姜飛虹，宋子涵，牛 晨，張宇翔，魏建平，岳田利,*

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（楊凌），國家農(nóng)業(yè)綜合測試工程研究中心（楊凌），陜西 楊凌 712100；2.西北大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710000）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種羊毛硫氨酸細菌素，能夠有效地抑制革蘭氏陽性菌[1-2]。Nisin無毒、無味且熱穩(wěn)定性較好，作為一種食品添加劑被廣泛地應(yīng)用在乳制品、蛋類、蔬菜、肉制品和魚類等食品加工過程中，用來控制有害微生物的污染。然而，Nisin能夠與液體食品中的蛋白質(zhì)、糖和酯類等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，降低了它的抑菌活性，因此在液體食品中鮮少應(yīng)用。更重要的是，Nisin作為天然食品抑菌劑噴灑在食品表面，由于長期暴露在微生物表面，可能導致耐藥菌的產(chǎn)生[3-4]。

因為磁性納米粒子（iron oxide nanoparticles，IONPs）具有比表面積大、磁選速度快、吸附能力高和經(jīng)濟耐用等優(yōu)點，已經(jīng)成為一種重要的磁性材料，被廣泛應(yīng)用在蛋白的固定化、酶的分離純化、重金屬吸附、染料去除以及靶向給藥等領(lǐng)域[5-6]。但是，因為磁性納米粒子表面能較大，容易發(fā)生聚沉和氧化，在實際應(yīng)用中應(yīng)對其表面進行修飾[7]。多巴胺是一種通用的表面修飾劑，只需簡單的步驟即可在材料表面形成聚多巴胺膜，合成方法和操作簡單、經(jīng)濟，被廣泛地應(yīng)用于生物材料的表面修飾[8]。

生物物質(zhì)的吸附是一個復雜的過程，當Nisin被吸附到磁性納米粒子表面時，Nisin的結(jié)構(gòu)和活性、吸附時間、吸附溫度以及吸附劑的表面性質(zhì)等都會影響到吸附的效率[6]。

綜上所述，本研究通過測定不同溫度和時間下多巴胺磁性納米粒子（IONPs@pDA）吸附Nisin的含量，運用不同方程進行吸附動力學和吸附等溫線擬合，系統(tǒng)研究多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的機理和特性，以期為制備出既能保留Nisin抗菌活性又能夠快速磁分離防止耐藥菌產(chǎn)生的耦合體殺菌材料提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Nisin（活力10 000 IU/mL）、多巴胺 美國Sigma公司；考馬斯亮藍 海博生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2～7.4）、硫酸亞鐵、硝酸鐵、三乙胺、甲醇和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純） 西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RHD-160數(shù)顯強力恒速電自動攪拌機 常州市人和儀器廠；Victor X3多功能酶標儀 美國PE公司；FD5-3真空冷凍干燥機 美國西盟公司；QYC-2102C恒溫搖床上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；UPHW-I優(yōu)普系列超純水器優(yōu)普實業(yè)儀器（上海）有限公司；AUY220萬分之一天平日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 多巴胺磁性納米粒子的制備

磁性納米粒子的制備：分別配制0.1 mol/L硫酸亞鐵和硝酸鐵溶液，以體積比1∶1混合于大燒杯中，用機械攪拌器攪拌30 min。隨后加入3 mmol/L SDS，繼續(xù)用機械攪拌器攪拌30 min，逐滴加入三乙胺（體積分數(shù)5%），大力攪拌2 h，整個過程均在攪拌下進行。在3 h的攪拌下，懸液由深棕色變?yōu)榧兒谏?，即視為反?yīng)完成。磁性分離后重懸于超純水中，用超純水和甲醇反復清洗，經(jīng)真空冷凍干燥，得到固體磁性納米粒子，以備后續(xù)實驗[9]。

多巴胺磁性納米粒子的制備：將固體多巴胺加入到PBS（10 mmol/L、pH 8.5）中，用機械攪拌器攪拌溶解，再加入制備好的磁性納米粒子，充分攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)磁性分離，重懸于超純水中，充分攪拌12 h，經(jīng)真空冷凍干燥得到多巴胺磁性納米粒子，以備后續(xù)實驗[10]。

1.3.2 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin分析

1.3.2.1 Nisin標準曲線制作及含量的測定

用萬分之一天平準確稱取Nisin試劑0.010 0 g，用移液槍準確量取1 mL PBS（10 mmol/L、pH 6.86），充分溶解后作為Nisin標準溶液的母液。將母液依次稀釋至質(zhì)量濃度為0.006 0、0.005 0、0.004 0、0.003 0、0.002 0、0.001 0、0.000 5 mg/mL，即為Nisin系列標準溶液。

準確量取20 μL Nisin標準溶液和待測樣品，加入100 μL考馬斯亮藍溶液，充分混合均勻并靜置5 min，用酶標儀在595 nm波長下測定混合液的吸光度，繪制Nisin標準曲線，計算待測樣品中的Nisin含量。每個樣品設(shè)置3 個平行實驗。

1.3.2.2 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附動力學分析

用萬分之一天平準確稱取0.080 0 g Nisin固體粉末，用20 mL PBS（10 mmol/L、pH 6.86）溶解。再準確稱取0.080 0 g多巴胺磁性納米粒子，加入到Nisin溶液中，將混合物分別放置在溫度為298、318、338 K的水浴鍋中恒溫振蕩吸附，在吸附時間為0、5、10、30、60、90、120、150、180 min時，量取20 μL吸附溶液，磁性分離后測定Nisin含量。每個測定溫度設(shè)置3 個平行實驗。

測定Nisin含量后，計算9 個時間點所對應(yīng)的Nisin吸附量Qt，以時間t為橫坐標、吸附量Qt為縱坐標作圖，得到不同溫度下的吸附動力學曲線。

本實驗選擇了4 種動力學方程來進行吸附動力學過程的線性擬合，分別是Lagergren準一級反應(yīng)動力學方程[11]、Lagergren準二級反應(yīng)動力學方程[12]、Elovich方程[13]和內(nèi)部擴散方程[14]。

Lagergren準一級反應(yīng)動力學方程如式（1）所示。

式中：K1為Lagergren準一級反應(yīng)動力學速率常數(shù)/min－1；Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；t為吸附時間/min。

Lagergren準二級反應(yīng)動力學方程如式（2）所示。

式中：K2為Lagergren準二級反應(yīng)動力學速率常數(shù)/（mg/（mg·min））；Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；t為吸附時間/min。

Elovich方程如式（3）所示。

式中：Qt為吸附時間為t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；α為反應(yīng)初始吸附速率/（mg/（mg·min））；β為解吸常數(shù)/（mg/mg）。

內(nèi)部擴散方程如式（4）所示。

式中：Qt為吸附時間t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；Kd為吸附反應(yīng)的內(nèi)部擴散速率常數(shù)/（mg/（mg·min1/2））；I為邊界層的厚度對吸附過程影響的常數(shù)/（mg/mg）。

1.3.2.3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫線分析

準確配制Nisin標準溶液，使其質(zhì)量濃度依次為0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.003 0、0.004 0、0.005 0 g/mL。用萬分之一天平準確稱取0.004 0 g多巴胺磁性納米粒子，加入到1 mL配制好的Nisin溶液中，將混合物放置在溫度分別為298、318、338 K的水浴鍋中恒溫振蕩吸附，磁性分離后測定Nisin含量。每個測定溫度設(shè)置3 個平行實驗。

以吸附達到平衡時Nisin的質(zhì)量濃度Ce為橫坐標、吸附量Qe為縱坐標作圖，繪制出不同溫度的吸附等溫線。吸附量Qt的計算如公式（5）[15]所示。

式中：Qt為吸附時間t時Nisin的吸附量/（mg/mg）；C0為吸附反應(yīng)中Nisin的初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Ct為吸附時間為t時Nisin的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為反應(yīng)時Nisin溶液的總體積/mL；m為加入的多巴胺磁性納米粒子的質(zhì)量/mg。

為了更深入地研究Nisin吸附反應(yīng)過程中的平衡吸附關(guān)系，本實驗選擇了3 種吸附等溫方程進行擬合，依次是Langmuir吸附等溫方程[16]、Freundlich吸附等溫方程[8]和Temkin吸附等溫方程[17]。

Langmuir吸附等溫方程如式（6）所示。

式中：Qm為單分子層趨于飽和時的理論吸附量/（mg/mg）；Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；KL為朗繆爾常數(shù)/（mL/mg）。

朗繆爾吸附等溫模型的另一種表達方式是用分離系數(shù)RL來表示，如式（7）所示。

式中：C0為吸附反應(yīng)中N i s i n的初始質(zhì)量濃度/（mg/mL）；KL為朗繆爾常數(shù)/（mL/mg）。

Freundlich吸附等溫方程如式（8）所示。

式中：Qe為吸附達到平衡時Nisin的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；KF為Freundlich模型下Nisin的最大吸附量/（mg/mg）；bF為Freundlich吸附平衡常數(shù)/（mg/（mg·min））。

Temkin吸附等溫方程如式（9）所示。

式中：Qe為吸附達到平衡時N i s i n的平衡吸附量/（mg/mg）；Ce為吸附達到平衡時Nisin的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；bT代表吸附強度/（J/mol）；AT為吸附平衡時的結(jié)合常數(shù)/（mg/mL）；R為理想氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.3.2.4 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的熱力學分析

吸附熱力學可以探究吸附反應(yīng)溫度對整個吸附過程的影響。熱力學參數(shù)的計算公式如式（10）、（11）所示[18]。

式中：KL為朗繆爾常數(shù)/（mL/mg）；ΔG°為標準吉布斯自由能變/（kJ/mol）；ΔH°為標準焓變/（kJ/mol）；ΔS°為標準熵變/（J/（mol·K））；R為理想氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為絕對溫度/K。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進行相關(guān)圖表的繪制以及模型的擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附動力學分析結(jié)果

多巴胺磁性納米粒子在不同溫度條件下吸附Nisin的動力學曲線如圖1所示。隨著吸附時間的延長，磁性納米粒子對Nisin的吸附量不斷增加。吸附反應(yīng)在前5 min時反應(yīng)速率較高，5 min后吸附速率增長緩慢。這是因為隨著吸附反應(yīng)的進行，多巴胺磁性納米粒子的吸附位點逐漸減少，導致Nisin的吸附速率逐漸降低，直至達到吸附平衡。在298、318、338 K的溫度下，多巴胺磁性納米粒子的最大吸附量分別為0.421 4、0.407 7、0.494 9 mg/mg。

圖1 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的動力學曲線Fig. 1 Adsorption kinetics of nisin on IONPs@pDA at different temperatures

圖2 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的動力學方程擬合曲線Fig. 2 Linear kinetic plots of nisin adsorption onto IONPs@pDA at different temperatures

吸附動力學研究通過線性方程的擬合，計算吸附過程中吸附質(zhì)在固液界面上的吸附速率等重要參數(shù)[19]，了解吸附機理和吸附本質(zhì)。本研究選擇了4 種吸附動力學方程對吸附動力學過程進行擬合，結(jié)果如圖2所示。

表1 Lagergren準一級、準二級吸附動力學方程的吸附速率常數(shù)、理論及實際平衡吸附量Table 1 Pseudo-first-order and pseudo-second-order adsorption rate constants as well as calculated and experimental Qe values

由表1可知，Lagergren準二級動力學方程的R2最高，理論吸附量與實際吸附量更接近。因此，多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程更加符合Lagergren準二級吸附動力學模型，吸附速率由吸附劑表面未被占用的吸附空位數(shù)目的平方值決定。多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附受化學吸附控制，且化學吸附占主導作用，吸附過程涉及吸附質(zhì)與吸附劑間的電子共享或電子轉(zhuǎn)移[20-21]。類似地，磁性鋅鐵氧體-海藻酸生物高分子復合材料對染料的吸附[22]、聚噻吩磁性納米粒子吸附瀝青[23]和磁性納米粒子從水中吸附堿性藍[24]的過程都符合Lagergren準二級吸附動力學模型，說明許多磁性納米粒子對蛋白和染料等物質(zhì)的吸附過程并非是簡單的物理吸附，而主要受化學吸附控制。

表2 Elovich方程和內(nèi)部擴散方程基本參數(shù)及相關(guān)系數(shù)Table 2 Basic parameters and correlation coefficients calculated for Elovich and pore diffusion equations

Elovich模型一般用于模擬吸附速率，隨著吸附溫度的增加，初始速率常數(shù)α也會增大，因此實驗中可以通過提高吸附溫度來增加初始反應(yīng)速率。如表2所示，通過比較R2發(fā)現(xiàn)，Elovich模型較內(nèi)部擴散模型能更好地解釋吸附過程，說明吸附反應(yīng)速率和外部的不均勻擴散共同影響吸附過程[25]。如果內(nèi)部擴散模型擬合結(jié)果是線性的，說明顆粒內(nèi)擴散參與了吸附過程；如果擬合線經(jīng)過原點，則說明顆粒內(nèi)擴散是吸附反應(yīng)的限速步驟。由圖2d可知，內(nèi)部擴散模型的3條擬合線均沒有經(jīng)過原點，說明內(nèi)部擴散模型不能準確反映Nisin的吸附過程，且顆粒內(nèi)擴散并不是Nisin吸附過程中的主要限速步驟[26]。

2.2 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫線分析結(jié)果

圖3 多巴胺磁性納米粒子在不同溫度下對Nisin的吸附等溫線Fig. 3 Adsorption isotherms of nisin onto IONPs@pDA with different temperatures

如圖3所示，隨著Nisin平衡質(zhì)量濃度（Ce）的增加，平衡吸附量（Qe）也在不斷增加。當Nisin平衡質(zhì)量濃度增加到一定程度時，平衡吸附量增加緩慢或者不再變化，這是因為多巴胺磁性納米粒子吸附位點有限，導致吸附量不再隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。另外，由圖3可知，平衡吸附量隨著溫度的升高而增大，表明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程是吸熱反應(yīng)。

吸附等溫線描述了特定溫度下吸附質(zhì)從液體介質(zhì)到固體吸附劑的遷移過程[27]。本研究選擇了3 種吸附等溫方程，分別是Langmuir吸附等溫方程、Freundlich吸附等溫方程和Temkin吸附等溫方程，對吸附等溫線進行線性擬合，結(jié)果見圖4a、b、c。依據(jù)擬合結(jié)果，得到擬合直線的斜率和截距，分別計算獲得3 種模型常數(shù)（表3）。根據(jù)朗繆爾吸附等溫模型計算相應(yīng)溫度下的分離系數(shù)RL，結(jié)果見圖4d。

圖4 多巴胺磁性納米粒子吸附Nisin的熱力學方程擬合曲線Fig. 4 Linear thermodynamic plots of nisin adsorption onto IONPs@pDA

表3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附等溫模型常數(shù)Table 3 Isotherm constants for adsorption of nisin by IONPs@pDA

Langmuir吸附等溫方程是一個經(jīng)驗方程，它假設(shè)吸附是單層且均勻的過程，即反應(yīng)具有恒定的焓和吸附活化能，用來描述吸附劑表面均勻時的吸附過程[28]。對于Langmuir吸附模型，KL能反映多巴胺磁性納米粒子結(jié)合Nisin的穩(wěn)定性，實驗中KL隨著溫度的升高而增大，說明溫度的升高提高了多巴胺磁性納米粒子-Nisin耦合體的穩(wěn)定性，更有利于吸附反應(yīng)的進行。通過KL計算吸附反應(yīng)的分離系數(shù)RL，根據(jù)RL可以判斷吸附反應(yīng)過程的難易程度（RL＞1，反應(yīng)不易進行；RL=1，線性反應(yīng)；0＜RL＜1，反應(yīng)較易進行；RL=0，反應(yīng)不可逆）[28]。如圖4d所示，3 個溫度下的RL均在0～1之間，代表吸附反應(yīng)過程容易進行。Freundlich吸附等溫模型是一個經(jīng)驗?zāi)Ｐ停脕砻枋鑫絼┑亩喾肿訉硬痪鶆蛭竭^程[29]。Freundlich模型中KF代表吸附劑的吸附能力，bF用來描述吸附發(fā)生的難易程度（bF＞1，反應(yīng)不易進行；bF=1，反應(yīng)不可逆；0＜bF＜1，反應(yīng)較易進行）[30]。本研究中KF隨溫度的升高而增大，表明溫度的升高提高了吸附劑的吸附能力，再次證明吸附過程是一個吸熱反應(yīng)。而bF均小于1且隨溫度的升高而降低，表明溫度的升高使吸附反應(yīng)越來越容易進行。Temkin吸附等溫模型用于研究非勻質(zhì)表面能系統(tǒng)中吸附劑與吸附質(zhì)之間的相互作用[31]。AT是達到吸附平衡時的結(jié)合常數(shù)，隨著溫度的升高，AT逐漸增大，表明隨溫度的升高，多巴胺磁性納米粒子與Nisin的結(jié)合作用逐漸增強。

通過比較表3中3 種模型的R2發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)reundlich模型能夠更好地描述多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程。說明本研究制備的多巴胺磁性納米顆粒表面存在不均勻的吸附位點，并不是單一的單層、均勻吸附，反應(yīng)是由各種相互作用引起的發(fā)生在吸附劑表面的多層不均勻吸附過程。吸附過程符合Freundlich模型的還有磁性海藻酸鹽/氧化碳納米管復合材料吸附陽離子染料[32]、殼聚糖磁性微球吸附結(jié)晶紫[33]和多羧酸多巴胺磁性微球吸附孔雀石綠染料[34]，這些研究結(jié)果表明，磁性納米顆粒經(jīng)過表面修飾后，表面作用位點分布不均勻，進而產(chǎn)生了多層不均勻吸附的現(xiàn)象。

2.3 多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附熱力學分析結(jié)果

通過熱力學結(jié)果分析能夠判斷吸附反應(yīng)的自發(fā)性，了解吸附過程的難易情況[35]。根據(jù)公式（10）、（11）計算標準吉布斯自由能變（ΔG°）、標準焓變（ΔH°）和標準熵變（ΔS°）。如表4所示，298 K和318 K下吸附反應(yīng)的ΔG°為正值，說明溫度較低時，吸附反應(yīng)不能自發(fā)進行，但是當溫度為338 K時ΔG°為負值，說明反應(yīng)可以自發(fā)進行。此外，吸附反應(yīng)的ΔH°大于零，再次證明吸附過程是吸熱反應(yīng)，升高溫度有利于吸附反應(yīng)的進行，這與

2.2 節(jié)中吸附等溫模型研究結(jié)果一致。而吸附反應(yīng)的ΔS°大于零，表明吸附反應(yīng)是一個熵增加過程，吸附過程中固液界面的混亂度增大。

表4 不同溫度條件下多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附熱力學和活化能參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters and activation energy for the adsorption of nisin onto IONPs@pDA

3 結(jié) 論

本實驗研究了多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附理論。吸附動力學與吸附等溫線擬合結(jié)果表明，Lagergren準二級吸附動力學模型和Freundlich吸附等溫模型能更好地描述吸附過程，說明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附主要受化學吸附控制，且吸附反應(yīng)是發(fā)生在異構(gòu)表面的多層不均勻吸附。熱力學分析結(jié)果表明多巴胺磁性納米粒子對Nisin的吸附過程是吸熱反應(yīng)，Nisin的吸附量隨著溫度的升高而增大。說明多巴胺磁性納米粒子能夠有效地吸附Nisin。本研究結(jié)果為獲得既保留Nisin抗菌活性又能夠快速磁分離防止細菌耐藥性產(chǎn)生的多巴胺磁性納米粒子-Nisin耦合體提供了理論依據(jù)。