黎曉茜，龍友華,2,*，尹顯慧,2，吳小毛,2，趙志博，樊 榮，莫飛旭，蔣艷玲，黃亞欣，唐靖文

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.修文縣獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，貴州 貴陽(yáng) 550200）

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）植物的漿果果實(shí)，富含VC、多種礦物、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是三大新興水果之一[1-3]。近年來(lái)，獼猴桃軟腐病發(fā)生較為嚴(yán)重，造成采前落果、貯藏期果實(shí)腐爛率升高，嚴(yán)重影響獼猴桃果實(shí)品質(zhì)及市場(chǎng)銷售[4]。獼猴桃軟腐病主要由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.）等真菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起[4-6]；周游[7]研究發(fā)現(xiàn)B. dothidea、可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobroma）和小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）可引起獼猴桃軟腐；Lee[8]、Thomidis[9]等研究表明間座殼屬（Diaporthe sp.）真菌亦能引起獼猴桃軟腐病。目前獼猴桃軟腐病的防治研究以化學(xué)防治和生防菌株篩選為主[10-12]，長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥容易使真菌產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)環(huán)境安全及影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全；生防菌株對(duì)貯藏期果實(shí)防治效果較好，但田間施用限制因素較多，防控效果往往不穩(wěn)定；因此，迫切需要開(kāi)發(fā)利用綠色、安全、高效的植物源藥劑防控獼猴桃軟腐病[13]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）作為植物體內(nèi)的一種天然化學(xué)物質(zhì)，可調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)植物防御性基因表達(dá)[14-16]。目前MeJA已廣泛應(yīng)用于蘋果[17]、梨[18]、桃[19]、芒果[20]、辣椒[21]、番茄[22]、小麥[23]等農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物的病害防控，也能有效地控制一些果蔬的釆后真菌性病害[24-25]，改善果實(shí)品質(zhì)[26]。MeJA可誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，例如誘導(dǎo)病害防御基因的表達(dá)，誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等植物防御酶活力的提高，以及植保素的合成等[27-32]。還有研究表明，MeJA可以提高果實(shí)中的蛋白質(zhì)和糖含量[33-34]。但目前尚不清楚MeJA能否有效防控獼猴桃軟腐病、是否影響獼猴桃果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。

本研究利用不同濃度的MeJA處理獼猴桃軟腐病致病菌葡萄座腔菌，通過(guò)檢測(cè)菌絲的電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)和核酸外滲、細(xì)胞壁主要酶活力以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化等方面，探究MeJA對(duì)獼猴桃軟腐病菌的抑制活性及相關(guān)機(jī)制；使用0.50 mmol/L MeJA處理不同生長(zhǎng)期的獼猴桃果實(shí)，探究MeJA對(duì)獼猴桃軟腐病防控效果及其對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響，以期為葡萄座腔菌引起的獼猴桃軟腐病的綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B. dothidea菌種由貴州大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室提供。

以選取種植于貴州省修文縣久長(zhǎng)鎮(zhèn)和小菁鄉(xiāng)實(shí)驗(yàn)基地的‘貴長(zhǎng)’獼猴桃為供試品種，樹(shù)齡4 年，‘T’型架栽培，樹(shù)勢(shì)整齊一致，除實(shí)驗(yàn)處理的差異外，其他農(nóng)事操作、管理水平均一致，在果實(shí)采收期，選擇晴朗天氣時(shí)集中采收。

MeJA（純度≥95%）、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）、醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）、昆布多糖 北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%四霉素水劑 遼寧微科生物有限公司；幾丁質(zhì)粉上海生工生物工程有限公司；二甲胺基甲硼烷（dimethylaminoborane，DMAB） 上海百舜生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1BU型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；DDSJ-319L型電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；GY-4數(shù)顯式果實(shí)硬度計(jì) 樂(lè)清市艾德堡儀器有限公司；PAL-1型折光儀 北京陽(yáng)光億事達(dá)貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MeJA處理對(duì)獼猴桃軟腐病葡萄座腔菌的作用機(jī)制

1.3.1.1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[35]，先將MeJA配制成濃度為0（對(duì)照）、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mmol/L的母液，再以母液、培養(yǎng)基體積比1∶9制成含0（對(duì)照）、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L MeJA的PDA平板。利用打孔器打取直徑5 mm、培養(yǎng)4 d后的新鮮菌餅，置于含不同濃度MeJA的PDA平板中央，每培養(yǎng)皿接1 個(gè)菌餅，每個(gè)處理組4 次重復(fù)。接菌后將PDA平板置入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待對(duì)照平板菌落直徑長(zhǎng)至5～6 cm，利用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按式（1）計(jì)算抑菌率。根據(jù)抑菌率及藥劑濃度之間的線性關(guān)系計(jì)算得出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)及有效抑制中濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

1.3.1.2 細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

真菌細(xì)胞膜受到抑菌劑的破壞時(shí)，菌體的天然屏障被打破，使其細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)滲出，從而導(dǎo)致菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升；因此菌體培養(yǎng)液相對(duì)電導(dǎo)率的改變、內(nèi)含物質(zhì)的相對(duì)泄漏度可作為反映真菌細(xì)胞膜的通透性重要指標(biāo)[36-37]。本研究采用電導(dǎo)率法[38]測(cè)定不同濃度MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞膜通透性的影響。在PD培養(yǎng)液中接入1 塊直徑為5 mm的葡萄座腔菌菌餅，于28 ℃下靜置培養(yǎng)7 d。從中挑出菌絲球，用蒸餾水洗滌數(shù)次，5 000 r/min離心10 min，濾紙吸干水分，稱取菌絲0.8 g放入裝有20 mL濃度分別為0（對(duì)照）、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L MeJA溶液的離心管中混勻，每個(gè)處理3 次重復(fù)。分別在混勻后0、1、3、6、12、24、48 h利用電導(dǎo)儀測(cè)定培養(yǎng)液電導(dǎo)率，并按式（2）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率；取2.0 mL培養(yǎng)液，5 000 r/min離心5 min，測(cè)定上清液在280 nm（蛋白質(zhì)）和260 nm（核酸）波長(zhǎng)處的吸光度，按式（3）計(jì)算細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)相對(duì)泄漏度[38]。

1.3.1.3 掃描電子顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察菌絲超微形態(tài)及結(jié)構(gòu)

分別從含有0（對(duì)照）、0.80 mmol/L MeJA的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的葡萄座腔菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅。掃描電子顯微鏡組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液（50 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）加10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%戊二醛溶液蒸餾水定容至100 mL，下同）4 ℃固定12 h，然后用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）沖洗3 次，每次15 min，乙醇（體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%）逐級(jí)洗脫，叔丁醇與無(wú)水乙醇按體積比1∶3、1∶1、3∶1逐級(jí)洗脫，每次10 min，再經(jīng)過(guò)干燥、粘樣、鍍膜，于掃描電子顯微鏡下觀察拍片。

透射電子顯微鏡組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液固定12 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定液固定2～3 h，乙醇（體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%）逐級(jí)梯度脫水，純丙酮、包埋液（體積比2∶1）進(jìn)行包埋處理，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色法染色后，對(duì)切片進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察并拍照，每個(gè)樣品至少觀察10 份超薄切片[38]。

1.3.1.4 葡萄座腔菌幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

取1.3.1.2節(jié)培養(yǎng)的病原菌菌絲體，5 000 r/min離心5 min，將沉淀轉(zhuǎn)入研缽中，加Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.5），液氮研磨破碎，轉(zhuǎn)入離心管中，生物顯微鏡觀察，無(wú)完整細(xì)胞后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶提取液。取兩支離心管，分別取200 μL粗酶液（以先煮沸5 min粗酶液作為對(duì)照）與200 μL膠狀幾丁質(zhì)混勻后，37 ℃下保溫1 h，加入200 μL硼酸鉀（0.8 mol/L），沸水浴5 min，冷卻，加3 mL質(zhì)量濃度1 g/100 mL DMAB溶液，37 ℃保溫20 min，冷卻，測(cè)定544 nm波長(zhǎng)處吸光度，同時(shí)以N-乙酰-D-氨基葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每分鐘催化生成1 μg N-乙酰-D-氨基葡萄糖時(shí)所用酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）[39]。

1.3.1.5 葡萄座腔菌β-1,3-葡聚糖酶活力的測(cè)定

取1.3.1.2節(jié)培養(yǎng)的病原菌菌絲體，5 000 r/min離心5 min，棄上清液。稱取0.3 g菌絲，用液氮研磨后加入1 mL 0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）轉(zhuǎn)入離心管。4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液蒸餾水透析4 h，在4 ℃下二次水透析12 h后，即為粗酶提取液。取100 μL粗酶液（以加入100 μL沸水浴處理10 min的粗酶液為對(duì)照），加入質(zhì)量濃度0.1 g/100 mL昆布多糖溶液400 μL，40 ℃水浴30 min，然后加入2 mL DNS，沸水浴10 min，立刻用流動(dòng)水冷卻，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)530 nm波長(zhǎng)處吸光度，利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-1,3-葡聚糖酶活力，每分鐘催化昆布多糖產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）[40]。

1.3.2 MeJA處理對(duì)獼猴桃軟腐病防控效果和果實(shí)品質(zhì)的影響

1.3.2.1 田間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間實(shí)驗(yàn)選擇兩個(gè)實(shí)驗(yàn)基地，分別為貴州修文縣久長(zhǎng)鎮(zhèn)茶山村綠園獼猴桃種植基地（果園1）和貴州省修文縣小菁鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)科技實(shí)驗(yàn)示范基地（果園2）。果園1：平均海拔為1 395 m，亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫12.8 ℃，降雨量1 180 mm；果園2：平均海拔1 320 m，年平均氣溫13.6 ℃，降雨量1 185.8 mm。兩個(gè)果園的土壤均為黃棕壤。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，處理A：幼果期（7月18日）噴施0.50 mmol/L MeJA水溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Tween-80以增加MeJA的溶解，下同）；處理B：壯果期（8月20日）噴施0.50 mmol/L MeJA水溶液；處理C：壯果期0.50 mmol/L MeJA水溶液進(jìn)行浸果；處理D：幼果期、壯果期分別噴施0.50 mmol/L MeJA水溶液；CK1：壯果期噴施3.00 mg/L 0.3%四霉素水劑；CK2：噴施0.1% Tween-80溶液，每處理重復(fù)3 次。2 個(gè)果園均以此設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。果實(shí)按小區(qū)采收，每小區(qū)100 個(gè)果，常溫（25 ℃）條件下貯藏直至果實(shí)完全軟化。

1.3.2.2 發(fā)病率、病情指數(shù)、防效的測(cè)定

果實(shí)軟腐病病害發(fā)生調(diào)查參照張承等[41]的方法。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，未發(fā)??；1級(jí)，0 cm＜病斑直徑≤1 cm；2級(jí)，1 cm＜病斑直徑≤2 cm；3級(jí)，2 cm＜病斑直徑≤3 cm；4級(jí)，3 cm＜病斑直徑≤4 cm；5級(jí)，4 cm＜病斑直徑≤5 cm；6級(jí)，病斑直徑＞5 cm。分別按式（4）～（6）計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防效。

1.3.2.3 果實(shí)品質(zhì)及貯藏性能測(cè)定

果實(shí)品質(zhì)測(cè)定參照張承等[41]研究方法。利用分析天平測(cè)定單果質(zhì)量，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定單果橫徑（赤道長(zhǎng)軸）、縱徑（果蒂至果臍距離）、側(cè)徑（赤道短軸）；利用PAL-1型折射儀測(cè)定果實(shí)中可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法測(cè)定；VC含量用2,6-二氯靛酚滴定法測(cè)定；可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用酸堿滴定法測(cè)定；葉綠素采用體積分?jǐn)?shù)98%乙醇提取，其含量采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定；硬度采用GY-4數(shù)顯式果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定；質(zhì)量損失率采用稱質(zhì)量法測(cè)定，并按式（7）進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算殺菌劑的毒力回歸方程、EC50及95%置信限，應(yīng)用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異性分析（P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌的抑菌活性

2.1.1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌抑菌率的影響

表1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌的抑菌率Table 1 Inhibition rate of MeJA against Botryosphaeria dothidea

由表1可知，MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，培養(yǎng)4 d后隨著MeJA濃度的升高菌落直徑逐漸減小，抑菌率呈極顯著增加趨勢(shì)（P＜0.01），說(shuō)明在0～0.80 mmol/L范圍內(nèi)，MeJA濃度越高，對(duì)獼猴桃軟腐病菌葡萄座腔菌抑制效果越好。計(jì)算MeJA對(duì)葡萄座腔菌的毒力回歸方程為y=6.272 05+2.009 16x，EC50為0.232 7 mmol/L，R2為0.997 6，95%置信限為（0.055 4，0.977 9）。

2.1.2 MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.1.2.1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲相對(duì)電導(dǎo)率的影響

圖1 MeJA對(duì)葡萄座腔菌相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig. 1 Effect of MeJA on the relative conductivity of Botryosphaeria dothidea

從圖1可以看出，隨著MeJA處理時(shí)間延長(zhǎng)和濃度升高，葡萄座腔菌相對(duì)電導(dǎo)率呈增加趨勢(shì)。在6 h后相對(duì)電導(dǎo)率差異較明顯，處理48 h后，0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mmol/L處理組葡萄座腔菌相對(duì)電導(dǎo)率分別比對(duì)照組高32.83%、42.78%、75.23%、89.89%、117.63%，同對(duì)照組相比，差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。表明MeJA可破壞葡萄座腔菌細(xì)胞膜穩(wěn)定性，且隨MeJA濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞膜破壞程度增強(qiáng)。

2.1.2.2 MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響

圖2 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲蛋白質(zhì)（A）和核酸類物質(zhì)（B）相對(duì)泄漏度的影響Fig. 2 Effect of MeJA on leakage of protein (A) and nucleic acid (B)from Botryosphaeria dothidea mycelia

由圖2A、B可知，隨著MeJA濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄座腔菌細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸相對(duì)泄漏度呈逐漸升高的趨勢(shì)，48 h后蛋白質(zhì)和核酸相對(duì)泄漏度同對(duì)照相比明顯升高，此時(shí)0.80 mmol/L MeJA處理組葡萄座腔菌細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸相對(duì)泄漏度分別比對(duì)照分別高出1.65 倍和2.0 倍，差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞膜破具有破壞作用，且處理濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，MeJA對(duì)葡萄座腔菌細(xì)胞膜破壞程度越嚴(yán)重。

2.1.3 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲超微形態(tài)的影響

圖3 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲超微形態(tài)的影響Fig. 3 Effect of MeJA on morphology of Botryosphaeria dothidea mycelial

由圖3可知，對(duì)照組葡萄座腔菌菌絲形態(tài)正常且菌絲濃密，菌絲表面光滑且生長(zhǎng)均勻，生長(zhǎng)點(diǎn)多且飽滿。經(jīng)0.80 mmol/L MeJA處理后，菌絲表面粗糙且菌絲稀疏，菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)少，表明菌絲生長(zhǎng)受到抑制。

2.1.4 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響

正常葡萄座腔菌的細(xì)胞壁光滑完整，細(xì)胞內(nèi)空腔較少，細(xì)胞核、線粒體完整，顆粒蛋白較多，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)顏色較深（圖4A、B）；而經(jīng)過(guò)0.80 mmol/L MeJA處理的葡萄座腔菌細(xì)胞壁有溶解現(xiàn)象，線粒體形狀變得不規(guī)則，部分細(xì)胞核有分解的趨勢(shì)（圖4C），空腔明顯增加，顆粒蛋白較少，且細(xì)胞質(zhì)比正常細(xì)胞顏色淺（圖4D）。

圖4 MeJA對(duì)葡萄座腔菌菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of MeJA on ultrastructure of Botryosphaeria dothidea mycelial

圖5 MeJA對(duì)葡萄座腔菌幾丁質(zhì)酶活力的影響Fig. 5 Effect of MeJA on chitinase activity fromBotryosphaeria dothidea mycelia

如圖5所示，隨著MeJA濃度的增加，葡萄座腔菌菌絲細(xì)胞壁幾丁質(zhì)酶活力逐漸升高，同對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，葡萄座腔菌經(jīng)MeJA處理后，幾丁質(zhì)酶活力增強(qiáng)，使病菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)不斷降解，引起幾丁質(zhì)組成成分N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量升高，從而影響病原菌的生長(zhǎng)，加速細(xì)胞死亡。

2.1.6 MeJA對(duì)葡萄座腔菌β-1,3-葡聚糖酶活力的影響

圖6 MeJA對(duì)葡萄座腔菌β-1,3葡聚糖酶活力的影響Fig. 6 Effect of MeJA on β-1,3-glucanase activity fromBotryosphaeria dothidea mycelia

β-1,3-葡聚糖是病原菌細(xì)胞壁主要成分，研究表明殼寡糖作用于菌絲細(xì)胞壁，可產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶水解病原菌細(xì)胞壁，可使病原細(xì)胞死亡[42]。從圖6可以看出，隨MeJA濃度增加，葡萄座腔菌菌絲細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖酶活力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)濃度為0.80 mmol/L時(shí)，同對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其余濃度處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。由此推斷，加入MeJA后，葡萄座腔菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖酶活力增強(qiáng)，導(dǎo)致病菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖水解，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。

2.2 MeJA對(duì)獼猴桃果軟腐病的防控效果及品質(zhì)的影響

2.2.1 MeJA對(duì)獼猴桃果軟腐病的防控效果

由表2可知，不同方式MeJA處理對(duì)獼猴桃軟腐病均有良好的防控效果，貯藏25 d后，果園1中，CK1、CK2平均發(fā)病率分別為48.39%、74.65%，除A處理組外，其余處理組平均發(fā)病率均極顯著低于2 個(gè)對(duì)照組（P＜0.01），防效較好的為處理C，達(dá)49.14%，其次為處理A、D，防效分別達(dá)35.26%、45.97%；果園2中，CK1、CK2平均發(fā)病率分別為53.33%、72.50%，各處理組平均發(fā)病率均顯著低于2 個(gè)對(duì)照組（P＜0.05），防效較好的為處理C，達(dá)77.70%，其次為處理A、D，防效分別達(dá)58.35%、69.46%。注：同一果園，同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05），同列肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）。下同。

表2 MeJA對(duì)防控獼猴桃軟腐病的效果Table 2 Control efficiency of MeJA against soft rot of kiwifruits

2.2.2 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)外觀品質(zhì)的影響

表3 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of MeJA on the development of kiwifruits

從表3可看出，果園1中，獼猴桃幼果期噴施0.50 mmol/L MeJA（處理A）可顯著增加果實(shí)縱徑，改善果形指數(shù)（P＜0.05），壯果期0.50 mmol/L MeJA浸果（處理C）可顯著增加果實(shí)橫徑、單果體積（P＜0.05）；果園2中，幼果期噴施0.50 mmol/L MeJA獼猴桃果實(shí)各指標(biāo)同CK1、CK2相比增加，但差異未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。表明MeJA處理一定程度上可改善果實(shí)外觀品質(zhì)。

2.2.3 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表4可知，采前不同時(shí)期MeJA處理后，獼猴桃果實(shí)VC、葉綠素、可溶性蛋白含量和可溶性糖、可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)同CK1、CK2相比有一定提高。表明MeJA處理對(duì)獼猴桃果實(shí)的品質(zhì)有一定改善作用，壯果期0.50 mmol/L浸果處理（處理C）效果較好。

表4 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 4 ffect of MeJA on nutritional quality of kiwifruits

表4 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 4 ffect of MeJA on nutritional quality of kiwifruits

果園 處理組VC含量/（mg/100 g）可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%葉綠素含量/（μg/g）可溶性蛋白含量/（mg/g）果園1 A 276.80±7.94b 7.39±1.32bc 8.45±0.86a 1.32±0.08a 9.04±1.60a 0.99±0.15a B 282.63±5.65a 6.71±1.36c 6.05±1.10b 1.27±0.08ab 10.65±4.91a 0.90±0.09a C 252.12±4.98d 9.42±1.85a 2.63±1.89c 1.51±0.03bc 11.93±0.80a 0.95±0.11a D 254.05±3.33d 8.43±0.74ab 5.50±0.55b 1.12±0.04c 9.90±2.95a 1.09±0.04a CK1266.02±4.56c 6.67±0.48c 6.29±0.84b 1.19±0.03bc 11.67±0.85a 1.08±0.03a CK2237.07±7.23e 6.51±0.86c 5.31±0.71b 1.18±0.04bc 9.81±4.07a 0.92±0.12a果園2 A 243.92±7.78d 9.87±1.59a 9.58±0.94a 1.23±0.06b 12.14±1.20a 1.03±0.09b B 270.33±4.23c 10.23±1.35a 8.69±0.88ab 1.39±0.14a 8.90±0.86a 1.00±0.05bc C 282.33±2.68a 10.62±2.10a 9.31±1.20a 1.20±0.02b 12.53±1.46a 1.17±0.03a D 270.12±5.44c 9.69±1.20a 5.32±0.90c 1.20±0.06b 11.83±4.18a 0.99±0.03bc CK1276.31±3.67b 9.42±1.90a 7.54±0.30b 1.27±0.01ab 11.86±1.64a 0.95±0.04bc CK2237.37±6.30e 9.56±2.16a 8.46±0.57ab 1.20±0.04b 11.53±0.79a 0.93±0.04c

2.2.4 MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)貯藏性的影響

2.2.4.1 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖7 貯藏期獼猴桃果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 7 Changes in soluble solids content of kiwifruits during storage

可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在獼猴桃成熟前會(huì)因果實(shí)成熟度升高而上升，是衡量果實(shí)成熟的標(biāo)準(zhǔn)之一[43]。如圖7A、B所示，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。貯藏25 d時(shí)，各MeJA處理組可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于CK1、CK2組，果園1、果園2分別以處理D、A效果明顯。表明采前MeJA（0.50 mmol/L）處理可以提高獼猴桃果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)延緩貯藏期間可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，起到延長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)貯藏時(shí)間的作用。

2.2.4.2 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖8 貯藏期獼猴桃果實(shí)可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 8 Changes in soluble sugar content of kiwifruits during storage

如圖8A、B所示，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高。貯藏25 d時(shí)，果園1中CK1、CK2組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.00%、13.29%，果園2中CK1、CK2組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.19%、12.55%，且均高于各MeJA處理組，但差異不明顯；果園1、果園2均為處理A、C效果較好。表明以0.50 mmol/L MeJA進(jìn)行幼果期噴施或壯果期浸果處理可以抑制獼猴桃果實(shí)可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，有利于果實(shí)貯藏保鮮。

2.2.4.3 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)VC含量的影響

圖9 貯藏期獼猴桃果實(shí)VC含量的變化Fig. 9 Changes in vitamin C content of kiwifruits during storage

如圖9所示，貯藏期各處理組VC含量呈下降的趨勢(shì)。貯藏25 d，兩果園MeJA處理獼猴桃果實(shí)VC含量均高于對(duì)照組，且貯藏過(guò)程中VC含量損失均低于對(duì)照組。果園1、果園2均為處理A效果較好，VC含量分別為163.70、

191.85 mg/100 g，明顯高于兩個(gè)對(duì)照組，其次分別為處理C、D。表明幼果期噴施0.50 mmol/L MeJA可有效降低貯藏期果實(shí)VC的損失。

2.2.4.4 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖10 貯藏期獼猴桃果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 10 Changes in titratable acid content of kiwifruits during storage

由圖10可知，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)。除果園1中的CK1組外，其余對(duì)照組可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降速度明顯快于MeJA處理組，說(shuō)明采前MeJA處理抑制了獼猴桃的軟化。果園1、果園2中均以處理A、C延緩效果較好。表明采前噴施MeJA可有效減少貯藏期可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低，使得獼猴桃果實(shí)保持適宜的糖酸比，有利于獼猴桃的貯藏品質(zhì)和風(fēng)味的保持。

2.2.4.5 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)葉綠素含量的影響

圖11 貯藏期獼猴桃果實(shí)葉綠素含量的變化Fig. 11 Changes in chlorophyll content of kiwifruits during storage

由圖11可知，隨著獼猴桃果實(shí)軟化衰老，果實(shí)中葉綠素含量不斷降低。貯藏25 d時(shí)，果園1中CK1、CK2組葉綠素含量分別為2.93、2.92 μg/g，低于各MeJA處理組；果園2中CK1、CK2葉綠素含量低于C、D處理組。表明適當(dāng)?shù)腗eJA處理可延緩獼猴桃果實(shí)貯藏期間葉綠素的損失，對(duì)貯藏期果實(shí)品質(zhì)維護(hù)起到輔助作用，其中果園1、果園2中分別以處理A、D效果較好。

2.2.4.6 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)可溶性蛋白含量的影響

圖12 貯藏期獼猴桃果實(shí)可溶性蛋白含量的變化Fig. 12 Changes in soluble protein content of kiwifruits during storage

由圖12可知，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，獼猴桃果實(shí)可溶性蛋白含量呈波動(dòng)下降的趨勢(shì)。貯藏25 d時(shí)，2 個(gè)果園CK1組可溶性蛋白含量稍低于各MeJA處理組；果園1中CK2組可溶性蛋白含量為0.35 mg/g，明顯低于各MeJA處理組；果園2中CK2組可溶性蛋白含量均稍低于各MeJA處理組。表明MeJA處理可以有效延緩可溶性蛋白損失，在獼猴桃果實(shí)貯藏中對(duì)果實(shí)品質(zhì)損失起到保護(hù)作用，其中，果園1、果園2均以B處理效果較好。

2.2.4.7 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)硬度的影響

水果的硬度是衡量果實(shí)是否成熟的標(biāo)準(zhǔn)之一[43]。如圖13所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)硬度呈下降趨勢(shì)，整個(gè)貯藏期各處理組獼猴桃果實(shí)硬度均高于2 個(gè)對(duì)照組。貯藏第25天，果園1、果園2中MeJA處理獼猴桃果實(shí)的最低硬度均高于2 個(gè)對(duì)照組。果園1中處理C效果較好，貯藏結(jié)束時(shí)硬度為3.90 kg/cm2；果園2中處理B效果較好，貯藏結(jié)束時(shí)硬度為1.84 kg/cm2。表明MeJA處理處理可有效延緩果實(shí)軟化，延長(zhǎng)獼猴桃貨架期。

圖13 貯藏期獼猴桃果實(shí)硬度變化Fig. 13 Changes in firmness of kiwifruits during storage

2.2.4.8 MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)質(zhì)量損失率的影響

圖14 貯藏期獼猴桃果實(shí)質(zhì)量損失率變化Fig. 14 Changes in mass loss rate of kiwifruits during storage

如圖14所示，整個(gè)貯藏過(guò)程中獼猴桃果實(shí)質(zhì)量損失率呈上升趨勢(shì)。貯藏5 d后，果園1、果園2 中CK2組質(zhì)量損失率逐漸上升，且上升速率明顯高于MeJA處理組；貯藏25 d后，果園1、果園2中效果較好的分別為處理A、C，但CK1組質(zhì)量損失率與MeJA處理組差異不明顯。表明采前MeJA處理可在一定程度上抑制果實(shí)水分蒸發(fā)和果實(shí)內(nèi)含物質(zhì)的損失，降低獼猴桃果實(shí)質(zhì)量損失率。

3 討 論

大量研究結(jié)果表明，MeJA可有效地抑制番茄、芒果和蘋果等果蔬釆后真菌性病害發(fā)生[22,24-26]。本研究表明，0～0.80 mmol/L MeJA對(duì)獼猴桃軟腐病菌葡萄座腔菌有均有一定抑制作用，且抑制效果隨MeJA濃度升高而增強(qiáng)，其EC50為0.232 7 mmol/L。與盤柳依等[44]在獼猴桃軟腐病葡萄座腔菌上的研究結(jié)果類似，同時(shí)李燦嬰[19]、孫嘉曼[45]等研究證實(shí)離體MeJA具有抑菌作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)0.80 mmol/L MeJA處理葡萄座腔菌菌絲體48 h后，可致菌絲細(xì)胞細(xì)胞壁溶解、胞內(nèi)細(xì)胞器增多且形狀變得不規(guī)則；同時(shí)不同濃度MeJA處理會(huì)引起菌絲體相對(duì)電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)與核酸相對(duì)泄漏度升高，細(xì)胞壁主要酶活力增強(qiáng)，從而破壞葡萄座腔菌菌絲細(xì)胞膜，影響葡萄座腔菌細(xì)胞代謝，達(dá)到抑菌或殺菌的作用；但MeJA對(duì)葡萄座腔菌是否存在其他方面的影響有待進(jìn)一步研究。

茉莉酸類化合物處理植物可系統(tǒng)誘導(dǎo)多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、脂氧合酶、蛋白酶抑制劑和殼聚糖酶等防御蛋白的活力升高[18]。王英珍等[18]研究表明，采前MeJA處理可有效提高果實(shí)中抗病性相關(guān)酶的活性，激活果實(shí)抗病防御系統(tǒng)，抑制成熟梨果實(shí)發(fā)病，李燦嬰等[46]研究發(fā)現(xiàn)MeJA可有效抑制病斑擴(kuò)展，抑制病害的發(fā)生與蔓延。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期進(jìn)行MeJA處理，結(jié)果表明采前一個(gè)月（壯果期）0.50 mmol/L MeJA浸果處理獼猴桃，對(duì)軟腐病的防效可達(dá)77.70%。獼猴桃軟腐病是由一種或幾種病原菌侵染引起，MeJA處理仍可有效防控其發(fā)生，認(rèn)為MeJA直接抑制葡萄座腔菌引起的軟腐病發(fā)生的同時(shí)可能抑制其他病原菌的生長(zhǎng)，或是誘導(dǎo)獼猴桃產(chǎn)生抗性，激活抗病防御機(jī)制，通過(guò)直接抑菌與誘導(dǎo)抗性形成協(xié)同性，有效防控軟腐病的發(fā)生。

外源MeJA處理能夠顯著提升農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，延長(zhǎng)農(nóng)產(chǎn)品保鮮時(shí)間，在香氣提升、次生代謝產(chǎn)物含量增加等方面的效用尤為明顯[47]。外源MeJA易進(jìn)入植物體內(nèi)，能夠有效透過(guò)植物細(xì)胞膜在植物體內(nèi)運(yùn)輸并發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，調(diào)節(jié)植物體一系列生理生化反應(yīng)[48]。同時(shí)外源MeJA可促進(jìn)草莓可溶性固形物含量的增加、保持水蜜桃的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、提高獼猴桃可溶性固形物含量[47-51]。本研究發(fā)現(xiàn)，MeJA處理可有效提高獼猴桃果實(shí)可溶性固形物、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和VC含量，改善獼猴桃品質(zhì)，與前人研究結(jié)果有共同之處。外源MeJA被吸收后可有效發(fā)揮信號(hào)分子作用，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，影響相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)苯丙氨酸途徑關(guān)鍵酶活性上升，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累[47]，這可能是MeJA改善獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵原因。

獼猴桃果實(shí)采后貯藏期間生理衰老及品質(zhì)裂變對(duì)果實(shí)硬度、糖、酸和水分保持有著重要的影響。硬度的保持可以降低果實(shí)軟化率、延長(zhǎng)貯藏期；水分及內(nèi)含物質(zhì)的損失會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味的下降[1]。胡文忠等[52]研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA可抑制果實(shí)呼吸強(qiáng)度、保持獼猴桃果實(shí)硬度、延緩果實(shí)中的VC、可溶性固形物等營(yíng)養(yǎng)的損失。本研究表明，采前一個(gè)月采用0.50 mmol/L MeJA浸果處理可抑制獼猴桃貯藏過(guò)程中硬度下降，延緩果實(shí)可溶性固形物、可溶性糖和VC的損失，有效延長(zhǎng)果實(shí)貯藏時(shí)間。盤柳依等[53]研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA可抑制果實(shí)的呼吸強(qiáng)度、降低質(zhì)量損失和腐爛率，從而有效保持獼猴桃果實(shí)品質(zhì)、延長(zhǎng)獼猴桃果實(shí)貯藏期，與本研究結(jié)果基本一致。對(duì)于外源MeJA對(duì)獼猴桃果實(shí)品質(zhì)和貯藏性能的影響機(jī)制、最佳處理時(shí)間及對(duì)獼猴桃其他方面的影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA對(duì)獼猴桃軟腐病致病菌葡萄座腔菌有抑制作用，EC50為0.232 7 mmol/L；通過(guò)MeJA對(duì)葡萄座腔菌作用機(jī)制的研究，證明了MeJA可直接作用于葡萄座腔菌，增加其菌絲細(xì)胞膜通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞壁水解酶（幾丁質(zhì)酶、β-1,3葡聚糖酶）活力增強(qiáng)，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞正常新陳代謝，從而達(dá)到抑菌的效果。采前一個(gè)月以0.50 mmol/L MeJA浸果處理可有效防控獼猴桃軟腐病的發(fā)生，改善獼猴桃果實(shí)品質(zhì)，減少果實(shí)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的損失，增強(qiáng)貯藏性能，從而達(dá)到保持獼猴桃果實(shí)食用價(jià)值且延長(zhǎng)貨架期的效果。