馮連榮 矯麗曼 王占斌 趙繼梅 尹 杰 宋立志 梁德軍

( 1. 遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 營(yíng)口 115213；2. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

楊樹(shù)是遼寧省平原地區(qū)的主要造林樹(shù)種[1]，近年來(lái)受異常氣候（極端干旱、寒潮等）影響，遼寧楊樹(shù)接連發(fā)生大面積災(zāi)害，其中2006年、2009年、2013年楊樹(shù)災(zāi)害發(fā)生規(guī)模較大，損失嚴(yán)重，一些含有南方型美洲黑楊基因的楊樹(shù)品種受災(zāi)較重，其中歐美楊107（Populus×euramericana cv.‘ Neva’）、 歐 美 楊 108（ P.×euramericana cv.‘Guariento’）幾乎全軍覆沒(méi)[2]。除氣候因素外，樹(shù)種抗逆性差是楊樹(shù)發(fā)生災(zāi)害的主要內(nèi)在因素，所以培育耐低溫楊樹(shù)品種、提高楊樹(shù)抗寒性是楊樹(shù)生產(chǎn)迫切需求。目前楊樹(shù)抗寒育種主要依靠人工雜交和天然雜種選育，不僅周期長(zhǎng)而且對(duì)提高植物抗寒性的作用不大。

近年來(lái)，大量的抗逆基因被分離，作為林木基因工程研究的模式植物[3]，楊樹(shù)轉(zhuǎn)抗逆基因研究取得了重大進(jìn)展，但關(guān)于抗寒方面的研究仍處于探索階段，開(kāi)展了一些導(dǎo)入單一的功能基因如擬南芥（Arabidopsis thaliana）Fe-SOD基因[4]、胡蘿卜（Daucus carota）抗凍蛋白基因[5]、毛白楊（P. tomentosa）油酸去飽和酶基因FAD基因[6]和轉(zhuǎn)錄因子基因如擬南芥CBF1（CRT/DRE binding factor） 基 因[7]、 銀 腺 楊 MBF1（multiprotein bridging factor）基因[8]的研究，這些研究均獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并在一定程度上提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。CBF（CRT/DRE binding factor）轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)受低溫誘導(dǎo)的反式作用因子[9]，屬于AP2/ERF家族，可以與COR（cold-regulated）基因啟動(dòng)子中的CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）等順式作用元件特異性結(jié)合[10]，激活低溫和脫水響應(yīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)脯氨酸、可溶性糖類(lèi)等物質(zhì)的積累[11]，從而提高植物的抗寒性。目前已經(jīng)在陸地棉（Gossypium hirsutum）[12]、哈密大棗（Zizyphus jujuba）[13]、番茄（Lycopersicon esculentum）[14]、黃瓜（Chcumis satires）[15]、 茄 子 （ Solanum melongena）[16]、 苜蓿（Medicago sativa）[17]等植物中得到了應(yīng)用。CBF轉(zhuǎn)錄因子基因在楊樹(shù)轉(zhuǎn)化上的報(bào)道還比較少，目前僅可見(jiàn)毛果楊CBF/DREB1基因家族生物信息分析[18]、胡楊CBF基因家族的鑒定及表達(dá)特性分析[19]及大青楊PuCBF轉(zhuǎn)化煙草[20]等方面的少數(shù)報(bào)道。筆者利用RT-PCR方法克隆得到山葡萄（Vitis amurensis）CBF3（VaCBF3）基因[21]并分別構(gòu)建了由組成型啟動(dòng)子CaMV 35S啟動(dòng)子和擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體[22]，確定了轉(zhuǎn)化過(guò)程中抗生素使用濃度[23]。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法建立了歐美楊111（P. euramericana ‘Bellotto’）高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，旨在為歐美楊111號(hào)抗寒育種及應(yīng)用提供參考及擴(kuò)繁材料。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 受體材料

歐美楊111 當(dāng)年生枝條采自遼寧省楊樹(shù)研究所基因庫(kù)，經(jīng)室內(nèi)消毒、外植體接種獲得無(wú)菌組培苗。組培苗培養(yǎng)于（25±1）℃條件下培養(yǎng)，光周期12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

工程菌為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumiefaciens）LBA4404，攜帶有擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子調(diào)控的VaCBF3基因植物表達(dá)載體質(zhì)粒。質(zhì)粒大小約為11.9 kb，其上攜帶卡那霉素抗性標(biāo)記基因，見(jiàn)圖1。

圖 1 質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The plasmid profile

1.1.3 培養(yǎng)基

遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基：

Ⅰ歐美楊111葉片分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；

Ⅱ歐美楊111莖段生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA 0.4 mg/L；

Ⅲ脫菌分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Kan 10 mg/L；

Ⅳ選擇生根培養(yǎng)基：1/2MS+IBA0.4 mg/L+Kan 20 mg/L+Cef 50 mg/L；

每升培養(yǎng)基中加蔗糖20 g，瓊脂6 g，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0～6.5，121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min備用。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min備用。

1.1.4 酶及生化試劑

Taq DNA Polymerase購(gòu)自Thermo公司；TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；卡那霉素購(gòu)自Sigma公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

引物序列為：

RD1 為：5′-GCAAGCTTA ACGCATGATTTGATGGAGGA-3′；

RD2 為：5′-GCTCTAGACTTTCCAATAGAAGTAATC-3′

C1 為：5′-GCGGATCTAGAATGGAATCGGAGCGT-3′；

C2 為：5′-GGCGGTACCTCAAGCTATGCATCCAAC-3′。

RD1/RD2擴(kuò)增擬南芥rd29A基因啟動(dòng)子，片段長(zhǎng)度945 bp；C1/C2擴(kuò)增山葡萄CBF3（VaCBF3）基因，片段長(zhǎng)度854 bp；RD1/C2擴(kuò)增rd29A基因啟動(dòng)子+VaCBF3基因，片段長(zhǎng)度1 799 bp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)目的基因遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得

以歐美楊111無(wú)菌組培苗葉片為外植體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[24]轉(zhuǎn)化山葡萄VaCBF3基因。選擇完全展開(kāi)、深綠色的葉片，用手術(shù)剪刀剪2～3下，剪斷主脈，葉面朝上接種至培養(yǎng)基Ⅰ上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。于超凈工作臺(tái)上，將工程菌菌液（OD600≈0.5）轉(zhuǎn)入至50 mL離心管中，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，去除上清液，將收集到的菌液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度為OD600≈0.5，然后將預(yù)培養(yǎng)的葉片放入到稀釋好的菌液中，侵染2～10 min，侵染期間不停的搖動(dòng)，使菌液與葉片充分接觸。侵染過(guò)的葉片取出后置于無(wú)菌干燥的濾紙上，吸附葉片其表面的殘余菌液，然后接種到培養(yǎng)基Ⅰ上，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)，當(dāng)葉片邊緣隱約可見(jiàn)菌斑時(shí)，共培養(yǎng)結(jié)束。將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有選擇壓的脫菌分化培養(yǎng)基Ⅲ上，25 ℃條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。如果獲得抗性不定芽，將抗性芽剪下繼代擴(kuò)繁培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)3～4周后，將抗性芽轉(zhuǎn)入相應(yīng)的附加選擇壓的分化培養(yǎng)基中令其生長(zhǎng)或誘導(dǎo)分化。將獲得的長(zhǎng)至2～3 cm的抗性芽切下，接種到選擇生根培養(yǎng)基Ⅳ中，進(jìn)行生根篩選，培養(yǎng)條件同上，2周后可長(zhǎng)出不定根。

1.2.2 不同因素對(duì)歐美楊111轉(zhuǎn)化的影響

采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。轉(zhuǎn)化基本條件為：外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d，菌液濃度為OD600=0.2，侵染時(shí)間為4 min，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d。以轉(zhuǎn)化基本條件為基礎(chǔ)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為：1、2、3、4、5 d；菌液濃度為：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5；侵染時(shí)間：2、4、6、8、10 min；共培養(yǎng)時(shí)間：1、2、3、4、5 d。每個(gè)處理侵染葉片20～31個(gè)，3次重復(fù)，使用Excel、DPS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

1.2.3 抗性植株分子檢測(cè)

采用天根快捷型植物DNA提取試劑盒提取抗性植株和對(duì)照植株葉片總DNA，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DNA于-20 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

以提取的總DNA為模板，未轉(zhuǎn)化對(duì)照植株DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照，RD1/RD2和C1/C2及RD1/C2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 2.0 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、模板 1.0 μL、Taq 酶 0.25 μL、ddH2O 加 至 25 μL。 反 應(yīng) 條 件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)歐美楊111轉(zhuǎn)化的影響

2.1.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)歐美楊111葉片分化和轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2a：隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，抗性芽率逐漸提高，預(yù)培養(yǎng)1 d時(shí)抗性芽率為0，可能是由于葉片的傷口還未來(lái)得及修復(fù)，農(nóng)桿菌的毒害作用使葉片從傷口處迅速褐化死亡。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，抗性芽率達(dá)到最高12.34%，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片邊緣細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)芽的分化，葉片切口快要愈合，創(chuàng)傷產(chǎn)生的酚類(lèi)等vir基因誘導(dǎo)物減少，不利于農(nóng)桿菌從傷口侵入，降低轉(zhuǎn)化率。因此，在進(jìn)行歐美楊111遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以3 d為宜。

2.1.2 菌液濃度

農(nóng)桿菌的濃度和侵染時(shí)間直接影響T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移幾率[23]。農(nóng)桿菌一般菌液濃度范圍是OD600=0.1～0.5。本研究將菌液濃度分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4和0.5，結(jié)果見(jiàn)圖2b：隨著菌液濃度的增加，歐美楊111葉片產(chǎn)生的抗性芽率隨之提高。當(dāng)菌液濃度為0.3～0.4時(shí)，抗性率達(dá)到較大值9.68%～11.36%，隨后又轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)，菌液濃度過(guò)高，菌體本身易相互凝結(jié)，不利于在外植體附著，從而降低轉(zhuǎn)化率，而濃度過(guò)低時(shí)不利于基因的轉(zhuǎn)入。因此，適宜于歐美楊111轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液濃度為0.3～0.4。

2.1.3 侵染時(shí)間

侵染時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率具有一定的影響。本研究將侵染時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8 min和10 min，結(jié)果表明：侵染時(shí)間在2～4 min之間時(shí)，歐美楊111葉片抗性芽得率較高，分別達(dá)到12.12%和19.05%，之后隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性芽率逐漸降低，見(jiàn)圖2c，可能是由于侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖、毒性過(guò)強(qiáng)而使外植體缺氧軟腐。因此，適宜于歐美楊111轉(zhuǎn)化的侵染時(shí)間為2～4 min。

圖 2 不同因素與歐美楊111葉片抗性芽率的關(guān)系Fig. 2 The relationship between different factors and the rate of leaves resistant bud of P. euramericana 'Bellotto'

2.1.4 共培養(yǎng)時(shí)間

農(nóng)桿菌與受傷部位共存16 h后才能誘發(fā)受體材料產(chǎn)生腫瘤，完成T-DNA完成轉(zhuǎn)移和整合[24]。因此，對(duì)歐美楊111的遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16 h。本研究將預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為1、2、3、4、5 d，分析共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)歐美楊111轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2d：隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性芽率增加，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，抗性芽率達(dá)到最大值5.26%，隨后抗性芽率降低，共培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)，抗性芽率更是降低為0。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間黑暗培養(yǎng)導(dǎo)致產(chǎn)生白化芽，白化芽轉(zhuǎn)入到選擇性培養(yǎng)基后，葉片和芽很快死亡，無(wú)法獲得抗性芽。因此，對(duì)于歐美楊111葉片的遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)時(shí)間在3 d時(shí)比較合適。

2.2 抗性植株的分子檢測(cè)

2.2.1 抗性植株總DNA提取

提取 66株抗性植株的DNA，DNA取5 μL DNA溶液混合1 μL上樣緩沖液加入到凝膠點(diǎn)樣孔，在約5 V/cm電場(chǎng)中電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，1～21號(hào)抗性植株DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖3：電泳結(jié)果顯示提取的歐美楊111總DNA質(zhì)量較好，條帶清晰，雜質(zhì)較少，雖有DNA降解，但也可以作為PCR反應(yīng)的模板。

圖 3 歐美楊111 DNA電泳Fig. 3 The DNA electrophoretogram of P. euramericana 'Bellotto'

2.2.2 抗性植株的PCR檢測(cè)

歐美楊111抗性植株葉片總DNA經(jīng)RD1/RD2、C1/C2和RD1/C2 3對(duì)引物進(jìn)行PCR測(cè)，其中有4株陽(yáng)性植株（圖4）分別擴(kuò)增出目的條帶，片段大小分別約為：950、850 bp和1 800 bp。其中的1號(hào)、2號(hào)植株P(guān)CR產(chǎn)物檢測(cè)見(jiàn)圖5，并對(duì)1號(hào)，2號(hào)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，與目的基因片段進(jìn)行序列比對(duì)（表1），片段一致性達(dá)到了99%～100%，可以初步判斷目的基因片段導(dǎo)入到受體材料中。

圖 4 轉(zhuǎn)VaCBF3基因歐美楊111抗性芽及陽(yáng)性植株Fig. 4 The resistant buds and positive plants of P. euramericana 'Bellotto' with transforming VaCBF3 gene

圖 5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)Fig. 5 Detection of PCR products

表 1 轉(zhuǎn)基因1、2號(hào)植株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Table 1 The sequencing results of PCR products in transgenic plants 1 and 2

3 結(jié)論與討論

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，是當(dāng)今楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法[25]。轉(zhuǎn)化成功與否受楊樹(shù)基因型、外植體類(lèi)型、培養(yǎng)條件、抗生素等因素影響。建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，是提高轉(zhuǎn)化效率的重要環(huán)節(jié)，除了確定受體材料對(duì)抗生素的敏感性，還需要篩選轉(zhuǎn)化過(guò)程中適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等。甄成[26]研究毛果楊（P. trichocarpa）莖段最佳侵染條件為菌液濃度OD600=0.4，侵染時(shí)間為20 min，共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，在侵染及共培養(yǎng)過(guò)程中添加80 μmol/L的乙酰丁香酮，轉(zhuǎn)化率為26.7%。朱偉康[27]確定轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊（P. nigra）遺傳轉(zhuǎn)化最佳條件為：菌液濃度OD600=0.3，侵染時(shí)間10 min，共培養(yǎng)時(shí)間2 d，轉(zhuǎn)化率為18.0%。趙芳方[28]確定毛白楊（P. tomentosa）最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系為菌液濃度OD600=1.0，侵染時(shí)間為9 min，共培養(yǎng)時(shí)間為25 h。孫偉博等[29]采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究‘南林895楊’（P. delotides×P. euramericana cv. ‘Nanlin895’）合適的遺傳轉(zhuǎn)化體系為：預(yù)培養(yǎng)3 d，菌液濃度OD600=0.8，侵染8 min，共培養(yǎng)3 d。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出歐美楊111遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d，適宜菌液濃度為OD600≈0.3～0.4之間，適宜侵染時(shí)間為2～4 min，適宜共培養(yǎng)時(shí)間為3 d，轉(zhuǎn)化效率為5.26%～19.05%。但本研究只是采用單因素梯度實(shí)驗(yàn)方法來(lái)探索預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等影響轉(zhuǎn)化效率的4個(gè)關(guān)鍵因素的最佳水平，不能確定各因素間的交互作用，還有待于進(jìn)一步的優(yōu)化。另外提高轉(zhuǎn)化效率的另一種有效手段是在農(nóng)桿菌培養(yǎng)、農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加vir基因誘導(dǎo)物，如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮等[21]，其中以乙酰丁香酮效果最佳，使用較為廣泛，使用濃度一般為20～200 μmol/L[20]，有待于在下一步優(yōu)化過(guò)程中進(jìn)行嘗試。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將山葡萄VaCBF3基因?qū)氲綒W美楊111中，獲得4株抗性植株，初步證明VaCBF3基因已經(jīng)整合到歐美楊111基因組中。下一步需要進(jìn)一步在RNA水平、蛋白水平進(jìn)行分子檢測(cè)，并進(jìn)一步驗(yàn)證VaCBF3的表達(dá)水平、表達(dá)穩(wěn)定性，同時(shí)通過(guò)測(cè)試電導(dǎo)率、丙二醛、可溶性糖等抗寒生理指標(biāo)，在生理上明確VaCBF3基因?qū)μ岣邨顦?shù)抗寒性的作用。CBF轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)冷適應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵性調(diào)控因子，CBF的發(fā)現(xiàn)為基因工程改良植物耐逆性提供了一種全新的技術(shù)途徑。在南方植物北移，換季節(jié)種植等基因改良品種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1]梁德軍. 遼寧省楊樹(shù)主要造林品種[M]. 沈陽(yáng)： 遼寧大學(xué)出版社, 2017.

[2]劉巍, 蔄勝軍, 紀(jì)純陽(yáng), 等. 遼寧省楊樹(shù)災(zāi)害發(fā)生的原因及對(duì)策 [J]. 防護(hù)林科技, 2014(6)： 70-73.

[3]丁莉萍, 王宏芝, 魏建華. 楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展及展望 [J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2016, 29(1)： 124-132.

[4]Arisi A C M, Cornic G, Jouanin L, et al. Overexpression of iron superoxide dismutase in transformed poplar modifies the regulation of photosynthesis at low CO2partial pressures or following exposure to the prooxidant herbicide methyl viologen [J]. Plant Physiology, 1998, 117(2)： 565-574.

[5]李春霞. 抗凍蛋白基因?qū)ι綏畹戎参镞z傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué), 2003.

[6]Benedict C, Skinner J S, Meng R G, et al. The CBF1-dependent low temperature signalling pathway, regulon and increase in freeze tolerance are conserved in Populus spp. [J]. Plant, Cell and Environment, 2006,29(7)： 1259-1272.

[7]周洲. 轉(zhuǎn)脂肪酸去飽和酶基因PtFAD2和PtFAD3銀腺楊84K的抗寒性研究[D]. 北京： 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院, 2007.

[8]許東. 楊樹(shù)抗寒轉(zhuǎn)錄因子PlMBF1b的克隆及功能分析[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[9]Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997, 94(3)： 1035-1040.

[10]李健, 王雅晴, 劉洋, 等. CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆和生長(zhǎng)發(fā)育中的重要功能 [J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2017,53(12)： 2045-2056.

[11]Gilmour S J, Sebolt A M, Salazar M P, et al. Overexpression of the Arabidopsis CBF3Transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation [J]. Plant Physiology, 2000,124(4)： 1854-1865.

[12]馬劉峰, 陳蕓, 任羽, 等. 棉花CBF2基因克隆和超表達(dá)CBF2棉花增強(qiáng)抗冷性 [J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2018,54(2)： 255-264.

[13]高啟明, 王斌, 賽買(mǎi)提·吐?tīng)栠d, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CBF基因轉(zhuǎn)化哈密大棗 [J]. 北方園藝, 2016(18)：94-98.

[14]王沛文, 朱文哲, 劉陽(yáng), 等. 多毛番茄冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)化番茄的研究 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,43(4)： 30-35.

[15]譚克, 趙福順, 吳慧杰, 等. 冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)入黃瓜的研究 [J]. 北方園藝, 2015(9)： 79-82.

[16]孟平紅, 萬(wàn)發(fā)香, 王永清, 等. 冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF3轉(zhuǎn)化茄子的初步研究 [J]. 中國(guó)蔬菜, 2013(10)： 36-43.

[17]徐春波, 王勇, 趙海霞, 等. 冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子AtCBF1轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(4)：168-174.

[18]丁咚, 陳亞娟, 崔進(jìn)榮, 等. 毛果楊 CBF/DREB1基因家族生物信息學(xué)分析 [J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 31(3)：457-461.

[19]賈會(huì)霞, 李建波, 孫佩, 等. 胡楊CBF基因家族的鑒定及表達(dá)特性分析 [J]. 分子植物育種, 2017, 15(2)：492-500.

[20]姜洋. 大青楊PuCBF遺傳轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)及功能驗(yàn)證[D].哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué), 2017.

[21]Wang Z B, Feng L R, Wang J J, et al. Vitis amuerensis CBF3gene isolation, sequence analysis and expression [J]. Agricultural Sciences in China, 2010,9(8)： 1127-1132.

[22]馮連榮, 王占斌, 宋立志. 2種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的VaCBF3基因植物表達(dá)載體構(gòu)建 [J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 42(5)： 559-564.

[23]馮連榮, 張興芬, 尹杰, 等. 楊樹(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素濃度的篩選 [J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,34(4)： 31-35.

[24]王關(guān)林, 方宏筠. 植物基因工程 [M]. 2 版. 北京： 科學(xué)出版社, 2002

[25]馮連榮, 宋立志, 張妍, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)楊樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素 [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 30(3)：120-126.

[26]甄成. 毛果楊組培再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué), 2016.

[27]朱偉康. 轉(zhuǎn)Bt基因歐洲黑楊組織培養(yǎng)再生體系優(yōu)化及其TA29-Barnase基因遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016

[28]趙芳方. 毛白楊再生體系的建立及Barnase基因轉(zhuǎn)化的初步研究[D]. 鄭州： 鄭州大學(xué), 2014.

[29]孫偉博, 于娟, 潘惠新, 等. ‘南林895楊’遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 [J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā), 2013, 27(6)： 85-88.