彭 帥，陳 朗，鄭天宇，陸會(huì)寧，張 麗，劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為動(dòng)物機(jī)體重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors)，廣泛存在于免疫細(xì)胞表面，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[1]，并且在上皮細(xì)胞、牛胚氣管細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中同樣具有很強(qiáng)的活性[2]。自第一個(gè)Toll樣受體于1997年被Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迄今已有十余個(gè)家族成員[4]，它們通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)及某些內(nèi)源性配體，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)特定的免疫效應(yīng)分子釋放(如炎癥細(xì)胞因子)，是固有免疫防御中的重要分子，最終可激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。TLR2屬于TLRs家族成員之一，是一種具有識(shí)別病原相關(guān)分子模式和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的跨膜受體蛋白，Mcguire等[6]將牛TLR2基因定位于17號(hào)染色體上。TLR2基因在機(jī)體中廣泛分布，且在調(diào)控免疫機(jī)制方面具有重要作用，使其成為了?？共∮N的候選基因之一。

TLR2具有較高的多態(tài)性，近年來(lái)，有關(guān)牛TLR2基因多態(tài)性及其與疾病的相關(guān)性研究已有大量報(bào)道。周峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，南陽(yáng)黃牛TLR2基因相比荷斯坦牛發(fā)生了16個(gè)堿基突變。孫麗萍[8]研究表明，牛TLR2基因存在3個(gè)突變位點(diǎn)，且感染嚴(yán)重的乳區(qū)TLR2基因表達(dá)量明顯增加。董慧敏[9]、葉小康[10]研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物感染奶牛子宮后TLR2基因mRNA表達(dá)量明顯增加，并分析了其與子宮內(nèi)膜炎的關(guān)聯(lián)性。Bhaladhare等[11]發(fā)現(xiàn)，牛TLR2基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，并分析了其與結(jié)核病的相關(guān)性。楊永江等[12]發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在6個(gè)SNP位點(diǎn)。這些研究表明，牛TLR2基因具有高度多態(tài)性，并與許多免疫性疾病有密切關(guān)聯(lián)，但有關(guān)大通牦牛TLR2基因的研究國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。

大通牦牛是分布于青海等地的特有品種，體格結(jié)實(shí)，體型相對(duì)緊密，肉用性能強(qiáng)，發(fā)育狀況良好，因此引起了人們的廣泛關(guān)注[13]。本實(shí)驗(yàn)以大通牦牛為研究對(duì)象，采用DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測(cè)序的方法對(duì)大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的SNP位點(diǎn)(單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，single nucleotide polymorphism site)進(jìn)行篩選分析，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為大通牦牛TLR2基因的深入研究和抗病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集

大通牦牛血樣采自青海大通牦牛種牛場(chǎng)，以隨機(jī)抽樣的方法，對(duì)55頭大通牦牛進(jìn)行頸靜脈采集全血10 mL，加ACD抗凝劑抗凝，利用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[14]?；蚪MDNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的奶牛TLR2基因序列(登錄號(hào)AF368419)和周峰等[7]已經(jīng)設(shè)計(jì)好的TLR2基因特異性引物，分成五段進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為522、822、574、526、599 bp。引物序列分別為：F1: 5′-GGACAATGCCACGTGCTT-3′，R1: 5′-GCACTGATCTCAAGCTCCTCAAG-3′；F2: 5′-TGAGGAGCTTGAGATCAGTG-3′，R2: 5′-ACTGTGTATCCTTGTGCTGG-3′；F3: 5′-CCTAGGTAATGTGGAGACG-3′，R3: 5′-AAGGAGGCATCTGGTAGAG-3′；F4: 5′-CCAGCACAAGGATACACAGT-3′，R4: 5′-CTTCATGTACCACAGTCCGT-3′；F5: 5′-TTCCTGTTGCTCCTGCTCAC-3′，R5: 5′-GACCACCACCAGACCAAGAC-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 DNA混合池構(gòu)建與PCR擴(kuò)增

55個(gè)大通牦牛基因組DNA樣品構(gòu)建一個(gè)DNA混合池，以DNA混合池為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix (百泰克)11 μL，加ddH2O到20 μL。PCR反應(yīng)過(guò)程：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，循環(huán)30次；最后延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 序列測(cè)定與分析

選擇擴(kuò)增效果良好的PCR產(chǎn)物直接送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行純化后雙向測(cè)序。使用BioEdit[15]軟件、MEGA6[16]軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并篩選大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的SNP位點(diǎn)。

1.5 等位基因頻率估算

利用MWSnap的度量尺測(cè)量大通牦牛TLR2基因各SNP位點(diǎn)峰圖峰高，并估算各SNP位點(diǎn)等位基因頻率，公式如下：

其中，HBC為等位基因B或C在SNP位點(diǎn)中的等位基因頻率；B和C表示等位基因在SNP位點(diǎn)中的峰圖峰高[17]。

1.6 生物信息學(xué)分析軟件

大通牦牛TLR2基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)使用在線程序RNA fold web server預(yù)測(cè)[18]；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站為https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html[19]；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)利用ExPASy的在線程序SWISS MODEL預(yù)測(cè)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大通牦牛TLR2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用分段擴(kuò)增方法，獲得包含大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的5段基因片段。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，引物特異性良好，PCR產(chǎn)物條帶單一。5段基因片段大小為522、822、574、526、599 bp，電泳結(jié)果與預(yù)期片段大小吻合(圖1)。

2.2 大通牦牛TLR2基因測(cè)序結(jié)果

利用MEGA6軟件、BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并篩選SNP位點(diǎn)，結(jié)果表明，大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)存在2個(gè)SNP位點(diǎn)(G677A、G1587A)，其中G677A位點(diǎn)導(dǎo)致半胱氨酸(Cys)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?Tyr)，G1587A位點(diǎn)未發(fā)生氨基酸突變(圖2)。

2.3 SNP位點(diǎn)等位基因頻率估算

圖2 大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)測(cè)序峰圖及SNP位點(diǎn)Fig.2 Sequencing peak map and SNP locus of coding region of TLR2 gene in Datong yak

應(yīng)用MWSnap軟件的度量尺對(duì)各SNP位點(diǎn)峰圖峰高進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)估算公式計(jì)算得G677A和G1587A位點(diǎn)等位基因頻率分別為G(0.606)、A(0.394)和G(0.829)、A(0.171)，結(jié)果表明，G677A位點(diǎn)和G1587A位點(diǎn)都以等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因(表1)。

2.4 大通牦牛TLR2基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

運(yùn)用在線程序(RNA fold web server 服務(wù)器)預(yù)測(cè)參考序列(登錄號(hào)AF368419)和大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)(G677A、G1587A)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。對(duì)比參考序列mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)均導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步造成mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能發(fā)生變化。參考序列mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能為-679.3 kcal·mol-1，G677A位點(diǎn)和G1587A位點(diǎn)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能均有所增加，依次為-679.10、-677.60 kcal·mol-1。

2.5 大通牦牛TLR2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

大通牦牛TLR2基因G677A位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生細(xì)微變化(圖4)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)突變前：α-螺旋(h)占34.18%，β-折疊(e)占18.24%，無(wú)規(guī)則卷曲(c)占47.58%；二級(jí)結(jié)構(gòu)突變后：α-螺旋(h)占35.71%，β-折疊(e)占16.84%，無(wú)規(guī)則卷曲(c)占47.45%。

2.6 大通牦牛TLR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

圖3 TLR2基因CDS區(qū)各SNP位點(diǎn)突變前后mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Contrast of secondary structure of TLR2 gene before and after mutation of SNP sites in coding region

運(yùn)用在線程序SWISS MODEL進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)蛋白三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，大通牦牛TLR2蛋白突變后三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生細(xì)微變化，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋較多，與二級(jí)結(jié)構(gòu)相符(圖5)。

h，α-螺旋；e，β-折疊；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲。h， α-helix; e， β-folding; t， β-corner; c， Irregular crimping.圖4 大通牦牛TLR2蛋白突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.4 Comparison of secondary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

圖5 大通牦牛TLR2蛋白突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.5 Comparison of tertiary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

3 討論

基因和環(huán)境的共同作用決定生物體的表型性狀，基因的多樣性決定生物體的基本免疫功能[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因作為固有免疫與適應(yīng)性免疫之間的橋梁，在動(dòng)物機(jī)體中占據(jù)著重要地位[23]。近年來(lái)，有關(guān)牛TLR2基因的研究主要集中在TLR2基因的結(jié)構(gòu)和功能、多態(tài)性及其與疾病的相關(guān)性上。白杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)。廖純穎[25]研究表明，奶牛不活躍的乳腺成纖維細(xì)胞同樣表達(dá)TLR2。林寶山等[26]利用熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中有高表達(dá)現(xiàn)象。TLR2蛋白還能識(shí)別并結(jié)合牛腸中的微小隱孢子蟲[27]。Lan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因在牦牛脾臟中同樣具有較高的表達(dá)。Yang等[29]研究表明，牛TLR2蛋白可通過(guò)NF-Κb途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生。Zhao等[30]發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在2個(gè)SNP位點(diǎn)，并分析了其與結(jié)核病的相關(guān)性。

DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測(cè)序是一種簡(jiǎn)單有效的SNP位點(diǎn)篩選方法[31]。單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism site，SNP)是指從基因組水平上對(duì)單個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)進(jìn)行研究和分析，對(duì)于研究基因的功能和指導(dǎo)抗病育種具有重要意義[32]。本研究采用DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測(cè)序的方法在大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)篩選到2個(gè)SNP位點(diǎn)(G677A、G1587A)，其中G677A位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致半胱氨酸(Cys)轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼?Tyr)，氨基酸的改變會(huì)導(dǎo)致TLR2蛋白的功能發(fā)生相應(yīng)的變化。

CDS區(qū)核苷酸的改變可能會(huì)引起mRNA結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的功能。大通牦牛TLR2基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，兩個(gè)SNP位點(diǎn)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，自由能相比參考序列(登錄號(hào)AF368419)均有所增加，導(dǎo)致mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，可能會(huì)影響基因表達(dá)效率。大通牦牛TLR2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占主導(dǎo)地位，G677A位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致α-螺旋由34.18%增加至35.71%，β-折疊由18.24%降低至16.84%，無(wú)規(guī)則卷曲由47.58%降低至47.45%。由于無(wú)規(guī)則卷曲是構(gòu)成配體受體結(jié)合的活性部位，G677A突變可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性造成影響，從而影響蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化。本研究對(duì)大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的多態(tài)性進(jìn)行了分析，檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)義突變的SNP位點(diǎn)，可作為篩選大通牦牛疾病遺傳標(biāo)記的理論基礎(chǔ)。