劉永源 梁東輝 林 敏 張 薇 黃曼萍 彭春麗

1 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院中醫(yī)科,廣東省廣州市 510280； 2 廣州市花都新街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心腦血管疾病是威脅人類健康的重要疾病。血脂代謝紊亂是AS形成的重要因素。研究表明血脂異常在AS早期起著重要作用，在早期及時(shí)對(duì)血脂異常人群進(jìn)行干預(yù)，有助于預(yù)防AS形成，降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。近年來對(duì)端粒酶—端粒系統(tǒng)的研究提示端粒功能失調(diào)與AS有著密切的關(guān)系，由端?？s短引起的局部內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制衰老和功能障礙在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化始動(dòng)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而在AS晚期，端粒和端粒酶可能參與斑塊中平滑肌細(xì)胞的衰老，進(jìn)而誘導(dǎo)斑塊破裂[2]。調(diào)脂方為我院中醫(yī)科梁東輝教授經(jīng)驗(yàn)方，入選為國家中醫(yī)藥管理局“十一五”重點(diǎn)?？?、重點(diǎn)病種協(xié)作組制定的高脂血癥診療方案中的調(diào)脂協(xié)定基礎(chǔ)方，臨床觀察研究顯示對(duì)血脂調(diào)節(jié)療效顯著[3]，方中的主藥主要有效成分提取物丹參總酚酸、山楂總黃酮配伍可增強(qiáng)降脂和抗氧化效應(yīng)，具有協(xié)同增效作用[4]。本研究旨在觀察調(diào)脂方對(duì)ApoE-/-小鼠血脂、炎癥因子及端粒酶—端粒系統(tǒng)的影響，探討調(diào)脂方抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和造模、分組 根據(jù)研究需要以30只雄性ApoE-/-小鼠作為研究對(duì)象，平均周齡(8.2±1.3)周，體重(200±20)g，在我院心臟中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。造模前給予小鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、中藥干預(yù)組，每組10只。另取同周齡雄性C57BL/6小鼠10只作為空白對(duì)照組。小鼠均由南京建成生物工程研究所提供，合批號(hào)：20080613。

1.2 方法

1.2.1 喂養(yǎng)方法：空白對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)；30只ApoE-/-小鼠均全程給予特制的高脂飼料(78.85% 原糧 +21% 豬油 +0.15% 膽固醇)喂養(yǎng)，共24周。模型組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養(yǎng)12周后開始灌服蒸餾水，1次/d。中藥干預(yù)組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養(yǎng)12周后開始灌服中藥調(diào)脂方，1次/d，持續(xù)時(shí)間為12周。調(diào)脂方組成：澤瀉30g、丹參15g、決明子12g、何首烏15g、郁金12g、山楂15g。給藥劑量為17.34g/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥，以上藥物由本院中藥房1次性購齊并鑒定，按水提醇沉法,制成顆粒，用蒸餾水溶解后給中藥干預(yù)組小鼠灌胃給藥。阿托伐他汀組10只ApoE-/-小鼠從高脂飼料喂養(yǎng)12周后開始以阿托伐他汀鈣8.22mg/(kg·d)灌胃給藥，1次/d，持續(xù)時(shí)間為12周。每只小鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同(飼養(yǎng)條件SPF級(jí),室溫22～24℃, 相對(duì)濕度為50%,光照時(shí)段為7:00—19:00)，均自由飲水。

1.2.2 取材：所有小鼠實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)24周達(dá)到實(shí)驗(yàn)時(shí)間后取材，取材前小鼠禁食12h，無菌條件下，將小鼠麻醉后摘眼球取血，3 000rpm離心15min 分離血清。將小鼠處死后打開腹腔和胸腔，輕輕沿主動(dòng)脈瓣至髂動(dòng)脈分支處剝離全長主動(dòng)脈，用于制備石蠟切片。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 血脂、炎癥指標(biāo)檢測：送我院檢驗(yàn)科，運(yùn)用生化儀檢測脂代謝指標(biāo)：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及炎癥指標(biāo):超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)。

1.3.2 采用進(jìn)行油紅“O”染色，觀察斑塊形成及脂質(zhì)堆積程度：實(shí)驗(yàn)?zāi)┬∈筇幩篮螅鹘M小鼠行主動(dòng)脈冷凍切片油紅“O”染色:(1)硅化載玻片粘取冷凍切片，切片干燥后入60%異丙醇浸洗10min。(2)油紅“O”工作液染色10min。(3)60%異丙醇分化3～10s至間質(zhì)清晰，水洗。(4)Mayer蘇木精復(fù)染1min，自來水返藍(lán)。(5)濾紙小心吸干水分，甘油明膠封片。依據(jù)每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片的染色結(jié)果，選擇AS斑塊面積最大的切片做病理形態(tài)學(xué)分析。

1.4 外周血白細(xì)胞端粒酶—端粒檢測

1.4.1 提取外周血白細(xì)胞RNA：嚴(yán)格按照無菌操作要求及說明書中操作步驟提取外周血白細(xì)胞RNA，采集小鼠肝素抗凝血，在其中加入等量淋巴細(xì)胞分離液混合，以2 000轉(zhuǎn)/min作離心處理，時(shí)間20min。將懸浮物去除，從中單獨(dú)將白細(xì)胞層分離出來，按照1∶3比例加入生理鹽水混勻，再次離心將上清液完全去除，采用0.01M的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在沉淀中加入1ml TRISzol。在含有1ml DEPC水的試管中加入10μl RNA，檢測波長為260mm的吸光度，計(jì)算RNA濃度。

1.4.2 提取DNA：經(jīng)TRIzol提取外周血白細(xì)胞RNA后，在剩余的界面相、酚相中提取DNA，具體操作方法為：分別在DNA所在界面相、酚相中添加300μl無水乙醇，反復(fù)離心2次，轉(zhuǎn)速、時(shí)間同上，將懸浮物取出后在沉淀中加入乙醇，以0.01M的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，放置在30℃室溫孵育。20min后干燥，處理完成后加入50μl DEPC水，溶解沉淀。DNA濃度(μg/ml)=50×A260×稀釋倍數(shù)/1 000。

1.4.3 設(shè)計(jì)引物：參考雷大洲等[5]與陳君柱等[6]研究成果，以36B4為參照基因，采用Primer 5.0進(jìn)行Foreard、Telomerase、Internal control gene端粒、端粒酶引物序列檢索。

1.4.4 PCR：參照試劑說明書配置20μl：2×SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR(熒光定量)反應(yīng)體系，參數(shù)設(shè)置：上游引物、下游引物、Cdna、dH2O 分別為1μl、1μl、2μl、6μl。根據(jù)T(定量PCR中端粒)/S (單個(gè)拷貝的基因)得出端粒長度數(shù)值，且與端粒平均長度呈正相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 血脂及炎癥指標(biāo) 與空白對(duì)照組比較，模型組血清脂代謝指標(biāo)中TG、 TC、LDL和炎癥指標(biāo)hs-CRP、IL-6均明顯升高(P<0.01)，提示造模成功。與模型組比較，阿托伐他汀組TC、LDL、HDL、hs-CRP顯著下降(P<0.01)，TG、IL-6亦下降明顯(P<0.05)；中藥干預(yù)組TG、TC、HDL、 hs-CRP、IL-6顯著下降(P<0.01)，LDL亦明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組比較，中藥干預(yù)組降低TC的作用較弱(P<0.05)，而中藥干預(yù)組在降低TG程度上優(yōu)于阿托伐他汀組(P<0.05)，在降低LDL、hs-CRP、IL-6及升高HDL上無明顯差異。見表1。

表1 各組血脂水平及炎癥指標(biāo)指

注：#P<0.01 VS空白對(duì)照組；△P<0.05、☆P<0.01 VS 模型組；▲P<0.05 VS中藥干預(yù)組。

2.2 主動(dòng)脈病理 光鏡(×250nm)下可見：本研究空白對(duì)照組中小鼠主動(dòng)脈各層排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)良好，少見皺褶、空泡，主動(dòng)脈根部內(nèi)膜有增厚現(xiàn)象，但無AS病灶，見圖1A；從圖1B可見，小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞伴有明顯異常征象，如厚度增加、血管壁周徑縮小、斷裂等，炎性病灶范圍增加，動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域脂質(zhì)呈鮮紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，間質(zhì)無色，提示存在AS病變；AS斑塊壓迫、平滑肌細(xì)胞萎縮、彈力纖維破壞，中膜逐漸變?。辉诒±w維帽之下可見大量不定形壞死崩解產(chǎn)物、呈針狀空隙的膽固醇結(jié)晶；肌層排列紊亂，血管壁變薄、層次結(jié)構(gòu)不清晰，而中藥干預(yù)組圖1C和阿托伐他汀組圖1D雖同樣存在AS斑塊，但程度較模型組明顯改善。

A B C D

圖1主動(dòng)脈病理光鏡(×250nm)圖

A.空白對(duì)照組，B.模型組，C.中藥干預(yù)組，D.阿托伐他汀組

2.3 外周血白細(xì)胞端粒長度、端粒酶活性 模型組外周血白細(xì)胞端粒長度明顯短于空白對(duì)照組、外周血白細(xì)端粒酶活性低于空白對(duì)照組(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，中藥干預(yù)組端粒酶活性、阿托伐他汀組端粒長度、端粒酶活性明顯提高(P<0.01)，中藥干預(yù)組端粒長度亦有提高(P<0.05)。與模型組比較，中藥干預(yù)組與阿托伐他汀組外周血白細(xì)胞端粒長度、端粒酶活性均明顯提高(P<0.01)，中藥干預(yù)組與阿托伐他汀組之間外周血白細(xì)端粒長度及端粒酶活性則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

3 討論

表2 各組端粒長度、端粒酶活性

注：#P<0.05、□P<0.01VS 空白對(duì)照組；☆P<0.01 VS模型組。

AS是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康。血脂代謝紊亂是AS形成的重要因素，研究表明血脂異常在AS早期起著重要作用，在早期及時(shí)對(duì)血脂異常人群進(jìn)行干預(yù)，有助于預(yù)防AS形成，降低心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。調(diào)脂方為我院中醫(yī)科梁東輝教授經(jīng)驗(yàn)方，入選為國家中醫(yī)藥管理局“十一五”重點(diǎn)?？?、重點(diǎn)病種協(xié)作組制定的高脂血癥診療方案中的調(diào)脂協(xié)定基礎(chǔ)方，臨床觀察研究顯示對(duì)血脂調(diào)節(jié)療效顯著[3]，方中主藥的主要有效成分提取物丹參總酚酸、山楂總黃酮配伍可增強(qiáng)降脂和抗氧化效應(yīng)，具有協(xié)同增效作用[4]。本研究結(jié)果表明，中藥干預(yù)組小鼠灌服調(diào)脂方后脂代謝指標(biāo)、炎癥指標(biāo)較模型組明顯改善，降脂幅度雖略低于阿托伐他汀組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在病理形態(tài)上觀察，調(diào)脂方對(duì)模型小鼠主動(dòng)脈AS病變亦較模型組明顯改善，以上結(jié)果提示調(diào)脂方具有類似于他汀類藥物調(diào)節(jié)脂代謝、炎癥指標(biāo)及干預(yù)AS病變作用。病理形態(tài)上調(diào)脂方對(duì)AS斑塊影響不及阿托伐他汀考慮與中藥起效作用較緩有關(guān)，但在調(diào)節(jié)高密度脂蛋白上，調(diào)脂方有升高高密度脂蛋白趨勢。

端粒是短的多重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列(TTAGGG)及一些結(jié)合蛋白組成特殊結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)染色體末端免于融合和退化、提供非轉(zhuǎn)錄DNA的緩沖物，在染色體定位、復(fù)制、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的特殊反轉(zhuǎn)錄酶，與真核生物細(xì)胞DNA末端的端粒合成明顯相關(guān)，正常狀態(tài)下體細(xì)胞端粒長度會(huì)隨著細(xì)胞分裂逐漸縮短，同時(shí)端粒酶活性增強(qiáng)，促使細(xì)胞增殖。近年來對(duì)端粒酶—端粒系統(tǒng)的研究提示端粒功能失調(diào)與AS有著密切的關(guān)系，另外發(fā)現(xiàn)端粒長度改變是誘發(fā)心腦血管疾病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老、障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，隨著疾病進(jìn)展，上述兩者相互作用可影響血管斑塊中平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)其加快衰老[2]。Matthews等[7]研究報(bào)道，心腦血管疾病患者病變位置平滑肌細(xì)胞端粒與正常人群相比明顯異?？s短，且端粒越短，說明動(dòng)脈粥樣病變程度越高，臨床給予他汀類藥物治療方案的出發(fā)點(diǎn)：即在于其藥理機(jī)制能夠作用于長外周血淋巴細(xì)胞端粒長度，從理論上而言具有可行性[8-9]。另外從心血管發(fā)病機(jī)制角度分析，端粒、端粒酶導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與炎性反應(yīng)是共同產(chǎn)生的，在導(dǎo)致心功能障礙的同時(shí)，還會(huì)影響白細(xì)胞在血液循環(huán)中的含量。鑒于此，臨床常采用白細(xì)胞檢測的方法對(duì)心血管疾病進(jìn)行篩查，具有方便易行、操作簡單等特點(diǎn)，可通過檢測外周血白細(xì)胞端粒長度反映疾病病變程度。多個(gè)流行病學(xué)研究探討了外周血白細(xì)胞端粒長度與動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[10]。本研究結(jié)果顯示AS模型小鼠外周血白細(xì)胞端粒長度縮短、端粒酶活性降低，提示端粒酶—端粒系統(tǒng)參與了AS過程；經(jīng)調(diào)脂方及他汀藥物治療后外周血白細(xì)胞端粒長度、端粒酶活性較模型組明顯改善，而且高于空白對(duì)照組，但AS斑塊尚未能達(dá)到空白對(duì)照組水平，考慮與AS為多因素共同作用結(jié)果有關(guān)，端粒酶—端粒系統(tǒng)在AS過程的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，方能助于心血管疾病治療和預(yù)防中提供新靶點(diǎn)。