鹿 瑤，仇 丹，崔夢楠，高彥祥，毛立科,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，教育部北京市共建功能乳品重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.寧波工程學院奉化研究院，浙江 寧波 315599）

乳液凝膠又稱乳液填充凝膠、乳膠，是一種將乳化的油滴包埋在凝膠基質(zhì)中的軟固體，也是一種良好的新型智能功能因子傳遞體系[1]。功能因子傳遞體系，如傳統(tǒng)乳液、納米乳液、脂質(zhì)體、水凝膠等[2]，可以提高功能因子與食品基質(zhì)兼容性，確保功能因子在食品生產(chǎn)加工過程中的穩(wěn)定性及良好的生物利用率[3]。但是，大部分研究主要針對脂溶性功能因子或相似極性功能因子在傳遞體系中的釋放[4]。由于不同極性功能因子穩(wěn)定性和釋放機制存在較大差異，實現(xiàn)多功能因子的同時包埋和釋放存在著一定難度[5-6]。而乳液凝膠得益于其獨特的雙相結(jié)構(gòu)和凝膠網(wǎng)絡(luò)特性，脂溶性功能因子和水溶性功能因子可以同時分散到油相和凝膠結(jié)構(gòu)當中并得到有效保護[7]。

蛋白質(zhì)乳液凝膠的制備主要依賴于水相中蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，因此水相的結(jié)構(gòu)化，尤其是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，是影響乳液凝膠性能的核心因素[8]。影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性的因素，如溫度、離子強度、pH值，都會對乳液凝膠結(jié)構(gòu)特性產(chǎn)生影響[9-11]。通過合理的設(shè)計乳液凝膠的物理結(jié)構(gòu)，使其對不同的環(huán)境應(yīng)力有不同的應(yīng)激特性，可以影響包埋的功能因子的穩(wěn)定性及釋放速率。熱處理是對蛋白質(zhì)進行改性的主要手段之一[12-13]，通過改變球蛋白的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)界面疏水性改變，對蛋白質(zhì)的聚集和蛋白質(zhì)在油-水界面的界面活性產(chǎn)生影響[14]。

本研究通過控制熱處理時間改變?nèi)榍宸蛛x蛋白的變性程度，調(diào)節(jié)乳液水相和油水界面的組成，考察熱處理時間對乳液穩(wěn)定性、乳液凝膠質(zhì)構(gòu)及流變特性的影響。通過貯藏實驗探究溫度對乳液凝膠中不同維生素穩(wěn)定性的影響，闡釋乳液凝膠微結(jié)構(gòu)對復(fù)合功能因子穩(wěn)定性的影響機制，以期為乳液凝膠在功能性食品中的應(yīng)用和進一步發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（其中包含質(zhì)量分數(shù)為71%的β-乳球蛋白和質(zhì)量分數(shù)為12%的α-乳清蛋白） 美國Davisco公司；玉米油（食品級） 山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）（食品級） 上海新洛洛食品有限公司；VE（純度＞99%） 浙江新和成股份有限公司；異抗壞血酸鈉諸城華源生物工程有限公司；無水乙醇（分析純）、碘、淀粉指示劑 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；T25高速剪切機 德國IKA公司；NS1001L2K高壓均質(zhì)機 意大利GEA NiroSoavi公司；Zeta-sizer Nano-ZS90激光粒度儀 英國馬爾文公司；AR1500流變儀美國TA公司；TNS-Pro質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司；3k15離心機 德國Sigma公司；UV-1800紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清分離蛋白乳液的制備

配制質(zhì)量分數(shù)為5%的乳清分離蛋白水溶液，利用磁力攪拌器初步混勻；加入質(zhì)量分數(shù)為0.01%的疊氮化鈉防止蛋白質(zhì)腐??；置于4 ℃冰箱中過夜，使蛋白充分水合溶脹并分散在溶液當中；水溶液在85 ℃水浴中分別加熱10、20、30 min后，放置于冰浴中迅速冷卻；以此溶液為水相制備乳液。

在水相中加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的異抗壞血酸鈉，玉米油中加入質(zhì)量分數(shù)為1%的VE，將水相和油相以1∶4（V/V）的比例混合，使用高速剪切機（轉(zhuǎn)速10 000 r/min）剪切1 min制得粗乳液；再通過高壓均質(zhì)機（壓力50 MPa）均質(zhì)3 次獲得乳液；所得乳液放置于冰浴中迅速冷卻至室溫。

除了包埋復(fù)合功能因子的乳液外，還制備了只含有VE的乳液作為對照，用來觀察復(fù)合包埋和單獨包埋之間VE穩(wěn)定性的差異。

1.3.2 乳清分離蛋白乳液凝膠的制備

向所得的乳液中添加質(zhì)量分數(shù)為0.5%的GDL并攪拌均勻，在室溫下靜置12 h，即獲得蛋白質(zhì)乳液凝膠[15]。預(yù)實驗表明，兩種維生素的添加對乳液粒徑、穩(wěn)定性及凝膠的質(zhì)構(gòu)特性無顯著影響。

1.3.3 乳液粒徑和Zeta電位的測定

采用激光粒度儀測定乳液的粒徑與Zeta電位。取100 L樣品于試管中，加入20 mL去離子水稀釋200 倍體積。測定過程中設(shè)折光系數(shù)為1.450，25 ℃下保溫平衡2 min。為了減少多重散射所造成的誤差，每個樣品重復(fù)測定3 次，取平均值作為最終結(jié)果。將制得的乳液在25 ℃和55 ℃下貯藏12 d，每3 d測定乳液的粒徑和Zeta電位。

1.3.4 蛋白質(zhì)乳液及凝膠的流變性質(zhì)測定

乳液表觀黏度的測定：選用流動Ramp模式，將乳液置于平板間，抹去多余樣品。流變儀參數(shù)：40 mm平行面板（探頭），測試溫度為25 ℃，間隙設(shè)置為1 mm，剪切速率范圍為10～400 s－1。乳液凝膠黏彈性測定：選用小振幅動態(tài)頻率掃描模式，將乳液凝膠置于平板間。流變儀參數(shù)：40 mm平行面板（探頭），測試溫度為25 ℃，間隙設(shè)置為3 mm，頻率掃描范圍為0.01～10 Hz，應(yīng)變固定為0.1%（應(yīng)變值在凝膠的線性黏彈區(qū)之間）[15-16]。樣品周邊涂薄層硅油以減少測量過程中水分的蒸發(fā)。

1.3.5 蛋白質(zhì)乳液凝膠質(zhì)構(gòu)分析

采用1.3.2節(jié)的方法使乳液在25 mL燒杯中成膠，使用質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠的硬度、彈性、破裂應(yīng)變和破裂應(yīng)力。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：圓柱型柱塞探頭（直徑20 mm），在25 ℃的條件下以1 mm/s的速率壓縮（形變量50%）2 次，做3 組平行并記錄壓力-時間曲線。定義硬度為第1次壓縮時的最大峰值壓力，定義彈性為第2次壓縮中所測到的樣品恢復(fù)高度與第1次壓縮型變量之比，即樣品經(jīng)過第1次壓縮后能夠再恢復(fù)的程度。

1.3.6 貯藏過程中蛋白質(zhì)乳液凝膠中維生素穩(wěn)定性分析

將含有復(fù)合維生素的乳液凝膠充入氮氣，然后分別在25 ℃和55 ℃下貯藏12 d，每3 d測定凝膠中維生素的質(zhì)量濃度，按下式計算維生素的保留率。

1.3.6.1 VE質(zhì)量濃度的測定

VE質(zhì)量濃度的測定方法參考GB 1886.233—2016《食品安全國家標準 食品添加劑維生素E》[17]。準確稱取含VE的乳液凝膠3.0 g，加無水乙醇25 mL，攪拌，促進VE的溶出，冷卻過濾，提取3 次合并濾液；采用分光光度計在284 nm波長處測定濾液的吸收峰；利用標準曲線（y=0.005 2x－0.033 5）計算濾液中VE的質(zhì)量濃度。

1.3.6.2 D-異抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度的測定

D-異抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度的測定方法參考GB 1886.28—2016《食品安全國家標準 食品添加劑D-異抗壞血酸鈉》[18]。準確稱取凝膠樣品5.0 g，加30 mL蒸餾水搗碎后水浴加熱溶解；在3 600 r/min條件下離心30 min。用注射器吸取下層清液，采用碘滴定法測定清液中異抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗至少重復(fù)2 次，每個樣品至少檢測3 組數(shù)據(jù)，結(jié)果用來表示。運用Origin 8.0軟件作圖，運用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理時間對蛋白質(zhì)乳液性質(zhì)的影響

乳液的穩(wěn)定性受乳液液滴粒徑和Zeta電位等性質(zhì)的影響[19]，本實驗利用激光粒度儀對蛋白質(zhì)乳液的粒徑、Zeta電位進行了表征。粒度特征既可以從微觀上確定乳狀液分散相的組成特點，又可以從宏觀上描述食品乳狀液絮凝和聚結(jié)等過程[20-21]。根據(jù)Stokes規(guī)律，體系的顆粒粒徑越小，沉淀速度越慢，乳液也就越穩(wěn)定[5]。圖1顯示，25 ℃和55 ℃貯藏開始時，蛋白質(zhì)溶液熱處理時間越長，乳液液滴粒徑越小，這可能是由于加熱時間的延長提高了蛋白質(zhì)變性的程度，促進了疏水基團的暴露，增強了蛋白質(zhì)的乳化效果，使得更多的油滴能被乳化劑充分覆蓋，防止了油滴的聚集。Liang Yichao等[22]也得出了相似的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)展開的蛋白質(zhì)分子在油相界面重新排列形成界面膜，抑制了油滴的聚集和絮凝現(xiàn)象，提高了乳液的穩(wěn)定性。而在Wang Xufeng等[23]的研究中，蛋白經(jīng)過加熱預(yù)處理后乳液的粒徑卻增大了，這可能是由于該實驗的加熱溫度（90 ℃）過高，造成了大量蛋白質(zhì)聚集，從而不能有效吸附到油滴的表面。而隨著貯藏時間的延長，各實驗組的乳液粒徑均呈現(xiàn)上升趨勢，觀察粒徑分布（乳液的粒徑分布代表的是液滴尺寸和顆粒濃度之間的關(guān)系）的變化可以得出一致的結(jié)果，且在55 ℃貯藏條件下，乳液粒徑上升的幅度更大：10 min組從開始的306 nm到貯藏結(jié)束時達到374 nm；20 min組從開始的300 nm到貯藏結(jié)束時達到347 nm；30 min組從開始的294 nm到貯藏結(jié)束時達到325 nm。而在25 ℃貯藏條件下，10 min組乳液粒徑從開始的306 nm到貯藏結(jié)束時為320 nm；20 min組從開始的300 nm到貯藏結(jié)束時為319 nm；30 min組從開始的294 nm到貯藏結(jié)束時為309 nm。這說明乳液粒徑除了受熱處理時間的影響外，還在一定程度上由貯藏環(huán)境溫度所決定，貯藏溫度越高，油滴的聚集速度越快，乳液粒徑增加，乳液會更快失穩(wěn)。

當?shù)鞍踪|(zhì)等表面活性物質(zhì)吸附到油滴表面時，可以使油水界面具有與該表面活性物質(zhì)相同的帶電性，且表面電位強度（Zeta電位絕對值）越高，乳化油滴之間的靜電排斥作用就越強，可以有效地阻止液滴的相互靠近和聚集[24]。從表1乳液凝膠Zeta電位的測定結(jié)果可以推斷出相似的結(jié)論，乳液體系的pH值在6.8左右，高于乳清分離蛋白的等電點pH 4.5，所以體系油滴表面帶負電。整體來說乳液的Zeta電位強度維持在30～40 mV左右，但隨加熱時間的延長，乳液的Zeta電位強度也略微增加，進而導(dǎo)致分子間的靜電相互排斥作用增強，增加乳液的穩(wěn)定性。隨著貯藏時間的延長，乳液的Zeta電位強度呈下降趨勢，液滴之間的靜電排斥作用會減弱，也導(dǎo)致了乳液的進一步失穩(wěn)。而通過流變儀觀察乳液的表觀黏度隨著剪切速率（50～400 s－1）的變化（圖2），可以看出熱處理時間對乳液的表觀黏度無明顯影響。

圖1 不同貯藏溫度下不同加熱時間的乳液粒徑隨貯藏時間的變化及25 ℃貯藏條件下的粒徑分布變化Fig. 1 Variation in particle size of emulsions stabilized by WPI undergoing different durations of heat treatment as a storage temperature and storage time and variation in particle size distribution of each treatment group during storage at 25 ℃

表1 不同貯藏溫度下乳液Zeta電位隨貯藏時間的變化Table 1 Variation in zeta-potential of emulsions as a function of storage temperature and time

圖2 熱處理時間對蛋白質(zhì)乳液表觀黏度的影響Fig. 2 Effect of heat treatment time on apparent viscosity of WPI emulsions

2.2 熱處理時間對蛋白質(zhì)乳液凝膠性質(zhì)的影響

本研究中乳液凝膠的形成主要分為2 步：1）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)在蛋白水溶液（中性pH值、低離子強度、加熱溫度低于熱凝膠的臨界溫度）的熱處理過程中去折疊，逐漸展開，疏水基團暴露并吸附在油滴表面，同時界面相蛋白的親水基團與連續(xù)相的其他蛋白通過靜電作用交聯(lián)聚集；2）向制得的乳液中添加GDL，GDL水解產(chǎn)生葡萄糖酸[25]，導(dǎo)致乳液體系的pH值逐漸降低，直到接近蛋白質(zhì)的等電點（pH 4.6）時，蛋白質(zhì)表面電荷被中和，然后在疏水作用、靜電作用、二硫鍵等共同作用下蛋白質(zhì)分子或聚集體之間互相交聯(lián)締合形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[26]。所以熱處理通過影響蛋白質(zhì)的變性程度對凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響[27]。均質(zhì)過程雖然有熱量產(chǎn)生，但溫度上升不會超過40 ℃，與高溫熱處理（85 ℃）相比并不足以引起蛋白的明顯變性，所以其影響可以忽略不計。圖3展示了不同加熱時間下乳液凝膠的外觀形貌?？梢灾庇^地看到，加熱10 min和20 min形成的凝膠質(zhì)地形態(tài)較柔軟，尤其是10 min組形狀最為松散，而加熱30 min形成的凝膠結(jié)構(gòu)較為致密，形狀也更為規(guī)整。

表2乳液凝膠的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示出了與圖3一致的結(jié)果：隨著加熱時間的延長，凝膠的硬度、破裂應(yīng)變增大，10～20 min有明顯增加。這應(yīng)該是由于充足的加熱時間保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的充分展開，暴露出更多的疏水基團，促進了蛋白質(zhì)聚合物的交聯(lián)和凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。而且從數(shù)據(jù)變化來看，在10～20 min時凝膠的硬度、破裂應(yīng)力等有了一個較大的變化，但20～30 min的數(shù)據(jù)差異并不大，說明蛋白質(zhì)的變性程度與加熱時間并不是簡單的線性關(guān)系。除去加熱未完全的10 min，雖然加熱20 min組比加熱30 min組形成的凝膠的硬度小，但是凝膠彈性卻稍大，可能與其形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)剛性更弱有關(guān)。

圖3 熱處理時間對乳液凝膠外觀的影響Fig. 3 Effect of heat treatment time on the appearance of emulsion gels

表2 熱處理時間對乳液凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Table 2 ffect of heat treatment time on texture properties of emulsion gels

表2 熱處理時間對乳液凝膠質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的影響Table 2 ffect of heat treatment time on texture properties of emulsion gels

指標 10 min 20 min 30 min硬度/N 0.35±0.04 2.17±0.07 2.41±0.05彈性/mm 0.17±0.27 6.85±0.27 6.65±0.26破裂應(yīng)變/mm 0.12±0.09 6.73±0.44 9.15±0.73破裂應(yīng)力/（N/mm） 1.51±0.19 0.36±0.06 0.36±0.03

圖4 熱處理時間對頻率掃描中乳液凝膠G'（A）和G”（B）的影響Fig. 4 Effect of heat treatment time on storage modulus (G') (A) and loss modulus (G”) (B) of emulsion gels

乳液凝膠過程中儲能模量（G'）的增加被認為是蛋白凝膠強度或硬度增加的表現(xiàn)[15]。分析圖4乳液凝膠的頻率掃描可以得出類似的結(jié)論，熱處理時間的延長可以提高乳液凝膠的G'，增強乳液凝膠的強度。除此之外，隨著頻率的不斷升高（0.01～10 Hz），乳液凝膠的G'和損失模量（G”）均呈現(xiàn)上升趨勢。加熱10 min的樣品G'從843 Pa上升到了2 861 Pa，G”從210 Pa上升到了1 499 Pa；加熱20 min的樣品G'從1 857 Pa上升到了4 815 Pa，G”從434 Pa上升到了653 Pa；加熱30 min的樣品G'從2 127 Pa上升到了7 197 Pa，G”從927 Pa上升到了2 261 Pa。研究表明，相較于典型的強凝膠體系，凝膠的G'和G”基本不依賴于頻率變化[28]，在弱凝膠體系中，兩者的增加則對頻率具有依賴性[29]。所以推斷本實驗中設(shè)計的蛋白質(zhì)乳液凝膠應(yīng)該為弱凝膠體系。

2.3 蛋白質(zhì)乳液凝膠中復(fù)合維生素的穩(wěn)定性

乳液凝膠既具有水凝膠的熱力學穩(wěn)定性，又具有乳液傳遞脂溶性功能因子的特性[1]，功能因子分散于乳液凝膠結(jié)構(gòu)當中，一方面受到凝膠的保護；另一方面被凝膠結(jié)構(gòu)固化，因此具有較高的理化穩(wěn)定性。通過設(shè)計乳液凝膠的物理結(jié)構(gòu)，使其對環(huán)境應(yīng)力具有不同的應(yīng)激性，可以改變被包埋功能因子的穩(wěn)定性及釋放特性，進而提高功能因子生物利用率[30-31]。

本實驗將乳液凝膠貯藏在不同溫度下，測定其中VE和異抗壞血酸鈉的含量變化，計算其保留率，分析乳液凝膠結(jié)構(gòu)對復(fù)合維生素穩(wěn)定性的影響規(guī)律。圖5顯示，乳清分離蛋白加熱處理時間和貯藏溫度對VE的保留率都有著明顯的影響。乳清分離蛋白加熱時間越長，VE的保留率越高，降解速率越慢，穩(wěn)定性越好。在25 ℃貯藏條件下，起初VE的保留率下降較緩慢，但貯藏中后期隨著凝膠結(jié)構(gòu)的破壞，VE的保留率也明顯降低，貯藏28 d后保留率僅為40%左右；而在55 ℃貯藏條件下，VE的保留率下降速率要高于常溫貯藏時，說明高溫促進了體系中VE的氧化降解。

圖5 熱處理時間對貯藏過程中V穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of heat treatment time on the stability of VE during storage

由圖6可知，與VE降解規(guī)律類似，異抗壞血酸鈉的降解與乳清分離蛋白加熱處理時間和凝膠貯藏溫度也有著密切的關(guān)系。可直觀地看出，在25 ℃貯藏條件下，加熱時間越長，異抗壞血酸鈉的保留率越高，穩(wěn)定性越好。因為凝膠在貯藏過程中會發(fā)生析水現(xiàn)象，加熱時間越短，凝膠結(jié)構(gòu)越松散，析水的現(xiàn)象越明顯，導(dǎo)致異抗壞血酸鈉隨著水分遷移到凝膠外部甚至表面，失去凝膠的保護作用。但在高溫（55 ℃）的貯藏條件下，熱處理時間對其保留率卻沒有明顯的影響，且在貯藏12 d時異抗壞血酸鈉的含量已經(jīng)接近于0，同時期25 ℃條件下其保留率仍為60%左右。這說明貯藏溫度對異抗壞血酸鈉穩(wěn)定性的影響大于熱處理時間。同時，對比VE和異抗壞血酸鈉的降解速率，可以看出后者的降解速率更快，這可能是由于異抗壞血酸鈉主要分布于水相中，更易直接受到光熱氧的影響，且它作為抗氧化劑對VE起到了一定程度的保護作用。

圖6 熱處理時間對貯藏過程中異抗壞血酸鈉穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of heat treatment time on the stability of sodium erythorbate during storage

為了進一步研究乳液凝膠中復(fù)合維生素抗氧化的作用機制，研究連續(xù)相中異抗壞血酸鈉對油相中VE穩(wěn)定性的影響，本實驗對比了不同加熱時間單獨包埋VE和復(fù)合包埋2 種維生素條件下，VE貯藏保留率的變化。由圖7可知，在3 組不同的加熱時間及25 ℃貯藏條件下，復(fù)合包埋的VE保留率均高于單獨包埋，且加熱時間越長VE的穩(wěn)定性越好，尤其是在單獨包埋的條件下保護效果更明顯。這說明復(fù)合包埋可以在一定程度上提高油相中VE的穩(wěn)定性，連續(xù)相中的異抗壞酸鈉的確對VE起著一定的抗氧化作用。

圖7 單獨包埋和復(fù)合包埋對貯藏過程中VE穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effects of incorporation of VE alone and in combination with sodium isoascorbate on VE stability during storage

3 結(jié) 論

通過控制熱處理時間可以調(diào)整蛋白質(zhì)的變性程度，對蛋白質(zhì)乳液的性質(zhì)和乳液凝膠的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。熱處理時間較長的蛋白質(zhì)乳液具有更小的粒徑和更大的Zeta電位強度，形成的乳液凝膠質(zhì)地更致密，硬度和強度也更大。因此，通過改變蛋白質(zhì)熱處理的時間可以有效調(diào)控乳液凝膠的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。另一方面，蛋白質(zhì)乳液凝膠可以同時包埋兩種不同極性的維生素，維生素的穩(wěn)定性與乳液凝膠的微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。VE和異抗壞血酸鈉的穩(wěn)定性隨凝膠中蛋白質(zhì)加熱時間的延長而增大，且復(fù)合包埋條件下VE的降解速率更低。本研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)乳液凝膠可以作為不同極性功能因子的傳遞體系，提高功能因子的穩(wěn)定性，為進一步開發(fā)新型功能食品提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。