薩如拉，楊恒山，高聚林，宋桂云，李媛媛

（1．內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

秸稈還田是改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，發(fā)展持續(xù)農(nóng)業(yè)、旱作農(nóng)業(yè)的重大措施；內(nèi)蒙古地區(qū)每年均有大量玉米秸稈被作為柴草燒掉或在田頭燒掉，進(jìn)行秸稈還田規(guī)模較少；冷涼地區(qū)冬季時(shí)間長、氣溫低，導(dǎo)致秸稈腐熟不完全；溫度成了冷涼地區(qū)推廣秸稈還田技術(shù)的主要瓶頸。張星等［1］的研究表明，土壤微生物量碳、氮均與土壤溫度顯著正相關(guān)，而與土壤水分的相關(guān)性較差，玉米生育期土壤溫度是影響土壤微生物量變化的主要因素之一。李曉莎［2］的研究中秸稈還田主要對(duì)0～10 cm土層微生物起作用，但匡恩俊等［3］的研究中秸稈還田下層土壤微生物量碳、氮的含量高于中、上層土壤。冀保毅等［4］的研究表明，秸稈還田能增加整個(gè)耕層土壤微生物數(shù)量；顧美英等［5］的研究中不同秸稈還田方式均能顯著提高和田沙化土壤微生物活性和功能多樣性，秸稈直接粉碎還田有增加土傳病害的風(fēng)險(xiǎn)。于寒［6］研究表明，在玉米連作種植方式下，秸稈深埋可增強(qiáng)微生物代謝活性。而李濤等［7］的研究表明，秸稈還田對(duì)土壤微生物功能多樣性指數(shù)沒有顯著性影響。目前關(guān)于秸稈還田土壤微生物效應(yīng)多樣性的影響還沒有一致的定論，主要原因是土壤微生物特性的影響因素互同作用很復(fù)雜。因此，有必要分地區(qū)研究秸稈還田后土壤微生物特性的變化，為秸稈腐熟劑研制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技示范園區(qū)（土默特右旗薩拉齊鎮(zhèn)）秸稈還田定位試驗(yàn)田，砂壤土。試驗(yàn)區(qū)屬半干旱中溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫6～8℃，年降水總量400 mm，無霜期140 d，海拔1 015 m，年日照時(shí)數(shù)2 806 h，年活動(dòng)積溫為3 000～3 500℃。試驗(yàn)地有機(jī)質(zhì)含量20.03 g/kg，堿解氮57.74 mg/kg，有效磷7.77 mg/kg，速效鉀89.33 mg/kg；基施 N 40.5kg/hm2、P2O5103.5kg/hm2、K2O 45kg/hm2，拔節(jié)期一次追施N 172.5kg/hm2，生育期間灌水4次。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2013年設(shè)玉米秸稈深翻還田一年（SF-Ⅰ）和常規(guī)旋耕秸稈不還田（CK）、2012～2013年連續(xù)兩年玉米秸稈深翻還田（SF-Ⅱ）3個(gè)處理，3次重復(fù)，玉米秸稈還田方式為秋季全量（折干物質(zhì)6 750kg/hm2）粉碎（秸稈長度2～3 cm）還田，還田深度30 cm。玉米品種為鄭單958，種植密度7.5萬株/hm2，小區(qū)面積214 m2。

播種期、苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、灌漿期、成熟期進(jìn)行采樣。本研究區(qū)耕層較淺（20 cm左右），半熟化層在耕作層以下20 cm左右，0～20、20～40 cm土層采用5點(diǎn)取樣法，按對(duì)角線取樣；同一處理同一生育期土樣分別混合均勻，3個(gè)處理6個(gè)時(shí)期2個(gè)土層樣品共36份，按四分法取100 g土壤樣品裝入已滅菌的自封袋中，將新鮮土樣分別過2 mm篩用于土壤總DNA提取，風(fēng)干土壤用于測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)和土壤纖維素酶活性。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

土壤細(xì)菌群落16S rDNA-PCR-DGGE分析采用文獻(xiàn)［8］方法進(jìn)行。

土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法［9］測(cè)定。

土壤纖維素酶活性用3、5-二硝基水楊酸比色法［10］測(cè)定。

1.4 土壤細(xì)菌16S rDNA文庫構(gòu)建

DGGE聚類分析篩選出典型樣品，其總DNA為模板采用細(xì)菌16S rDNA通用引物（63F/1492R）對(duì)土壤細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10×PCR Buffer 2μL、dNTP 1.6μL、27F 0.2μL、1492R 0.2μL、Taq酶0.1μL、土壤DNA稀釋50倍1μL、無菌水14.9μL；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性3 min、94℃變性30 s、62℃退火40 s、72℃延伸50 s、35次循環(huán)，72℃延伸5 min。

將擴(kuò)增片段與pEASY-T1載體（0.5μL載體，4.5μL DNA） 連接后轉(zhuǎn)入Ecoli.DH5a中，涂LBAmp（100μg/mL）平板上37℃培養(yǎng)16 h后，隨機(jī)挑取克隆子，通過菌落PCR檢測(cè)陽性克隆子，即應(yīng)用pEASY-T1載體通用引物M13（+）、M13（-）重新擴(kuò)增插入的片段，進(jìn)行克隆文庫的菌落PCR，菌落 PCR反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、M13+（20 μm）0.2μL、M13-（20μm）0.2μL、Easy Taq DNA聚合酶0.1μL、模版1μL、無菌水14.9μL；菌落PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性3 min、94℃變性45 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s、30次循環(huán)，72℃延伸5 min。

分別建立3個(gè)典型樣品細(xì)菌16S rDNA 3個(gè)克隆文庫。隨機(jī)挑取陽性克隆，陽性克隆子上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序后先將核酸序列中的載體序列進(jìn)行手動(dòng)刪除，在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中Blastn程序進(jìn)行相似性比對(duì)，確定最相似參比序列。將每個(gè)文庫已測(cè)的16S rDNA序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)的最相似參比序列，用ClustalX2軟件進(jìn)行多重比對(duì)比齊，截齊后的序列用MOTHUR軟件進(jìn)行分析，以cutoff=0.05為分界閾值劃分OTU。

運(yùn)用Quantity One軟件（Bio-rad，US）對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析。UPGMA（Unweighted pairgroup method using arithmetic averages）法進(jìn)行相似性聚類分析，同時(shí)輸出各條帶位置及光密度值。將各條帶光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算多樣性指數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003及DPS 7.05軟件顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤有機(jī)質(zhì)

從表1可知，隨著玉米生育期的推進(jìn)，0～20 cm土層，CK和SF-Ⅰ土壤有機(jī)質(zhì)含量呈先增加后下降趨勢(shì)，在大喇叭口期最高，成熟期最低。而SF-Ⅱ有機(jī)質(zhì)含量播種期最高，成熟期最低；同一生育期，土壤有機(jī)質(zhì)含量均高于CK，秸稈深翻還田能提高土壤有機(jī)質(zhì)；玉米生育期內(nèi)，2個(gè)秸稈還田處理有機(jī)質(zhì)含量存在差異；與CK相比，SF-Ⅰ提高土壤有機(jī)質(zhì)幅度在大喇叭口期（25.02%）最大；SF-Ⅱ提高土壤有機(jī)質(zhì)幅度在播種期（59.96%）最大；播種期和大喇叭口期SF-Ⅰ與SF-Ⅱ有機(jī)質(zhì)含量有極顯著差異，其他生育期無顯著差異。

從表1看出，隨著土層的下移土壤有機(jī)質(zhì)含量呈逐漸降低的趨勢(shì)；20～40 cm土層中，播種期秸稈深翻還田處理與CK土壤有機(jī)質(zhì)含量差異極顯著，其他生育期無顯著差異。

表1 玉米生育期內(nèi)0～40 cm 土層平均有機(jī)質(zhì)含量變化 （g/kg）

2.2 土壤纖維素酶活性分析

由表2可知，玉米生育期，0～20 cm土層纖維素酶活性表現(xiàn)為SF-Ⅱ＞SF-Ⅰ＞CK；播種期至大喇叭口期，SF-Ⅱ顯著提高土壤纖維素酶活性，SF-Ⅱ比CK分別高46.51%、39.66%、82.69%、37.50%。拔節(jié)期至大喇叭口期，SF-Ⅰ和SF-Ⅱ土壤纖維素酶活性差異極顯著，SF-Ⅱ土壤纖維素酶活性比SF-Ⅰ分別高出45.26%、14.29%；其余生育期無顯著差異。

表2 玉米生育期內(nèi)0～40 cm 土層纖維素酶活性變化 ［C6H6O6 mg/（g·72 h）］

從表2看出，隨著土層的下移土壤纖維素酶活性呈逐漸降低的趨勢(shì)；20～40 cm土層中，拔節(jié)期SF-Ⅱ與CK土壤纖維素酶活性差異極顯著，但SF-Ⅰ與CK間無顯著差異；其他生育期3個(gè)處理間無顯著差異。

2.3 土壤細(xì)菌群落16S rDNA-PCR-DGGE分析

由圖1、表3可知，36個(gè)樣品土壤細(xì)菌16S rDNA DGGE條帶數(shù)、條帶位置和粗度存在一定差異；玉米關(guān)鍵生育期0～20 cm土層條帶數(shù)均多于20～40 cm。播種期0～20 cm土層中3個(gè)處理共有條帶為1、2、3、6、15號(hào)，13號(hào)條帶為SF-Ⅰ和SF-Ⅱ共有，2、6、10號(hào)條帶在SF-Ⅱ中較粗，說明SF-Ⅱ優(yōu)勢(shì)菌屬為此3個(gè)條帶代表的菌屬；20～40 cm土層中SF-Ⅰ和SF-Ⅱ與CK相比，4、14號(hào)條帶變?nèi)?，甚至消失，但多?5號(hào)條帶，SF-Ⅱ中出現(xiàn)3、13號(hào)條帶，說明秸稈還田后微生物多樣性增加了。玉米關(guān)鍵生育期0～40 cm土層DGGE條帶數(shù)總體為 SF-Ⅱ＞SF-Ⅰ ＞CK。

圖1 玉米關(guān)鍵生育期土壤細(xì)菌16S rDNA DGGE圖譜

由圖2、表3可知，36個(gè)樣品可歸為三大類群，8～10號(hào)和19～25號(hào)共10個(gè)樣品聚為一大簇，相似性指數(shù)為54%，樣品均為表層（0～20 cm） 樣 品；18、28、30、32、33、35～ 37號(hào) 共8個(gè)樣品聚為一簇，相似性指數(shù)為52%，樣品均為深層（20～40 cm）氣溫較低時(shí)期的樣品；7、11、14、29和31共5個(gè)聚到一起，再與2～ 6、12、13、15～17、34等樣品共16個(gè)聚為另一大簇，相似性指數(shù)分別為58%、56%，樣品均為深層（20～40 cm）高溫時(shí)期的樣品；26和27號(hào)樣品不能與其余樣品聚到一起。從聚類分析可知，玉米秸稈深翻還田表層土（0～20 cm）與深層土（20～40 cm）樣品在聚類位置上產(chǎn)生較大的差異；在苗期和成熟期，同土層各處理樣品聚類位置相近，拔節(jié)期至灌漿期聚類位置相對(duì)較遠(yuǎn)；在播種期CK與SF-Ⅱ聚類位置遠(yuǎn)，分別在兩大類里；拔節(jié)期各處理表層土壤樣品（17、18、19）聚類位置遠(yuǎn)，分別在3個(gè)不同大類里；大喇叭口期各處理樣品（14、15、16）聚類位置也較遠(yuǎn)，分到3個(gè)小類里。表明秸稈還田后拔節(jié)期至灌漿期土壤細(xì)菌群落發(fā)生較大的變化；在拔節(jié)期變化最大。

表3 DGGE凝膠中土壤樣品編號(hào)

圖2 土壤細(xì)菌16S rDNA DGGE聚類圖

2.4 典型樣品細(xì)菌16S rDNA文庫構(gòu)建

以上分析可知，拔節(jié)期各處理表層土壤纖維素酶活性較高，樣品涵蓋的信息多，土壤可作為典型樣品。構(gòu)建典型樣品土壤細(xì)菌16S rDNA文庫。由表4可知，150條序列共劃分為59個(gè)OTU，CK樣品中所建立的文庫分布在20個(gè)OTU中；分別屬于變形菌門（Proteobacterium）的小梨形菌屬（Pirellula）、水單胞菌屬（Aquimonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、副球菌屬（Paracoccus），β-變形菌綱（Beta proteobacterium），放線菌門（Actinobacteria）的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。CK樣品中出現(xiàn)了有機(jī)物降解作用的節(jié)桿菌屬菌群，還出現(xiàn)了反硝化作用的副球菌屬，厭氧氨氧化作用的小梨形菌屬。SF-Ⅰ樣品中所建立文庫分布在25個(gè)OTU中；分別屬于a-變形菌綱（Alpha proteobacterium）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）的不可培養(yǎng)的微生物和地桿菌（Geobacter）、磁螺菌屬（Magnetospirillum）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、根瘤菌屬（Mesorhizobium）。SF-Ⅱ樣品中所建立的文庫分布在27個(gè)OTU中，分別屬于β-變形菌綱（Beta proteobacterium）、γ-變形菌綱（Gamma proteobacterium）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）的不可培養(yǎng)微生物和可培養(yǎng)的變形菌門的生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、根瘤菌屬（Sinorhizobium meliloti）、黃桿菌（Luteolibacter）、黃單胞菌屬（Xanthomonas-like）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）。SF-Ⅰ和SF-Ⅱ樣品OTU比對(duì)序列中出現(xiàn)了纖維素分解菌和有機(jī)污染物降解菌，有芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、浮霉?fàn)罹鷮伲≒lanctomyces）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、地桿菌（Geobacter）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）。

表4 典型土壤樣品細(xì)菌16S rDNA比對(duì)序列特征

2.5 土壤細(xì)菌16S r DNA多樣性指數(shù)

群落中生物種類增多代表了群落的復(fù)雜程度增高，即H*-Shannon-wiener指數(shù)值愈大，群落所含的信息量愈大。chaol指數(shù)是用來反映物種豐富度的指標(biāo)，表5可知，H*-Shannon-wiener指數(shù)和Chao1值均為 SF-Ⅱ＞SF-Ⅰ＞CK。

表5 土壤細(xì)菌16S rDNA基因多樣性指數(shù)

3 討論

秸稈還田后土壤肥力明顯提高［11］，這對(duì)高產(chǎn)和保持土壤供養(yǎng)分能力具有重要意義。本試驗(yàn)中秸稈深翻還田提高表層土壤有機(jī)質(zhì)，主要是由于秸稈施入土壤后，可以有效減少徑流，使得表層養(yǎng)分含量得以保留，有機(jī)質(zhì)含量也增加；而CK有機(jī)質(zhì)含量偏低是由于玉米收獲后未留下殘茬，返還到土壤中的有機(jī)物較少。連續(xù)兩年深翻秸稈還田纖維素酶活性最高峰值出現(xiàn)時(shí)期提前到拔節(jié)期；秸稈還田提高全生育期土壤纖維素酶活性；這與王靜等［12］、景音娟等［13］的研究結(jié)果相同。前人應(yīng)用DGGE檢測(cè)群落多樣性、豐度和均勻度，認(rèn)為指紋分析技術(shù)中DGGE最為敏感［14-19］。本研究通過16S rDNA文庫構(gòu)建可知，秸稈還田提高土壤中纖維素降解細(xì)菌數(shù)量及多樣性，玉米關(guān)鍵生育期連續(xù)兩年深翻秸稈還田多樣性指數(shù)最高，因?yàn)椴煌N植栽培方式對(duì)細(xì)菌物種優(yōu)勢(shì)度有影響［20-21］；土地利用類型的變化造成微生物群落結(jié)構(gòu)變化［22］；土壤有機(jī)質(zhì)是土壤微生物群落變化的重要因素［23］；影響細(xì)菌群落的主要環(huán)境因素是有機(jī)質(zhì)＞速效氮＞速效鉀＞速效磷［24］；土壤微生物與土壤理化性質(zhì)相關(guān)［25］；深翻秸稈還田顯著提高表層土壤有機(jī)質(zhì)含量，秸稈還田后秸稈釋放出氮素，氮添加有助于提高大多數(shù)功能群豐度［26］和增大土壤細(xì)菌群落多樣性［27］，從而增加了土壤纖維素降解菌豐度；土壤中氮源的多少和種類將影響到土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)［28］。秸稈還田循環(huán)利用顯著增加了土壤微生物數(shù)量和生物量［29］；糖類和聚合物類是區(qū)分土壤微生物群落功能多樣性的主要碳源類型［30］，可推測(cè)，秸稈還田后可能改變了土壤中糖類和聚合物類。

4 結(jié)論

秸稈深翻還田后土壤纖維素酶活性明顯增強(qiáng)，顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)含量；低溫時(shí)期和高溫時(shí)期土壤細(xì)菌群落差異顯著，秸稈深翻還田提高了土壤細(xì)菌多樣性。