原糖(r=0.855)、pH(r=0.879)、酒精含量(r=-0.923)存在極顯著的相關(guān)性(p<0.01)。發(fā)酵液中加入糖類物質(zhì),酵母菌大量吸收糖類物質(zhì)并轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白和多酚等活性成分。而不加糖發(fā)酵液中,多酚、蛋白等隨著還原糖一起被酵母菌利用,維持自身生長繁殖。

表1 加糖裸燕麥酵素中各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of the indexes in oat jiaosu with sucrose

表2 不加糖裸燕麥酵素中各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the substances contents in oat jiaosu without sucrose

此外,加糖發(fā)酵樣品的可溶性蛋白與酒精含量(r=0.831)具有顯著正相關(guān)性(p<0.05),與還原糖(r=-0.893)、pH(r=-0.863)具有極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01),與不加糖樣品趨勢相反。這也說明了添加的蔗糖作為燕麥中營養(yǎng)物質(zhì)的代替品被酵母菌吸收,從而減少了對燕麥底物本身的消耗,燕麥中的營養(yǎng)成分不斷溶解于發(fā)酵液中,酵母菌合成相關(guān)產(chǎn)物,共同影響發(fā)酵液中多酚及可溶性蛋白含量的上升。相似的是,兩種樣品的酒精含量與pH、還原糖之間都相互存在極顯著的相關(guān)性(p<0.01)。這說明一定程度的蔗糖添加不會過多影響酵母菌對還原糖的利用和酒精的產(chǎn)出。

3 結(jié)論

本研究通過添加蔗糖是否對裸燕麥酵素中理化和生理活性成分產(chǎn)生影響進(jìn)行初步考察,結(jié)果表明,加糖裸燕麥酵素pH始終低于不加糖裸燕麥酵素,還原糖含量在72 h降到最低,相比于不加糖樣品更快進(jìn)入發(fā)酵后期。168 h時(shí)加糖裸燕麥酵素中酒精含量、可溶性蛋白含量、多酚含量分別高出不加糖裸燕麥酵素205.30%、83.33%、24.23%。蔗糖的添加也影響各指標(biāo)間的相關(guān)性。多酚與可溶性蛋白、可溶性蛋白與酒精含量在加糖發(fā)酵樣品中具有顯著(p<0.05)正相關(guān)性;而不加糖樣品中多酚與其余指標(biāo)、可溶性蛋白與還原糖、pH之間存在顯著(p<0.01或p<0.05)的相關(guān)性。添加蔗糖可以降低酵母菌對燕麥營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,同時(shí)轉(zhuǎn)化出有效的活性成分,相比于不添加蔗糖的裸燕麥酵素發(fā)酵更快,更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的析出和活性成分的富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣說明蔗糖添加量可以作為裸燕麥酵素工藝的一個(gè)考察因素,其添加量等相關(guān)因素將在下一步酵素工藝優(yōu)化試驗(yàn)中進(jìn)行考察。