郎晨曉，羅 欣，朱立賢，張一敏，韓廣星，董鵬程,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

雙組分調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system，TCS）是細(xì)菌感知外界環(huán)境信號(hào)，并將信號(hào)分子傳導(dǎo)至菌體內(nèi)部，從而激發(fā)相應(yīng)調(diào)控機(jī)制的重要途徑，對(duì)于細(xì)菌在壓力條件下的存活具有重要意義。在食品加工過(guò)程中，細(xì)菌經(jīng)常面臨多種亞致死的壓力環(huán)境，如高滲透壓、酸性、低水分活度等，TCS能夠幫助細(xì)菌感知環(huán)境變化并及時(shí)啟動(dòng)體內(nèi)應(yīng)對(duì)機(jī)制，最大程度地提高自身的存活能力，甚至產(chǎn)生高抗性菌株。這種“抗逆性”的提高有利于食源性致病菌克服食品加工過(guò)程中的柵欄因子，從而危害食品安全。

在食品工業(yè)中，酸作為保鮮劑、酸度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等已有近100 年的應(yīng)用歷史，有機(jī)酸作為一種廉價(jià)、低能耗、效能持久的消毒減菌劑，在宰后動(dòng)物的胴體表面應(yīng)用廣泛[1]。隨著有機(jī)酸在屠宰企業(yè)的大范圍應(yīng)用，越來(lái)越多的耐酸菌株開(kāi)始顯現(xiàn)，消毒減菌效果開(kāi)始衰退，有機(jī)酸長(zhǎng)期使用的安全性亟待評(píng)估。細(xì)菌耐酸性的變化涉及自身的本底耐酸能力、外界環(huán)境的感知、氨基酸代謝的調(diào)控、核酸修復(fù)功能的啟動(dòng)、質(zhì)子泵外排、細(xì)胞膜脂肪酸組成的變更等多種生理生化反應(yīng)的協(xié)同運(yùn)作[2]。其中，以雙組分調(diào)控為基礎(chǔ)的對(duì)酸性環(huán)境的感知和信號(hào)的傳遞是食品中致病微生物耐酸性動(dòng)員的第一步[3]。本文以細(xì)菌耐酸性為主，綜述了TCS的結(jié)構(gòu)作用、信號(hào)識(shí)別及其在酸性壓力下提升細(xì)菌耐受能力的調(diào)控過(guò)程。

1 TCS的結(jié)構(gòu)組成與調(diào)控機(jī)制

TCS由1 個(gè)組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HK）和1 個(gè)反應(yīng)調(diào)控（response regulator，RR）蛋白組成。HK通常是一個(gè)跨膜感應(yīng)蛋白，結(jié)構(gòu)分為3 部分，有感知外界信號(hào)分子作用的感應(yīng)功能區(qū)、自身磷酸化的位點(diǎn)區(qū)（又稱二聚體功能區(qū)）以及ATP結(jié)合部位。而RR蛋白位于胞質(zhì)內(nèi)，結(jié)構(gòu)可分為相對(duì)保守的能結(jié)合磷酸基團(tuán)的N端、高度可變并能特異性結(jié)合DNA序列的C端[4]。

TCS的作用機(jī)制如下：HK中感應(yīng)功能區(qū)的膜外配體識(shí)別到外界信號(hào)后，激活自身與ATP結(jié)合部位，并將ATP水解為ADP，而后ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到二聚體功能區(qū)，與組氨酸位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)生自我磷酸化；隨后，磷酸化的HK與RR蛋白的N端作用，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到N端的天冬氨酸殘基位點(diǎn)，并激活C端的效應(yīng)區(qū)，從而改變其構(gòu)象，暴露出DNA結(jié)合位點(diǎn)，再與靶細(xì)胞基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的轉(zhuǎn)錄與合成[4-5]。

研究表明，微生物對(duì)壓力環(huán)境的耐受能力與多種TCS有關(guān)，以沙門(mén)氏菌（Salmonella）為例，利于自身適應(yīng)酸脅迫的PhoP/PhoQ、利于抵抗宿主抗菌肽的PmrA/PmrB和能提升高鹽耐受能力的OmpR/EnvZ等系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜環(huán)境下菌株的生存均有重要意義[6-8]。

2 TCS的識(shí)別信號(hào)

2.1 酸性環(huán)境信號(hào)

酸性環(huán)境可以激發(fā)微生物的PmrA/PmrB、PhoP/PhoQ和EvgS/EvgA等TCS產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)[9-10]。研究表明，在pH值為3.1的條件下，大腸桿菌（Escherichia coli）中PhoP/PhoQ的缺失會(huì)導(dǎo)致由其調(diào)控的多種酸激蛋白的合成受阻，且PhoP/PhoQ缺陷菌株的耐酸能力低于正常菌株，說(shuō)明PhoP/PhoQ系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的酸耐受能力有利[11]。此外，Soncini等[12]以沙門(mén)氏菌正常菌株與pmrA突變菌株為研究對(duì)象，以受PmrA/PmrB調(diào)控的下游基因pbgP的表達(dá)量為測(cè)量指標(biāo)，觀察到pH值由7.7降至5.8時(shí)，正常菌株的pbgP基因表達(dá)顯著上調(diào)，而pmrA突變菌株變化不明顯，這表明細(xì)菌中的PmrA/PmrB系統(tǒng)可以響應(yīng)酸信號(hào)。EvgS/EvgA系統(tǒng)是一種可提高大腸桿菌細(xì)胞耐酸性的雙組分系統(tǒng)，Sen等[10]在研究EvgS/EvgA對(duì)于酸性環(huán)境（pH值為5.5～5.7）的感應(yīng)模型時(shí)，提出pH值應(yīng)答由跨膜蛋白EvgS二聚化的強(qiáng)度所調(diào)控。

H+既可以作為某一雙組分系統(tǒng)的直接信號(hào)，又可以通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活更多雙組分系統(tǒng)，例如H+是PmrA/PmrB的直接識(shí)別信號(hào)[13]，又可以通過(guò)對(duì)PhoP/PhoQ的激活而間接活化PmrA/PmrB系統(tǒng)[9]。

H+與金屬離子可以聯(lián)合誘導(dǎo)TCS產(chǎn)生應(yīng)答。例如在H+存在的情況下，高濃度的Mg2+不能抑制PhoP/PhoQ的調(diào)控效應(yīng)[12]，但具體機(jī)制仍不明確。此外，在H+與金屬離子（如Mg2+信號(hào)）存在時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生耐酸響應(yīng)，其機(jī)理是H+與PhoQ結(jié)合后通過(guò)PhoP調(diào)控下游基因，亦或是誘導(dǎo)其他系統(tǒng)產(chǎn)生協(xié)同作用仍待研究。

2.2 金屬離子信號(hào)

TCS的跨膜蛋白感應(yīng)到外界金屬離子信號(hào)后與之結(jié)合，將磷酸基團(tuán)傳遞至胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，進(jìn)而引起其構(gòu)象變化，產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)。以PhoP/PhoQ為例，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腗g2+（μmol級(jí)別）與PhoQ的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，會(huì)通過(guò)自身磷酸化激活PhoP蛋白，形成PhoP-P，從而調(diào)控耐酸因子、毒力因子等的表達(dá)。相反，濃度較高（mmol級(jí)別）的Mg2+會(huì)引起PhoP-P去磷酸化，抑制由PhoP/PhoQ激活的下游基因表達(dá)，例如減弱野生型沙門(mén)氏菌的毒力[14]。Véscovi等[6]用Ca2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+等代替Mg2+測(cè)定PhoP/PhoQ激活基因psiD的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+同Mg2+對(duì)PhoP/PhoQ的激活作用類(lèi)似，而其他離子不能被識(shí)別。對(duì)于PmrA/PmrB系統(tǒng)，W?sten等[7]提出Fe3+和Al3+都是沙門(mén)氏菌PmrA/PmrB系統(tǒng)的環(huán)境信號(hào)。而Zn2+對(duì)大腸桿菌PmrA調(diào)控的基因表達(dá)有誘導(dǎo)作用，但對(duì)沙門(mén)氏菌沒(méi)有影響[15]。

除上述金屬離子信號(hào)外，還有能被金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ArlR/ArlS識(shí)別的Zn2+和Mn2+[16]，能激發(fā)大腸桿菌HydH/HdyG作用的Pb2+[17]，能被志賀菌（Shigella）KdpD/KdpE系統(tǒng)響應(yīng)的K+[5]，能夠誘導(dǎo)大腸桿菌CusS/CusR系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答的Ag+和Cu2+[18]信號(hào)等。

2.3 滲透壓信號(hào)

TCS感應(yīng)到外界環(huán)境的滲透壓脅迫后，跨膜蛋白激酶發(fā)生磷酸化，并將磷酸基團(tuán)傳至胞內(nèi)效應(yīng)蛋白，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控孔道蛋白的組成比例等途徑對(duì)滲透脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。OmpR/EnvZ、ColR/ColS、MtrB/MtrA等系統(tǒng)均能響應(yīng)滲透壓信號(hào)[8,19-20]，其中有關(guān)OmpR/EnvZ的研究最多，ompR基因缺失會(huì)引起細(xì)菌膜孔道蛋白OmpC、OmpF的表達(dá)出現(xiàn)差異，這兩種蛋白的作用是控制小分子親水物質(zhì)通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞[8]。在響應(yīng)滲透壓信號(hào)的過(guò)程中，HKEnvZ具有雙向功能，其感應(yīng)到高滲脅迫后發(fā)生自我磷酸化，磷酸基團(tuán)傳至調(diào)控蛋白OmpR形成OmpR-P，激活OmpC的生成，并抑制OmpF表達(dá)；一旦滲透脅迫消失，EnvZ又能作為去磷酸酶使OmpR-P變?yōu)镺mpR，低滲透壓環(huán)境導(dǎo)致OmpR磷酸化水平降低，利于OmpF的表達(dá)[21-22]。細(xì)菌通過(guò)此過(guò)程影響外膜上OmpC和OmpF兩種蛋白的組成比例，幫助細(xì)菌適應(yīng)脅迫環(huán)境。此外，Huang Xinxiang等[23]發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌在高滲（NaCl濃度為300 mmol/L）應(yīng)激初期，TCS中的OmpR和PhoP表達(dá)同步上調(diào)，說(shuō)明細(xì)菌面對(duì)外界高滲壓力時(shí)，可能存在OmpR/EnvZ與PhoP/PhoQ多個(gè)系統(tǒng)協(xié)同作用的現(xiàn)象。

2.4 群體密度信號(hào)

除上述信號(hào)分子外，群體密度信號(hào)也能被TCS識(shí)別，如金黃色葡萄球菌中的AgrC/AgrA系統(tǒng)屬于群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）調(diào)控系統(tǒng)，系統(tǒng)中的HK AgrC可以感應(yīng)到細(xì)菌密度信號(hào)是否達(dá)到閾值，并能通過(guò)RR蛋白AgrA調(diào)控細(xì)菌的毒力、耐藥性等，利于細(xì)菌在脅迫環(huán)境下的存活[24]。QS調(diào)控系統(tǒng)還與細(xì)菌的生物膜形成有關(guān)，例如金黃色葡萄球菌中，有LuxS蛋白酶催化合成的用于種間交流的自誘導(dǎo)物質(zhì)（autoinducer-2，AI-2），LuxS/AI-2系統(tǒng)通過(guò)TCS的KdpD/KdpE調(diào)節(jié)胞外多糖莢膜的產(chǎn)生，影響生物膜的形成[25]。此外，沙門(mén)氏菌中的QseB/QseC雙組分系統(tǒng)等也能夠調(diào)控QS，且可以進(jìn)一步與菌株的動(dòng)力、侵襲力及耐藥性等生理特性聯(lián)系[4]。

2.5 其他識(shí)別信號(hào)

細(xì)菌復(fù)雜的生存環(huán)境中還存在多種信號(hào)分子，并涉及多種TCS，如可以由折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)及鹽離子濃度的改變激活的CpxR/CpxA系統(tǒng)[9]，可以感受氧濃度變化從而產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)的FixL/FixJ系統(tǒng)[4]，與氮吸收相關(guān)的NreB/NreC系統(tǒng)等[26]。

3 TCS的調(diào)控作用

3.1 雙組分系統(tǒng)對(duì)耐酸性的調(diào)控

面對(duì)食品加工過(guò)程造成的酸性環(huán)境，TCS可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)下游的耐酸基因來(lái)增強(qiáng)細(xì)菌在酸中的存活能力，也可以動(dòng)態(tài)調(diào)控細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、氨基酸代謝、質(zhì)子泵外排和啟動(dòng)核酸修復(fù)機(jī)制等，令細(xì)菌獲得額外的耐酸能力，并使細(xì)菌產(chǎn)生誘導(dǎo)耐酸響應(yīng)（acid tolerance response，ATR）。ATR是指微生物在微酸條件下生存一段時(shí)間后所表現(xiàn)出來(lái)的對(duì)于致死量強(qiáng)酸攻擊的一種適應(yīng)性反應(yīng)，又稱作酸耐受應(yīng)答反應(yīng)[27]。細(xì)菌ATR的產(chǎn)生可以提高細(xì)菌對(duì)酸性消毒劑的抵抗能力，同時(shí)產(chǎn)生交叉保護(hù)，增強(qiáng)細(xì)菌耐熱、耐氧化等能力，使細(xì)菌不易被殺死，還可能提高菌株毒性，影響食品安全[9,27]。研究證明PhoP/PhoQ、OmpR/EnvZ、PmrA/PmrB、EvgS/EvgA等雙組分系統(tǒng)均與菌株誘導(dǎo)耐酸能力有關(guān)[10-12,28]。本文第4部分將著重介紹沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等食品加工過(guò)程中常見(jiàn)微生物的雙組分系統(tǒng)對(duì)酸的響應(yīng)機(jī)制。

3.2 雙組分系統(tǒng)對(duì)毒力因子的調(diào)控

致病菌對(duì)宿主的致病性與其抵抗宿主抗菌肽的侵襲、在巨噬細(xì)胞中存活、自身毒素釋放等過(guò)程有關(guān)，且細(xì)菌毒力受自身的黏附力、侵襲力、毒素種類(lèi)等影響，TCS作為調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)細(xì)菌的致病過(guò)程及毒力均有調(diào)控作用[15,29]。Rodrigues等[30]用PhoP/PhoQ缺陷型沙門(mén)氏菌接種蛋雞，發(fā)現(xiàn)其肝臟和脾中細(xì)菌數(shù)量較正常菌株顯著降低，且未見(jiàn)感染癥狀，證實(shí)PhoP/PhoQ對(duì)菌株毒力有維持作用；還有研究表明，該TCS突變的鼠傷寒沙門(mén)氏菌在小鼠巨噬細(xì)胞中的存活能力低于正常菌株，且毒力作用降低1 000多倍[31]。另外，Pukklay等[32]發(fā)現(xiàn)注射同樣劑量細(xì)菌的情況下，與正常大腸桿菌相比，OmpR/EnvZ缺陷菌株對(duì)果蠅的致死率降低30%，即OmpR/EnvZ對(duì)細(xì)菌毒力也有維持作用。Qing Xiaoyu等[33]針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌中PhoP/PhoQ的RR蛋白PhoP進(jìn)行研究，將該蛋白結(jié)合磷酸基團(tuán)的天冬氨酸位點(diǎn)作為藥物作用的目標(biāo)，驗(yàn)證了藥物控制細(xì)菌毒力的可行性，這為降低食品微生物污染對(duì)消費(fèi)者的危害提供了理論參考。

還有許多研究對(duì)比了多種細(xì)菌的正常與TCS缺陷菌株毒力基因的表達(dá)及毒素的產(chǎn)生，證實(shí)了金黃色葡萄球菌的AgrC/AgrA[24]和SaeS/SaeR[34]、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的RevS/RevR[35]、豬鏈球菌（Streptococcus suis）的NisK/NisR[36]等系統(tǒng)也與菌株毒性有關(guān)。

而游歷晉地的著名學(xué)者亦不乏其人，如唐代詩(shī)人李白、杜牧等人，宋代詩(shī)人梅堯臣等人，明代詩(shī)人謝榛等人，清初學(xué)者顧炎武、朱彝尊等人。 他們?cè)谟螘x過(guò)程中，皆形成了一定的學(xué)術(shù)團(tuán)體，在與晉地學(xué)人的交流中，促進(jìn)了晉地學(xué)術(shù)的發(fā)展，也對(duì)提升山西學(xué)子水平起到了重要作用。

3.3 雙組分系統(tǒng)對(duì)耐藥性的調(diào)控

PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB、CpxA/CpxR及BaeS/BaeR等系統(tǒng)均與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)，且某些TCS可以協(xié)同激活生物膜成膜基因的表達(dá)，通過(guò)生物膜體系如QS、胞外分泌物的產(chǎn)生等進(jìn)一步增強(qiáng)自身的耐藥性[37-38]。Huang Hui等[39]發(fā)現(xiàn)CpxA/CpxR突變菌的阿米卡星、慶大霉素等的最小抑菌濃度比正常菌株降低2～4 倍，說(shuō)明CpxA/CpxR的存在可提升菌株的耐藥性。另外，有學(xué)者證實(shí)了CpxA/CpxR能夠參與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中外排泵MexAB-OprM的激活，且細(xì)菌能通過(guò)外排泵基因表達(dá)和脂多糖修飾的共同作用提高細(xì)胞的代謝活性，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)黏菌素的抵抗能力[38]。此外，雙組分系統(tǒng)在調(diào)控外排泵系統(tǒng)時(shí)，還可以同時(shí)控制沙門(mén)氏菌等的卷曲菌毛基因表達(dá)，細(xì)菌菌毛數(shù)量的增加有利于自身與相鄰細(xì)菌的互相黏附，進(jìn)而形成穩(wěn)定的三維立體膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)藥物的耐受能力[40]。因此，可以進(jìn)一步從破壞雙組分系統(tǒng)或消除卷曲菌毛的角度，尋求降低細(xì)菌耐藥性和防止其在食品加工器具上形成生物膜的措施，例如可以用銀杏提取物等消除卷曲菌毛，降低食品的細(xì)菌污染[41]。

除上述調(diào)控作用外，TCS對(duì)細(xì)菌的調(diào)控作用還有很多，如ArcB/ArcA對(duì)細(xì)菌無(wú)氧呼吸的調(diào)節(jié)[42]；ActS/ActR能夠影響根瘤菌的固氮作用[43]；YpdA/YpdB和BtsS/BtsR與丙酮酸鹽感應(yīng)有關(guān)[44]等。

4 TCS對(duì)ATR的影響機(jī)制

細(xì)菌的ATR內(nèi)在機(jī)制主要包括以下3 個(gè)方面：酸休克蛋白或調(diào)節(jié)、保護(hù)蛋白對(duì)細(xì)胞的保護(hù)及生化過(guò)程的調(diào)節(jié)；細(xì)胞膜系統(tǒng)對(duì)質(zhì)子的阻擋及質(zhì)子外排；基于氨基酸代謝的細(xì)胞內(nèi)pH值平衡的維持。

4.1 TCS與酸休克蛋白

酸性環(huán)境可以激活細(xì)菌的TCS，進(jìn)而產(chǎn)生一系列利于自身活性并參與細(xì)胞調(diào)控的酸休克蛋白，來(lái)保護(hù)菌體并修復(fù)其損傷的高分子，維持細(xì)菌在脅迫條件下的存活。細(xì)菌中的RpoS蛋白、OmpR調(diào)控子、PhoP/PhoQ系統(tǒng)和金屬調(diào)節(jié)子Fur等位于上游的調(diào)控蛋白均可影響酸休克蛋白的產(chǎn)生[45]，Lund等認(rèn)為前兩者作用于ATR菌株的穩(wěn)定期，而PhoP/PhoQ和Fur則是在ATR對(duì)數(shù)期對(duì)酸休克蛋白的誘導(dǎo)起作用[46]。

PhoP/PhoQ不僅能夠調(diào)節(jié)下游酸休克蛋白的產(chǎn)生，其自身表達(dá)量在酸脅迫環(huán)境下也會(huì)增加，酸誘導(dǎo)菌株與未誘導(dǎo)組相比，細(xì)菌的PhoP/PhoQ等雙組分系統(tǒng)蛋白表達(dá)量上調(diào)，因此不少文獻(xiàn)也將雙組分系統(tǒng)稱為酸休克蛋白[9,11]。對(duì)于酸性環(huán)境中酸休克蛋白的產(chǎn)生途徑，多數(shù)研究認(rèn)為酸信號(hào)是通過(guò)引起跨膜感應(yīng)蛋白質(zhì)域的構(gòu)象變化而產(chǎn)生酸休克蛋白[47]，但近來(lái)Choi等[48]發(fā)現(xiàn)當(dāng)沙門(mén)氏菌胞外環(huán)境保持中性時(shí)，胞內(nèi)pH值下降也能誘導(dǎo)PhoP/PhoQ中PhoP激活下游耐酸響應(yīng)，產(chǎn)生酸休克蛋白；并且，當(dāng)跨膜蛋白PhoQ胞內(nèi)域的氨基酸序列改變時(shí)能夠阻礙PhoP/PhoQ的pH值激活效應(yīng)，這說(shuō)明，雙組分系統(tǒng)的感應(yīng)蛋白既能感知胞外的H+信號(hào)，又能利用自身的胞內(nèi)區(qū)域感知細(xì)胞內(nèi)部pH值的變化，進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳給RR蛋白，利于酸休克蛋白等的表達(dá)。

4.2 TCS與細(xì)胞膜的流動(dòng)性

細(xì)菌細(xì)胞膜的脂肪酸含量和構(gòu)成發(fā)生改變時(shí)會(huì)影響其流動(dòng)及通透性，較低的流動(dòng)性和通透性可以抑制有毒有害物質(zhì)等進(jìn)入菌體損傷細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)菌的存活能力[2]。能夠被PhoP/PhoQ系統(tǒng)激活的RpoS蛋白屬于一種RNA聚合酶σ因子，在持續(xù)性的耐酸調(diào)節(jié)機(jī)制上已得到廣泛證實(shí)[9,49]；在誘導(dǎo)耐酸過(guò)程中，RpoS蛋白可促進(jìn)沙門(mén)氏菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)丙烷脂肪酸，降低膜的流動(dòng)性，抑制食品加工中的酸性殘留物進(jìn)入細(xì)胞，提高細(xì)菌的生存能力[9]。而對(duì)于單增李斯特菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，面對(duì)酸性壓力，菌株除了降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率外，還能通過(guò)降低支鏈脂肪酸的數(shù)量調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性，保證其生物活性，提升菌株的酸抵抗能力[50]。RpoS蛋白也可以調(diào)控酸休克蛋白的表達(dá)，說(shuō)明RpoS蛋白作為多種耐酸路徑的核心蛋白，可將多個(gè)ATR的內(nèi)在機(jī)制相互交叉，使TCS通過(guò)調(diào)控RpoS蛋白進(jìn)而控制多種耐酸機(jī)制的聯(lián)合作用。除脂肪酸外，孔道蛋白也是細(xì)菌細(xì)胞膜的重要組成結(jié)構(gòu)，OmpR/EnvZ系統(tǒng)的RR蛋白OmpR能夠直接作用于細(xì)菌的膜孔道蛋白OmpC和OmpF的編碼基因，從而控制對(duì)某些離子及小分子親水性物質(zhì)的過(guò)濾作用，進(jìn)而對(duì)外界酸及藥物等作出響應(yīng)[8]。

4.3 TCS與氨基酸代謝

雙組分系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控細(xì)菌氨基酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響酸性環(huán)境中的氨基酸代謝路徑，調(diào)控胞內(nèi)質(zhì)子的消耗及排出，進(jìn)而對(duì)菌株細(xì)胞內(nèi)的pH值起穩(wěn)定作用，減少?gòu)?qiáng)酸對(duì)細(xì)胞的損傷。其中涉及的代謝相關(guān)的酶系統(tǒng)主要有精氨酸脫羧酶系統(tǒng)、賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)、谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)等。

Brenneman等[54]發(fā)現(xiàn)在含精氨酸的培養(yǎng)基中，正常沙門(mén)氏菌可以在pH值為2.5的環(huán)境中生存，并且當(dāng)精氨酸代謝相關(guān)基因adiA（編碼精氨酸脫羧酶）和adiC（編碼精氨酸-胍基丁胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)子）同時(shí)被誘導(dǎo)時(shí)，phoPQ突變細(xì)菌通過(guò)完整的精氨酸代謝通路，能顯著增強(qiáng)自身在pH 3.0時(shí)的存活能力，驗(yàn)證了精氨酸代謝系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的耐酸能力有提升作用，且該作用可能與PhoP/PhoQ系統(tǒng)有關(guān)。也有學(xué)者從蛋白質(zhì)角度進(jìn)行研究，Tran等[3]通過(guò)定量蛋白質(zhì)組對(duì)phoPQ正常的沙門(mén)氏菌及變異菌株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)變異組中精氨酸代謝相關(guān)的約10 種蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，說(shuō)明細(xì)菌的精氨酸代謝與PhoP/PhoQ調(diào)控有關(guān)，而精氨酸代謝途徑又是細(xì)菌誘導(dǎo)耐酸作用的重要機(jī)制，由此可將PhoP/PhoQ與耐酸應(yīng)答聯(lián)系。

在細(xì)菌的賴氨酸代謝途徑中，Lee等[55]最先指出CadC作為OmpR/EnvZ的調(diào)節(jié)因子可控制沙門(mén)氏菌中至少36 種蛋白的表達(dá)，cadC不僅可以激活cadBA操縱子轉(zhuǎn)錄，同時(shí)還能激活OmpR/EnvZ并激發(fā)多種酸休克蛋白效應(yīng)，說(shuō)明氨基酸代謝能反向作用于TCS進(jìn)而調(diào)節(jié)下游耐酸效應(yīng)。之前有學(xué)者指出，與沙門(mén)氏菌正常菌株相比，ompR突變株穩(wěn)定期的誘導(dǎo)耐酸能力顯著降低，而對(duì)數(shù)期的耐酸響應(yīng)則無(wú)影響[56-57]。但近期Lee等[28]對(duì)早期對(duì)數(shù)期的沙門(mén)氏菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明OmpR/EnvZ中的OmpR和氨基酸代謝中的CadC兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平之間存在負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明OmpR/EnvZ對(duì)沙門(mén)氏菌對(duì)數(shù)期的耐酸能力也有調(diào)控作用，且該結(jié)果再次證明雙組分系統(tǒng)與氨基酸代謝之間存在復(fù)雜的雙向調(diào)控，但其具體作用時(shí)間及調(diào)控耐酸響應(yīng)的機(jī)制仍待研究。

Ma Zhuo等[58]發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%葡萄糖、pH 5.5的酸化條件下，大腸桿菌中EvgS/EvgA系統(tǒng)可通過(guò)調(diào)控gadE基因間接控制谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)中g(shù)adA和gadBC的表達(dá)，且與正常大腸桿菌相比，evgAS突變菌株gadA和gadBC的表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明EvgS/EvgA系統(tǒng)可以通過(guò)谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)間接影響谷氨酸依賴性耐酸。與PhoP/PhoQ類(lèi)似，EvgS/EvgA也能對(duì)金屬離子（如Na+、K+）產(chǎn)生響應(yīng)[59]，但這些離子信號(hào)的存在是否能影響細(xì)菌雙組分系統(tǒng)對(duì)氨基酸代謝的調(diào)控仍不明確。

5 多個(gè)TCS之間的協(xié)同作用

一個(gè)TCS感知到應(yīng)激信號(hào)后，可以通過(guò)自身RR蛋白獨(dú)立作出應(yīng)答，也可以將信號(hào)通過(guò)立體的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行放大，通過(guò)再激活其他雙組分系統(tǒng)和/或σ因子等體系間接達(dá)到調(diào)控效果。

H+信號(hào)或低Mg2+信號(hào)（μmol級(jí)別）激活PhoP/PhoQ后，反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP發(fā)生磷酸化，促進(jìn)pmrD基因的表達(dá)，PmrD再以一種未知的方式聯(lián)系到PmrA/PmrB系統(tǒng)，兩種雙組分系統(tǒng)能協(xié)同調(diào)控下游基因編碼的蛋白質(zhì)，可對(duì)脂多糖上脂質(zhì)A進(jìn)行修飾[9,12]（圖1），在兩者共同調(diào)控的下游響應(yīng)中，酸激蛋白和氨基酸代謝基因可能是其調(diào)控目標(biāo)，但這方面的研究仍不多見(jiàn)。

圖1 PhoP/PhoQTCS調(diào)控基因示意圖[60]Fig. 1 Schematic diagram of the regulatory genes of PhoP/PhoQ two-component regulatory system[60]

大腸桿菌中EvgS/EvgA與PhoP/PhoQ可以協(xié)同應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境，有學(xué)者提出大腸桿菌中的EvgS/EvgA系統(tǒng)既可以通過(guò)激活下游的ydeO基因，使細(xì)菌從谷氨酸代謝角度獲得耐酸能力，又可以通過(guò)激活PhoP/PhoQ系統(tǒng)的HK PhoQ，進(jìn)而由RR蛋白PhoP對(duì)H+作出調(diào)控[61]；還有學(xué)者提出EvgS/EvgA到PhoP/PhoQ到下游調(diào)控蛋白R(shí)ssB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)模型，通過(guò)RssB防止PhoP/PhoQ響應(yīng)H+產(chǎn)生的RpoS蛋白發(fā)生降解，利于細(xì)菌在酸中存活[62]。

對(duì)于酸性環(huán)境下的金屬離子脅迫，細(xì)菌中也存在多種TCS協(xié)同作用的現(xiàn)象。例如關(guān)于沙門(mén)氏菌對(duì)酸性環(huán)境下高濃度Fe2+的吸收方式，有研究指出，細(xì)菌通過(guò)PhoP/PhoQ系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境中的H+信號(hào)后，能夠激活RstA/RstB系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生成和細(xì)胞對(duì)Fe2+的攝取，可見(jiàn)RstA/RstB和PhoP/PhoQ在幫助細(xì)菌應(yīng)對(duì)酸性環(huán)境下Fe2+脅迫時(shí)也存在協(xié)同作用[63]。

除酸性環(huán)境外，細(xì)菌在其他調(diào)控方面也存在多種TCS的協(xié)同作用。以O(shè)mpR/EnvZ為例，該TCS與PhoP/PhoQ在沙門(mén)氏菌高滲應(yīng)激方面[64]、AcrB/AcrA在大腸桿菌的外膜孔蛋白表達(dá)方面[65]以及SsrB/SsrA在沙門(mén)氏菌毒力島2基因表達(dá)方面[66]也存在交叉調(diào)節(jié)機(jī)制，即一個(gè)TCS的作用眾多，且同類(lèi)基因可由多個(gè)TCS協(xié)同調(diào)控。

此外，TCS交叉調(diào)節(jié)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還體現(xiàn)在很多方面，如大部分存在于革蘭氏陰性菌中的cross-talk現(xiàn)象，即磷酸基團(tuán)在HK和另一雙組分系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白間可逆?zhèn)鬟f的現(xiàn)象，比如HK EnvZ與非同源的CpxRRR蛋白（細(xì)胞膜張力），HKPhoR與非同源的調(diào)控蛋白NtrC（氮的同化作用），以及與金屬離子和能量代謝相關(guān)的CusS/CusR和CreC/CreB系統(tǒng)，協(xié)同控制鞭毛合成的QseB/QseC和RssA/RssB系統(tǒng)等[5,67]。

6 結(jié) 語(yǔ)

在食品加工過(guò)程中廣泛應(yīng)用的酸會(huì)引起細(xì)菌產(chǎn)生ATR，導(dǎo)致其不易被消毒劑致死，影響食品安全，而PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB等常見(jiàn)的TCS在細(xì)菌應(yīng)對(duì)壓力環(huán)境時(shí)發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，學(xué)者們比較正常細(xì)菌與TCS突變菌的下游基因或蛋白的表達(dá)水平，逐步探索TCS的信號(hào)識(shí)別及調(diào)控作用，但同時(shí)，TCS對(duì)強(qiáng)酸下細(xì)菌存活的具體調(diào)控機(jī)制、不同TCS間的協(xié)同作用仍沒(méi)有系統(tǒng)理論，正逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。此外，不同信號(hào)對(duì)TCS的聯(lián)合激活機(jī)理仍不明確，例如動(dòng)物源性食品的加工中，基于肉牛宰后肌細(xì)胞鈣泵失效導(dǎo)致的終池中大量Ca2+的游離，以及使用乳酸抑菌及死后糖酵解導(dǎo)致的H+濃度的上升，肉中豐富的Ca2+和H+信號(hào)是否存在著與Mg2+和H+類(lèi)似的聯(lián)合激活作用目前尚無(wú)定論；H+是直接激活某一TCS，還是級(jí)聯(lián)其他TCS，然后間接激活耐酸效應(yīng)仍需探索。在未來(lái)的研究中，通過(guò)人為改變TCS作用過(guò)程中的“靶點(diǎn)”（如外界酸信號(hào)的感受位點(diǎn)、跨膜蛋白的磷酸化位點(diǎn)、磷酸基團(tuán)到RR蛋白的轉(zhuǎn)移途徑等）來(lái)抑制細(xì)菌的耐酸能力和致病菌的毒力，增強(qiáng)食品生產(chǎn)中酸性抑菌措施的效果，也會(huì)成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。