秦軍委，雷用東，邱恒恒，郭 欣，朱新榮，張 建,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000）

我國淡水資源豐富，淡水漁業(yè)養(yǎng)殖具有得天獨厚的優(yōu)勢，目前除了養(yǎng)殖四大家魚外，冷水魚越來越受到人們的關(guān)注。高白鮭（Coregonus peled）屬于鮭科（Salmonidae）、白鮭屬（Coregonus），自然分布于高寒地區(qū)的湖泊及河流中，是典型的冷水魚[1]。高白鮭適應(yīng)性強，且肉味鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值較高，是國內(nèi)外水產(chǎn)市場深受歡迎的冷水魚品種[2-3]。但是由于魚體中肌纖維較短、水分含量較高、內(nèi)源酶活性高等特點，在加工和貯藏過程中容易發(fā)生肌肉軟化和肌原纖維蛋白降解嚴(yán)重等問題，致使魚肉品質(zhì)下降。

蛋白質(zhì)是魚類肌肉組織的主要組成成分之一，其降解、聚合和變性都會嚴(yán)重影響魚肉的品質(zhì)特性，營養(yǎng)價值和加工性能[4]。肌原纖維蛋白是肌肉中最重要的一類功能性蛋白，主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等，這類蛋白在熱誘導(dǎo)作用下可以形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予肉制品良好的感官特性和功能特性[5-6]。蛋白質(zhì)氧化是導(dǎo)致宰后魚肉品質(zhì)下降的另一重要因素，研究表明，氧化降低了肌肉的顏色、風(fēng)味和嫩度等食用品質(zhì)特性，還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)（如凝膠性和乳化性等）的改變[7-8]。目前對魚肉蛋白進(jìn)行氧化使用最多的是羥自由基氧化體系，氧化對象多為肌原纖維蛋白。前人對魚類肌原纖維蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，氧化可導(dǎo)致羰基含量和表面疏水性增加，總巰基含量、活性巰基含量、乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著下降，氧化后的肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集，生成大量高分子凝集體，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）比肌動球蛋白更容易氧化交聯(lián)[9]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化后肌原纖維蛋白的水結(jié)合能力和白度下降，且氧化可使蛋白發(fā)生聚集[10]。姜晴晴[11]和李學(xué)鵬[12]等均發(fā)現(xiàn)，氧化后MHC發(fā)生交聯(lián)聚集，產(chǎn)生了分子質(zhì)量大于200 kDa的蛋白聚集體。目前研究大多集中于氧化對肌原纖維蛋白理化特性和功能特性的影響，而關(guān)于氧化對肌原纖維蛋白降解變化以及具體蛋白如何變化的研究較少。

由于高白鮭出水即死的特點，使其只能進(jìn)行冷藏運輸和加工，另外，氧化對魚肉蛋白的影響越發(fā)突顯，因此研究高白鮭氧化后在貯藏條件下肌肉蛋白的變化很有必要。本實驗采用羥自由基氧化體系對高白鮭背肌肉氧化后進(jìn)行貯藏，并對高白鮭肌原纖維蛋白中的MHC、肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的變化進(jìn)行檢測，探究氧化后貯藏對其產(chǎn)生的影響，以期為高白鮭在加工貯藏過程中控制蛋白氧化、提升魚肉品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮高白鮭購買于新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司，體長（32±2）cm、體質(zhì)量（750±50）g，宰殺后去鱗、去頭、去尾、去皮，取其背肌肉（約1 cm×1 cm×1.5 cm）于－80 ℃冰箱備用。

鼠單克隆抗肌動蛋白（3E9） 美國Abbkine公司；鼠單克隆抗肌間線蛋白（Clone DE-U-10）、鼠單克隆抗肌鈣蛋白T（Clone JLT-12） 美國Sigma公司；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗 美國Abcam公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜 美國Millipore公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒 美國Pierce公司；酶放大化學(xué)發(fā)光免疫分析（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒 美國Thermo Scientific公司；FeCl3、H2O2、鹽酸胍、抗壞血酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)股份有限公司；XB 3200C電子天平、XB 220A分析天平 瑞士Precisa公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；Cary 50紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；電泳和印跡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 氧化系統(tǒng)的制備

氧化系統(tǒng)由FeCl3、抗壞血酸、H2O2、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）組成，包括4 組不同濃度的氧化體系：1 mmol/L H2O2+0.2 mmol/L FeCl3（組1）、5 mmol/L H2O2+0.4 mmol/L FeCl3（組2）、10 mmol/L H2O2+0.8 mmol/L FeCl3（組3）、20 mmol/L H2O2+1.0 mmol/L FeCl3（組4），每組分別在室溫下氧化0、15、30、60、90 min，通過測定每組魚肉樣品的羰基含量來確定最適氧化濃度。最適氧化濃度確定后，將高白鮭背肌肉組織隨機分成兩組，一組作為空白組，另一組置于羥自由基氧化系統(tǒng)，之后將樣品于4 ℃貯藏0、1、7、14 d并取樣，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參考Chin[13]和Jiang Xinjing[14]等的方法，取適量高白鮭背肌肉，加入10 倍體積0.3 g/100 mL NaCl溶液，均質(zhì)1 min，4 ℃下8 000×g離心10 min，棄上清液，重復(fù)操作一次，將沉淀溶于10 倍體積0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中（pH 7.0），均質(zhì)5 s，于4 ℃提取1 h以充分溶解蛋白，取蛋白溶液8 mL，加入16 mL去離子水稀釋上清液使蛋白沉淀，10 000×g、4 ℃離心5 min，棄上清液，重復(fù)兩次，沉淀用0.6 mol/L NaCl溶解，作為肌原纖維蛋白。采用BCA蛋白試劑盒測定并調(diào)整至同一質(zhì)量濃度。

1.3.3 羰基含量的測定

參照Oliver等[15]的方法并稍作修改，取1 mL 4 mg/mL的蛋白溶液于離心管中，加入1 mL 10 mmol/L DNPH，室溫下反應(yīng)1 h（每10 min漩渦振蕩一次）后加入1 mL 20%（體積分?jǐn)?shù)）TCA，4 ℃下8 000×g離心5 min，棄上清液，用1 mL乙酸乙酯：乙醇（1∶1，V/V）清洗沉淀3 次，加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，于37 ℃條件下水浴15 min使沉淀溶解，反應(yīng)液8 000×g離心3 min除去不溶物質(zhì)，所得上清液在370 nm波長處測吸光度。

1.3.4 SDS-PAGE樣品制備及分析

調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度后，按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（100 mmol/L Tris-HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% SDS、體積分?jǐn)?shù)20%甘油、體積分?jǐn)?shù)10% β-巰基乙醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%溴酚藍(lán)，pH 8.0），100 ℃水浴5 min，冷卻后放入－80 ℃冰箱備用。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）參照Laemmli[16]的方法并略作修改，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠和5%的濃縮膠檢測肌原纖維蛋白變化，上樣量10 μL，濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓160 V，SDS-PAGE完成后進(jìn)行染色、脫色、成像。

1.3.5 Western-blotting分析

參考Delbarre-Ladrat等[17]的方法并稍作修改，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和5%濃縮膠檢測肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的變化，上樣量均為10 μL，凝膠電泳時電壓與SDS-PAGE一致。

凝膠電泳后，將凝膠中相應(yīng)的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液（48 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.037% SDS、20%甲醇）中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜移到含有5%脫脂奶粉的TBST溶液（150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.05% Tween-20，pH 7.5）中，于室溫下封閉2 h。然后將PVDF膜分別與稀釋2 000 倍體積的鼠單克隆抗肌動蛋白、稀釋2 000 倍體積的鼠單克隆抗肌間線蛋白和稀釋400 倍體積的鼠單克隆抗肌鈣蛋白T在4 ℃條件下孵育2 h后，先用TBST在脫色搖床上漂洗3 次，每次10 min，再用TBS緩沖液（150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗10 min。再與稀釋5 000 倍體積的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫反應(yīng)1 h，繼續(xù)用TBST漂洗3 次，最后用ECL法顯色。

1.3.6 目標(biāo)蛋白的半定量分析

通過凝膠成像儀對凝膠或PVDF膜進(jìn)行成像，然后通過Quantity One軟件對條帶光密度值進(jìn)行半定量分析。MHC、肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T降解情況分別通過220、42、55 kDa和35 kDa處條帶灰度來表示，其降解率通過相應(yīng)降解條帶的灰度除以完整條帶的灰度表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗除SDS-PAGE和凝膠電泳外，均采用3 次平行實驗。采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's多重比較檢驗法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥自由基氧化對高白鮭肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖1 不同濃度羥自由基氧化體系對高白鮭肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of different oxidation systems on the carbonyl content of myofibrillar proteins from Coregonus peled

為了明確合適的氧化濃度，本實驗先測定了不同濃度羥自由基氧化體系中高白鮭背肌肉羰基的含量，結(jié)果如圖1所示。隨著氧化時間的延長，4 組不同濃度的氧化體系中的羰基含量顯著升高（P＜0.05），其中組1和組4在0 min時的羰基含量分別為2.93 nmol/mg和3.10 nmol/mg，在90 min時分別增長至5.90 nmol/mg和9.59 nmol/mg，分別增加了101.37%和209.35%，增長趨勢顯著（P＜0.05）。另外，在相同氧化時間內(nèi)高白鮭背肌肉羰基含量也隨著氧化濃度的升高而增加，在孵育15 min之前，不同氧化濃度組的羰基含量增長差異不明顯；但在30 min之后4 種組合的羰基含量變化差異顯著（P＜0.05）。值得注意的是，在孵育90 min時組1與組2差異顯著（P＜0.05），組2與組3差異不顯著（P＞0.05），組3與組4差異顯著（P＜0.05），這可能是因為蛋白質(zhì)的羰基主要通過羥自由基攻擊蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵、肽骨架的斷裂、還原糖反應(yīng)以及結(jié)合非蛋白羰基化合物而產(chǎn)生[18]，也可經(jīng)過分子重排直接形成；另外通過電子轉(zhuǎn)移、加成和脫氫等方式使脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)轉(zhuǎn)化成為烷氧自由基，并直接分解為羰基化合物。在長時間、高濃度氧化劑作用下會生成大量羰基基團(tuán)，加速與親核物質(zhì)（如NH2－）的反應(yīng)，最終生成席夫堿，促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚合和交聯(lián)，使得氧化后期羰基含量的增加速度逐漸減緩[19]。但氧化濃度過高或氧化時間過長，聚合蛋白質(zhì)可能進(jìn)一步發(fā)生降解和解聚，肽鍵斷裂，羰基含量會繼續(xù)增加，這可能是90 min時組4羰基含量升高的原因。

蛋白質(zhì)中羰基的產(chǎn)生是蛋白發(fā)生氧化的一個顯著性標(biāo)志，可用羰基含量衡量肉制品中蛋白氧化的程度，羰基含量越高，表明蛋白質(zhì)氧化程度越高[20]。綜上，本實驗最終采用組2氧化濃度（5 mmol/L H2O2+0.4 mmol/L FeCl3）孵育60 min的條件進(jìn)行后續(xù)實驗。采用SDS-PAGE分析各蛋白的降解變化情況，Western blotting分析肌動蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的降解變化。

2.2 肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

羥自由基氧化對高白鮭肌原纖維蛋白影響的SDS-PAGE圖譜如圖2A所示，SDS-PAGE能夠直觀地反映蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后及不同氧化條件下，蛋白亞基間發(fā)生的聚集、斷裂或降解等情況。經(jīng)過氧化且在貯藏過程中，MHC、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈都發(fā)生了不同程度的降解，并且氧化組降解程度比未氧化組高。在貯藏第14天時，氧化組的MHC降解率為46.39%，未氧化組為34.72%（圖2B），兩者差異顯著（P＜0.05）。特別的是，氧化組與未氧化組在貯藏1 d時MHC和肌動蛋白的條帶灰度比0 d深，原因可能是在0 d時肌原纖維蛋白中的肌動球蛋白沒有發(fā)生解離或者解離程度不高，分子質(zhì)量過大無法進(jìn)入泳道，貯藏1 d后，肌動球蛋白逐步解離為肌球蛋白和肌動蛋白，因此條帶灰度深。另外可以發(fā)現(xiàn)，氧化組在貯藏過程中MHC和肌動蛋白的條帶灰度比未氧化組低，這說明羥自由基氧化促進(jìn)貯藏前期蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)或聚集，促進(jìn)貯藏后期蛋白質(zhì)的降解、肽鍵斷裂及小分子化合物的降解，這可能是因為前期羥自由基影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、二硫鍵、疏水作用和靜電作用等，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，活性巰基含量減少，二聚酪氨酸含量增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集[21-22]；而后期羥自由基進(jìn)一步滲透到組織內(nèi)部，激活了鈣激活酶類、組織蛋白酶類等內(nèi)源酶，加速了蛋白的降解。

圖2 羥自由基氧化體系對高白鮭肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜（A）和MC降解率（B）的影響Fig. 2 SDS-PAGE patterns of Coregonus peled myofibrillar proteins subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of MHC (B)

2.3 羥自由基氧化對肌動蛋白的影響

圖3 羥自由基氧化對肌動蛋白降解Western blotting圖譜（A）和肌動蛋白降解率（B）的影響Fig. 3 Western blotting analysis of degradation of actin subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of actin (B)

肌動蛋白可以組裝成多種結(jié)構(gòu)并廣泛參與真核細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)，是骨骼肌中第二豐富的蛋白質(zhì)，也是肌節(jié)中細(xì)絲的主要組成成分[23]。肌動蛋白和肌球蛋白的降解能破壞肌動球蛋白的形成并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性損傷[23]。由圖3A可以看出，羥自由基氧化對肌動蛋白降解的影響不明顯，氧化組與未氧化組的條帶變化不明顯，從圖3B也可以看出，兩組中肌動蛋白的降解率無明顯差異（P＞0.05）。只有在14 d時兩組的降解率偏高，但這可能是肌動蛋白正常的降解損耗所致，貯藏前期魚肉組織內(nèi)部的內(nèi)源酶開始對肌動蛋白及其他骨架蛋白進(jìn)行分解，隨著貯藏時間的延長，組織內(nèi)部開始出現(xiàn)間隙，加速了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化，保水性開始降低，魚肉組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步松軟解體，肌動蛋白降解加速，因此貯藏后期肌動蛋白的降解率偏高。結(jié)果表明，在高白鮭背肌肉組織中肌動蛋白的自然降解占主導(dǎo)地位，羥自由基氧化對其影響作用不明顯。

2.4 羥自由基氧化對肌間線蛋白的影響

圖4 羥自由基氧化對肌間線蛋白降解Western blotting圖譜（A）和肌間線蛋白降解率（B）的影響Fig. 4 Western blotting analysis of degradation of desmin subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of desmin (B)

肌間線蛋白是細(xì)胞骨架蛋白之一，分子質(zhì)量約為53 kDa，連接于Z線與其他細(xì)胞骨架元件之間，保持肌細(xì)胞的有序性和完整性[25-26]。由圖4A可以看出，氧化組的肌間線蛋白條帶降解變化不明顯，反而未氧化組降解明顯，尤其是在貯藏后期。由圖4B可以看出，未氧化組肌間線蛋白降解率在貯藏期間均比氧化組高，且一直在增加，氧化組則增長緩慢，甚至前7 d沒有明顯增加，這表明羥自由基氧化對魚肉組織在貯藏期間肌間線蛋白的降解起到抑制作用，這一結(jié)果與薛梅等[27]研究牛肉肌原纖維蛋白降解的結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)高氧化濃度下能顯著抑制μ-鈣激活酶對肌間線蛋白的降解。李錚等[28]的研究結(jié)果表明，肌原纖維蛋白磷酸化后肌間線蛋白的降解也受到了抑制，而去磷酸化加速肌間線蛋白的降解。這些實驗結(jié)果均表明，肌間線蛋白是一類極其敏感的結(jié)構(gòu)蛋白，受到外界物質(zhì)影響后，其酶切位點發(fā)生改變，抑制了其降解，這也可能是細(xì)胞自我保護(hù)的一種機制。

2.5 羥自由基氧化對肌鈣蛋白T的影響

圖5 羥自由基氧化對肌鈣蛋白T降解Western blotting圖譜（A）和肌鈣蛋白T降解率（B）的影響Fig. 5 Western blotting analysis of degradation of troponin-T subjected to hydroxyl radical oxidation (A) and degradation efficiency of troponin-T (B)

肌鈣蛋白T分子質(zhì)量約為35 kDa，是肌鈣蛋白復(fù)合物的原肌球蛋白結(jié)合成分起連接作用，和肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白C共同參與骨骼肌收縮與舒張的調(diào)節(jié)[29]。由圖5可以看出，隨著貯藏時間的延長，氧化組與未氧化組中的肌鈣蛋白T條帶灰度均變淺，降解率增加。但在貯藏前期，兩組肌鈣蛋白T的降解率差異并不顯著（P＞0.05），而在后期氧化組中肌鈣蛋白T的降解率要顯著低于未氧化組（P＜0.05），這說明羥自由基氧化抑制了魚肉組織中的肌鈣蛋白T的降解，特別是在貯藏后期。前人研究表明，肌鈣蛋白T是μ-鈣蛋白酶的降解底物，且其在宰后易發(fā)生降解，從而改善肉的嫩度[30]。這與本研究結(jié)果有一定的差別，分析其原因可能是研究對象不同，前期研究對肌原纖維蛋白體外進(jìn)行氧化，本實驗則是對魚肉組織進(jìn)行氧化然后貯藏，體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境和各種抑制酶的存在導(dǎo)致肌鈣蛋白T前期降解緩慢，氧化組中肌鈣蛋白T降解率低于未氧化組也說明氧化對其產(chǎn)生了影響，降低了其前期的降解速率。

3 結(jié) 論

采用羥自由基氧化體系對高白鮭背肌肉進(jìn)行氧化后，其羰基含量隨著氧化時間的延長和氧化濃度的增加而升高。氧化后進(jìn)行貯藏，氧化組MHC的降解率比未氧化組高，表明氧化顯著促進(jìn)了MHC在貯藏期間的降解；兩組中肌動蛋白的差異變化不顯著，自然降解占主導(dǎo)地位；氧化組中肌間線蛋白和肌鈣蛋白T的降解率低于未氧化組，氧化抑制了肌間線蛋白和肌鈣蛋白T降解，尤其是貯藏后期，對肌間線蛋白降解的抑制效果尤為顯著。高白鮭魚肉蛋白的降解變化勢必影響其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其功能性質(zhì)，所以高白鮭在貯存及加工過程中應(yīng)該控制其氧化，減少魚肉品質(zhì)的劣變。