徐洪宇，蒯宜蘊(yùn)，詹壯壯，董娟娥*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

研究表明，機(jī)體內(nèi)不穩(wěn)定的活性氧能與生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脫氧核糖核酸及核糖核酸發(fā)生破壞性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織損傷或基因突變。而植物中含有豐富的生物活性成分（如抗壞血酸、酚酸、類黃酮、單寧酸等）可抑制體內(nèi)氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的反應(yīng)，適當(dāng)攝入水果和蔬菜可以降低因自由基引發(fā)的疾病，如心腦血管和某些類型癌癥的發(fā)病率和死亡率[1-4]。相關(guān)研究報(bào)道，水果中占較大比重的果皮，因含有豐富的酚類物質(zhì)而具有良好的抗氧化、抗炎和抑菌等活性，其活性與所含酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)，具有很高的利用價(jià)值[5-6]。

然而，酚類等活性物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在胃腸道消化過(guò)程中會(huì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，致使腸道對(duì)其吸收較差，即生物利用率低。因此，研究酚類物質(zhì)在胃腸道消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，有助于闡明酚類物質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能的作用機(jī)理。模擬消化研究中，體內(nèi)消化即動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更確切、更貼近生理，但是耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，且由于個(gè)體差異等原因會(huì)造成結(jié)果重復(fù)性較差，而體外模擬消化相較于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)具有簡(jiǎn)單、快速、成本低、重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)[7]。Burgos-Edwards等[8]對(duì)生長(zhǎng)在南美洲的一種小漿果進(jìn)行體外模擬胃腸消化研究，結(jié)果表明，胃腸消化后總酚、總黃酮含量降低約50%，而花色苷類物質(zhì)損失率達(dá)80%，在消化過(guò)程中，因酚類物質(zhì)含量的降低，導(dǎo)致其抗氧化活性降低。而蜂蜜經(jīng)體外模擬胃腸消化后，酚類物質(zhì)呈現(xiàn)出高穩(wěn)定性，因此蜂蜜中酚類物質(zhì)的生物利用率高[9]。對(duì)石榴汁經(jīng)體外模擬胃腸消化后其酚類物質(zhì)穩(wěn)定性和抗氧化活性的研究發(fā)現(xiàn)，體外模擬胃液消化后，總酚含量和總黃酮含量明顯增加，但是經(jīng)過(guò)體外模擬腸液消化后，酚類物質(zhì)的含量明顯下降[10]。

本研究以21 種果皮作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出酚類物質(zhì)含量高、抗氧化活性強(qiáng)的果皮；利用體外模擬胃腸消化，研究酚類物質(zhì)在食用過(guò)程中的穩(wěn)定性和生物利用率，運(yùn)用超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器/電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatographydiode array detector/electrospray ionization-time of fi ght-mass spectrometry，UPLC-DAD/ESI-TOF-MS）檢測(cè)模擬消化前后酚類物質(zhì)的變化，以期為功能性食品研制及綜合開(kāi)發(fā)果皮中活性物質(zhì)提供一定的理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮水果（火龍果、香蕉、橘子、香瓜、橙子、芒果、木瓜、哈密瓜、西瓜、菠蘿、檸檬、山竹、獼猴桃、桂圓、葡萄、榴蓮、菠蘿蜜、石榴、百香果、荔枝、牛油果）購(gòu)于吉林市大潤(rùn)發(fā)超市。

福林酚試劑 天津市大茂化學(xué)試劑廠；沒(méi)食子酸、鞣酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美國(guó)Sigma公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、蘆?。ㄉ噭?國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶 美國(guó)GenView公司；胰蛋白酶 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬膽酸鈉 上海如吉生物科技有限公司；MD44透析袋 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WGLL-65BE型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；FA1004A型電子天平、722S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精天電子儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；AcquityTMultra型UPLC儀（配備UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)） 美國(guó)Waters公司；Triple TOF 5600＋型飛行時(shí)間質(zhì)譜（配有電噴霧離子源） 美國(guó)AB SCIEX公司；Minispan離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；XS105分析天平瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

新鮮水果沖洗干凈，去果肉，留皮，45 ℃下烘干，粉碎，過(guò)80 目篩，收集備用。

1.3.2 果皮提取物制備

稱量烘干后的果皮粉各1.000 g，將各樣品中加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，超聲提取30 min，收集提取液。按上述步驟進(jìn)行3 次超聲提取，將提取液旋蒸濃縮，用蒸餾水定容至50 mL。

1.3.3 果皮提取物中酚類物質(zhì)含量測(cè)定

1.3.3.1 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu測(cè)定法[11]，分別取0.2 mL待測(cè)樣品溶液于試管中，加入2.5 mL 0.1 mol/L的福林-酚試劑，5 min后加入2.5 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液，水浴30 min，取出于725 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A725nm）?？瞻捉M以蒸餾水替代。每組平行測(cè)定3 次。以A725nm為縱坐標(biāo)（y1），沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y1＝2.105 0x1＋0.153 8（R2＝0.999 2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總酚含量。

1.3.3.2 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定采用許宗運(yùn)等[12]的方法，略作修改。分別吸取0.5 mL待測(cè)樣品溶液于試管中，加入2 mL蒸餾水及0.15 mL 5 g/100 mL NaNO2溶液，6 min后加入0.15 mL 10 g/100 mL Al(NO3)3溶液；6 min后再加入2 mL 1.0 mol/L NaOH溶液和0.2 mL蒸餾水，靜置15 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A510nm）?？瞻捉M以蒸餾水替代。以A510nm為縱坐標(biāo)（y2）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x2），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y2＝0.644 6x2＋0.172 6（R2＝0.999 1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Hatano等[13]的方法，取1 mL不同質(zhì)量濃度的果皮提取物，加入3 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后加入4.0 mL乙醇，室溫下避光反應(yīng)30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A517nm）?？瞻捉M以蒸餾水替代。按式（1）計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：Ac1、As1分別為空白組和不同質(zhì)量濃度樣品組的A517nm。

1.3.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參照Re等[14]的方法，略作修改。將10 mL 7 mmol/L的ABTS溶液與10 mL 2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，于室溫、陰暗條件下靜置14～16 h，使用前用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將其稀釋至734 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A734nm）為0.72～1.20，即得到ABTS工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

取不同質(zhì)量濃度的果皮提取物各1 mL，加入ABTS工作液4 mL，反應(yīng)6 min后于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A734nm）?？瞻捉M以蒸餾水替代。按式（2）計(jì)算樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

式中：Ac2、As2分別為空白組和不同質(zhì)量濃度樣品組的A734nm。

1.3.5 模擬體外消化

1.3.5.1 模擬胃液消化

采用Bouayed等[15]方法，分別于2 個(gè)100 mL具塞錐形瓶中加入25 mL 9 mg/mL NaCl溶液、6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、4 mL 4 mg/mL胃蛋白酶溶液（采用0.1 mol/L鹽酸配制），混合均勻后，調(diào)節(jié)pH值至2.0～2.5。各加入（1.000 0±0.000 2）g樣品，一份于37 ℃、100 r/min條件下水浴振蕩，分別在0、1、2、3、4 h取上清液備用分析；另一份在胃液消化1 h后繼續(xù)進(jìn)行腸液消化。

1.3.5.2 模擬腸液消化

將1.3.5.1節(jié)胃消化液繼續(xù)加入4 mL生理鹽水、1 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.5，于37 ℃、100 r/min條件下?lián)u床振蕩45 min，再加入18 mL模擬腸液（采用0.1 mol/L NaHCO3溶液配制胰液-膽汁混合液：2 mg/mL胰液、12 mg/mL膽汁），于37 ℃、100 r/min條件下?lián)u床振蕩，分別在1、2、3、4 h取上清液，備用分析。

1.3.5.3 人工腸液透析

透析袋剪取一定長(zhǎng)度后用生理鹽水將內(nèi)外清洗干凈，其中一端先用皮筋系緊，加入8 mL生理鹽水和2 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液，系緊透析袋，另一端并放入1.3.5.1節(jié)模擬胃液消化液中，于37 ℃、100 r/min條件下?lián)u床振蕩45 min，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0，透析袋外加入18 mL上述模擬腸液，于37 ℃、100 r/min條件下?lián)u床振蕩，分別于1、2、3 h取透析袋內(nèi)液體和透析袋外上清液，備用。

1.3.5.4 生物利用率測(cè)定

生物利用率是指從食物中釋放出來(lái)、在小腸壁的阻礙及選擇透過(guò)作用下，可進(jìn)入血液被人體吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)占攝入食物總量的比例。按照式（3）計(jì)算各成分的生物利用率[16]。

式中：C透析為該成分在透析袋內(nèi)的含量/（mg/g）；C非透析為該成分在透析袋內(nèi)外的總含量/（mg/g）。

1.3.6 酚類物質(zhì)分析

取10 mg樣品溶解于1 mL甲醇中，超聲10 min，10 000 r/min離心30 min，取上清液用于測(cè)試。

UPLC條件為：色譜柱：安捷倫ZORBAX-SB C18（100 mm×2.1mm，3.5 μm）；以體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，0.1%甲酸-乙腈溶液為流動(dòng)相B。線性梯度洗脫程序?yàn)椋? min，5%流動(dòng)相B；2 min，5%流動(dòng)相B；25 min，40%流動(dòng)相B；33 min，95%流動(dòng)相B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量5 μL。

MS條件為：負(fù)離子掃描模式；掃描范圍（m/z）：100～1 500；霧化氣壓力：55 psi；氣簾氣壓力：35 psi；離子源溫度：550 ℃；離子源電壓：－4 500 V。一級(jí)掃描：去簇電壓：100 V；聚焦電壓：10 V。二級(jí)掃描：使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，誘導(dǎo)碰撞解離能量分別為20、40、60 V，進(jìn)樣前采用校正液傳送系統(tǒng)做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2 mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用IBM SPSS Statistics 22軟件處理數(shù)據(jù)，并用方差分析進(jìn)行最小顯著性差異法多重差異分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 果皮提取物中酚類物質(zhì)含量分析

由圖1可知，選取的21 種果皮中總酚和總黃酮含量差異明顯?？偡雍糠秶鸀椋?.12±0.70）～（58.09±0.46）mg/g，其中石榴皮中總酚含量最高，其次是山竹皮（（52.09±1.52）mg/g），菠蘿蜜皮中總酚含量最低；總黃酮含量范圍為（1.01±0.04）～（47.50±0.39）mg/g，其中總黃酮含量最高的是石榴皮，山竹皮總黃酮含量次之，為（36.07±0.46）mg/g，含量最低的為檸檬皮。

本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的石榴皮中總酚含量與胡淳淳[17]測(cè)定的單瓣紅果石榴皮中總酚含量（58.43 mg/g）相似，同時(shí)其所測(cè)定的11 個(gè)品種的石榴果皮中總黃酮含量范圍為（4.43～9.32 mg/g），明顯低于本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的數(shù)值，說(shuō)明石榴品種和產(chǎn)地的不同，果皮中酚類物質(zhì)含量差異較大。陳海光等[18]測(cè)得山竹皮中總酚含量為20.4 mg/g，明顯低于本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的數(shù)值，產(chǎn)生明顯差異的原因可能是提取溶劑不同以及其總酚含量以鮮質(zhì)量計(jì)量。山竹皮中總黃酮含量明顯低于張澤生等[19]采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取酚類物質(zhì)所測(cè)得的總黃酮含量（80 mg/g）?？梢?jiàn)，不同的提取溶劑對(duì)酚類物質(zhì)的提取效果有明顯影響。

圖1 21 種果皮中總酚和總黃酮含量Fig. 1 Contents of total phenolic components and total flavonoids in 21 fruit peels

綜上，選取酚類物質(zhì)含量較高的石榴和山竹果皮進(jìn)行抗氧化活性分析以及后續(xù)的模擬胃腸液消化及成分鑒定。

2.2 石榴皮和山竹皮提取物的抗氧化活性

圖2 石榴皮和山竹皮提取物的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activity of pomegranate peel and mangosteen peel extracts

以BHT為對(duì)照，測(cè)定石榴皮和山竹皮提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。由圖2A可知，在5～55 μg/mL范圍內(nèi)，3 組樣品對(duì)DPPH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且清除能力為BHT＞石榴皮提取物＞山竹皮提取物。計(jì)算DPPH自由基清除率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），得到山竹皮提取物IC50為16.4 μg/mL，石榴皮提取物IC50為12.3 μg/mL。質(zhì)量濃度在15～55 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，石榴皮提取物與BHT的DPPH自由基清除能力接近。李國(guó)秀等[20]測(cè)得石榴皮多酚（1～30 mg/L）對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力，其IC50為5.33 mg/L，而陶鈺等[21]得到山竹對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為32.5 μg/L，均明顯不同于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)生差異的原因可能是本實(shí)驗(yàn)中為樣品未經(jīng)過(guò)純化的粗提物，其中含有不具有抗氧化活性的物質(zhì)。由圖2B可知，隨著質(zhì)量濃度（8～88 μg/mL）的增加，BHT、石榴皮及山竹皮提取物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力不斷增強(qiáng)，且清除能力為BHT＞石榴皮提取物＞山竹皮提取物。計(jì)算得到ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的IC50分別為：山竹皮提取物45.9 μg/mL、石榴皮提取物20.4 μg/mL，說(shuō)明石榴皮提取物中清除ABTS陽(yáng)離子自由基的活性物質(zhì)含量較高。質(zhì)量濃度在24～88 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，石榴皮提取物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率成一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，超過(guò)40 μg/mL后其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的增長(zhǎng)趨于平緩，且此時(shí)與BHT清除能力接近。

通過(guò)上述分析可知，石榴皮提取物中酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性均強(qiáng)于山竹皮提取物，因此，選取石榴皮提取物為研究體外模擬胃腸消化材料，探究其經(jīng)過(guò)模擬胃腸液消化后酚類化合物的釋放量，并通過(guò)透析袋模擬腸道的吸收作用考察其生物利用率。

2.3 模擬胃腸道消化時(shí)間對(duì)石榴皮提取物中酚類物質(zhì)釋放量的影響

圖3 模擬胃腸液消化時(shí)間對(duì)石榴皮提取物中酚類物質(zhì)釋放量的影響Fig. 3 Effect of simulated gastrointestinal digestion time on the release of phenolic compounds from pomegranate peel extract

石榴皮提取物在模擬胃液、腸液消化過(guò)程中總酚釋放量隨消化時(shí)間變化情況如圖3A、C所示。模擬胃液消化0～4 h內(nèi)，總酚釋放量呈增加趨勢(shì)。消化前3 h總酚釋放量增長(zhǎng)較緩慢，3～4 h時(shí)出現(xiàn)明顯加快，4 h時(shí)達(dá)到（12.86±0.15）mg/g，比消化0 h時(shí)增加13%。在模擬腸液消化中總酚釋放量呈先增加后減少趨勢(shì)，在2 h時(shí)達(dá)到最大釋放量（（2.54±0.02）mg/g），2 h后總酚釋放量開(kāi)始下降，在4 h時(shí)下降至（2.34±0.03）mg/g。

石榴皮提取物在模擬胃液、腸液消化中總黃酮釋放量隨消化時(shí)間變化情況如圖3B、D所示。模擬胃液消化0～4 h內(nèi)，總黃酮釋放量隨消化時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，在4 h時(shí)達(dá)到（4.48±0.04）mg/g，比消化0 h時(shí)增加10.62%。在模擬腸液消化過(guò)程中，總黃酮釋放量呈先增加后減少趨勢(shì)，在3 h時(shí)達(dá)到最大釋放量（（1.15±0.01）mg/g）。

本實(shí)驗(yàn)在模擬胃液消化過(guò)程中，石榴皮提取物中總酚、總黃酮釋放量均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，4 h時(shí)達(dá)到最大釋放量，與熊云霞[22]研究蘋(píng)果皮在模擬胃液消化中總酚和總黃酮釋放量情況一致。酚類物質(zhì)釋放量的增加，表明酸性環(huán)境破壞了酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖之間的氫鍵和疏水鍵，使酚類復(fù)合物分解，酚類物質(zhì)被釋放，同時(shí)酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下水解，酚類物質(zhì)失去束縛導(dǎo)致釋放量增加。與模擬胃液消化階段相比，石榴皮提取物中總酚、總黃酮釋放量在模擬腸液消化階段明顯降低，這與Mosele[23]、Lucas-Gonzalez[24]等研究結(jié)果一致。模擬胃液消化階段，胃液呈強(qiáng)酸性，具有較低的pH值，而模擬腸液消化階段，腸液為堿性，因自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，酚類物質(zhì)在酸性環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境中易發(fā)生聚合或降解，使其含量減少[25-27]。石榴皮提取物中總酚、總黃酮釋放量在模擬腸液消化中均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì)，但二者達(dá)到最大釋放量時(shí)間不同，總酚在2 h時(shí)達(dá)到最大釋放量，總黃酮在3 h時(shí)達(dá)到最大釋放量，這可能與腸液消化過(guò)程中所處的堿性環(huán)境或在消化酶的作用下，酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生重組或降解有關(guān)，致使總酚、總黃酮含量在不同消化時(shí)間發(fā)生變化[15-16]。

2.4 模擬胃腸液消化后石榴皮提取物中酚類物質(zhì)的生物利用率

圖4 果皮提取物中酚類物質(zhì)生物利用率Fig. 4 Bioavailability of phenolic compounds in peel extract

在體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)中，使用透析袋來(lái)模擬小腸上皮細(xì)胞對(duì)酚類物質(zhì)的吸收阻礙作用，從而得到酚類物質(zhì)的生物利用率[28]。由圖4可知，總酚、總黃酮的生物利用率均隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)總酚的生物利用率（依次為21.67%、26.77%、31.89%）均強(qiáng)于總黃酮的生物利用率（依次為4.05%、14.40%、27.98%），即透析袋內(nèi)以酚類化合物為主，可推測(cè)人體對(duì)多酚類化合物的吸收較多，但石榴皮提取物中酚類物質(zhì)的生物利用率均低于32%，可能是由于在腸道內(nèi)的弱堿性條件下酚類物質(zhì)與其他化合物聚合形成大分子物質(zhì)，難以通過(guò)透析袋而導(dǎo)致的[29]。本實(shí)驗(yàn)中消化2 h時(shí)總酚生物利用率（26.77%）比譚暢[30]報(bào)道的紫薯中總酚生物利用率（（18.42±0.33）%）高1.45 倍，而實(shí)驗(yàn)中消化2 h時(shí)總黃酮生物利用率（14.40%）與其報(bào)道的紫薯中總黃酮生物利用率（（15.00±0.21）%）相近?？梢?jiàn)體外模擬小腸吸收時(shí)，消化2 h時(shí)石榴皮與紫薯中總酚的生物利用率不同，但總黃酮的生物利用率接近。

2.5 石榴皮提取物中多酚的組成分析

利用UPLC-DAD/ESI-TOF-MS方法對(duì)模擬胃腸液消化前后石榴皮提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，由圖5和表1可知，根據(jù)所得的母離子峰、主要碎片峰的MS分析、保留時(shí)間以及參考文獻(xiàn)[31-32]，對(duì)其酚類物質(zhì)中含量較高的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定了α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸己糖苷、鞣花酸脫氧己糖苷及鞣花酸共5 種酚類化合物。化合物1（保留時(shí)間6.312 4 min）、2（保留時(shí)間7.604 5 min）的母離子[M－H]－分別為1 083.055 8、1 083.055 9，經(jīng)分析MS/MS裂解圖譜、保留時(shí)間及查閱文獻(xiàn)[33]發(fā)現(xiàn)，兩者為同分異構(gòu)體，分別為α-安石榴苷、β-安石榴苷，存在的碎片離子781.056 9（ [α-安石榴林—H]－）、781.057 3（[β-安石榴—H]－）為化合物1、2去掉一個(gè)鞣花酸的離子峰[M—H—302]－?；衔?保留時(shí)間為10.138 1 min，母離子[M—H]－為463.049 9，含有m/z為300.999 1、270.988 1等碎片峰，推測(cè)該物質(zhì)含有鞣花酸結(jié)構(gòu)，其中m/z為300.999 1的碎片峰是該物質(zhì)去掉一個(gè)六碳糖基的離子峰[M—H—162]－，因此，該化合物鑒定為鞣花酸己糖苷。化合物4的保留時(shí)間為12.338 9 min，母離子[M—H]－為447.055 1，存在碎片離子300.998 5（ [鞣花酸—H]－）、271.060 2（[鞣花酸—CO—H]－），由化合物3可知，化合物4為化合物3脫去六碳糖基上的一個(gè)氧，因此化合物4為鞣花酸脫氧己糖苷。化合物5的保留時(shí)間為12.924 4 min，母離子[M—H]－為300.998 7，含有m/z為229.013 4、185.023 2、145.028 9等碎片峰，確定該物質(zhì)為鞣花酸。

圖5 石榴皮提取物中多酚經(jīng)胃腸消化后的UPLC圖譜變化Fig. 5 UPLC chromatogram of polyphenols in pomegranate peel extract after simulated gastrointestinal digestion

表1 石榴皮提取物中多酚經(jīng)胃腸消化后的組分變化Table 1 Changes in pomegranate peel polyphenols after simulated gastrointestinal digestion

根據(jù)MS峰面積對(duì)石榴皮提取物中酚類物質(zhì)在模擬胃液、腸液消化后進(jìn)行定量分析，從而得到模擬胃腸消化中多酚類化合物含量的變化。由表1可知，與未經(jīng)消化時(shí)相比，鑒定出的5 個(gè)酚類物質(zhì)在模擬胃液消化階段，除鞣花酸的含量增加外，其余酚類物質(zhì)含量均降低，損失率大小為：鞣花酸脫氧己糖苷（60.63%）＞α-安石榴苷（20.98%）＞鞣花酸己糖苷（7.20%）＞β-安石榴苷（6.06%）。鞣花酸脫氧己糖苷的損失率了達(dá)到60.63%，而鞣花酸的損失率為－34.93%，可見(jiàn)在模擬胃液消化階段鞣花酸脫氧己糖苷中鞣花酸與脫氧己糖連接的糖苷鍵斷裂，從而使其含量明顯降低，鞣花酸含量增加，而鞣花酸等酚酸類化合物在酸性胃液中結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，其含量變化較小。相關(guān)研究報(bào)道，酸性胃液和胃蛋白酶的相互作用促進(jìn)了聚合多酚水解為單體酚類化合物，單體酚類在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[34-35]。經(jīng)過(guò)模擬腸液消化后，5 種酚類物質(zhì)的含量下降明顯，其中α-安石榴苷（損失率98.90%）和β-安石榴苷（損失率99.70%）的含量下降尤為顯著，這是因?yàn)棣?安石榴苷和β-安石榴苷中含有的酚羥基在堿性環(huán)境中反應(yīng)生成酚醛類物質(zhì)，而酚醛類物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)很容易與其他物質(zhì)相互作用被降解[29,36]。

3 結(jié) 論

在測(cè)定的21 種果皮中，石榴皮中含有豐富的酚類物質(zhì)，并具有較強(qiáng)的抗氧化活性；體外模擬胃腸消化過(guò)程中，相較于腸液消化過(guò)程的高損失率，石榴皮提取物中酚類物質(zhì)在胃液消化過(guò)程存在較穩(wěn)定；總酚的生物利用率高于總黃酮；利用UPLC-DAD/ESI-TOF-MS方法鑒定石榴皮提取物中含量較高的5 種酚類化合物（α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸己糖苷、鞣花酸脫氧己糖苷及鞣花酸）在胃腸消化過(guò)程中的變化，可知胃液消化過(guò)程中各酚類化合物損失率小，且部分酚類化合物轉(zhuǎn)化為鞣花酸，但在腸液消化階段各酚類物質(zhì)損失率均在60%以上，進(jìn)一步說(shuō)明石榴皮提取物中酚類物質(zhì)在酸性環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。