馬艷麗，李 鈁，楊 豐

（自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361005）

白斑綜合癥病毒（WSSV）是DNA病毒，呈雙鏈環(huán)狀，在分類上屬于線性病毒科，白斑病毒屬（Whispovirus）［1］，是導(dǎo)致對(duì)蝦白斑綜合癥的元兇。該病毒具有發(fā)病快、傳播范圍廣、致死率高的特征，長期困擾著全球的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)［2-6］。目前，雖然可以通過健康的養(yǎng)殖模式與密切的病原監(jiān)測來預(yù)防WSSV的感染，但是該病毒一旦在養(yǎng)殖池暴發(fā)我們?nèi)匀皇菬o計(jì)可施。

了解病毒的感染機(jī)制是建立有效防治方法的基礎(chǔ)。DNA病毒的極早期（Immediate Early）基因是控制感染的起始以及從潛伏期轉(zhuǎn)換到增殖期的一類重要基因，這類基因可以借助宿主轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，無需利用新合成的病毒蛋白［7］。其編碼的極早期蛋白能夠通過錯(cuò)綜復(fù)雜的策略調(diào)控宿主的生理與免疫狀態(tài)，營造有利于病毒復(fù)制的環(huán)境［8-9］。因此，針對(duì)病毒極早期蛋白功能的研究對(duì)認(rèn)識(shí)病毒感染的核心機(jī)制是十分重要的。根據(jù)病毒的轉(zhuǎn)錄時(shí)相特征，WSSV基因可以分為極早期、早期和晚期基因3種基因類型［10］。到目前為止，研究人員利用基因芯片以及RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法，已從WSSV中鑒定出21個(gè)極早期基因［11-13］。

其中極早期基因WSV403編碼的蛋白是一個(gè)包含Ring-H2結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶［14］。該蛋白在E1泛素激活酶和E2泛素結(jié)合酶存在的情況下，能被聚泛素化［15］。此外，研究者發(fā)現(xiàn)WSV403基因能夠在無特異致病原的蝦中轉(zhuǎn)錄［16］，它還能與另一個(gè)潛伏相關(guān)蛋白WSV427的互作因子蛋白磷酸酶結(jié)合［16-17］，提示了WSV403與WSSV的潛伏之間存在聯(lián)系［13］。但是，WSV403如何在WSSV的感染過程中發(fā)揮作用仍然屬未知。

為進(jìn)一步了解WSV403的作用機(jī)制，本研究中我們以293T細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)，利用串聯(lián)親和純化技術(shù)和蛋白質(zhì)譜技術(shù)篩選WSV403的相互作用蛋白，進(jìn)一步對(duì)部分基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，并通過免疫共沉淀和免疫熒光分析驗(yàn)證它們之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 抗體 一抗：鼠抗FLAG單克隆抗體、兔抗HA單克隆抗體，購自Sigma公司；Western-blot二抗：山羊抗小鼠偶聯(lián)AP抗體、驢抗兔偶聯(lián)AP抗體，購自Sigma公司；免疫熒光二抗：驢抗鼠偶聯(lián)Alexa Fluor 488抗體、山羊抗兔偶聯(lián)Alexa Fluor 546抗體，購自Thermo Fisher公司。

1.1.2 質(zhì)粒 慢病毒包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pVSV-G、pRSV-REV由廈門大學(xué)韓家淮教授贈(zèng)予。載體pLL-Strep-FLAG和pCMV-HA由自然資源部第三海洋研究所李增鵬博士提供。載體pcDNA3.1-WSV403-FLAG和pcDNA3.1-WSV403H348T-FLAG由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胚腎細(xì)胞293T（HEK 293T，美國種質(zhì)保藏中心）培養(yǎng)在體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2。轉(zhuǎn)染前12 h，將細(xì)胞（約4×106cells）接種在10 cm培養(yǎng)皿中，用聚乙烯亞胺（PEI）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將10μg質(zhì)粒DNA和30 mm3濃度為50μmol/dm3PEI溶液分別用0.5 cm3Opti-MEM（Gibco公司）稀釋，室溫放置10 min。將PEI溶液加入DNA溶液中，渦旋混合，將混合物在室溫下孵育20 min，隨后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，6 h后換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 慢病毒的包裝和穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生

1.3.1 WSV403慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 本研究利用不依賴于連接酶的克隆方法（Ligation Independent Cloning，LIC）進(jìn)行基因克?。?8］。以實(shí)驗(yàn)室保存的含有WSV403基因的質(zhì)粒為模板，用WSV403-LIC-F以及WSV403-LIC-R引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在其兩端引入與載體插入位點(diǎn)兩端同源的序列；將pLL-Strep-FLAG用Bam HI和Xho I酶切。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收目的條帶與酶切載體之后，利用核酸外切酶III將WSV403基因連接到pLLStrep-FLAG載 體 上［19］，獲 得pLL-Strep-FLAGWSV403。其中WSV403與Strep以及FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)。

表1 所用引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3.2 慢病毒的包裝 本研究將慢病毒包裝質(zhì)粒（pMDLg/pRRE、pVSV-G、pRSV-REV）與pLL-Strep-FLAG-WSV403或pLL-Strep-FLAG質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染72 h后收集含有病毒的培養(yǎng)上清液，用0.45μm過濾器過濾。

1.3.3 慢病毒感染目的細(xì)胞及其與穩(wěn)定細(xì)胞系的制備 將293T細(xì)胞接種在6孔板（2×105cells/孔）中并培養(yǎng)過夜。棄原培養(yǎng)基，加入1.5 cm3完全培養(yǎng)基、0.5 cm3病毒上清液與16μg Polybrene，孵育36 h。用8μg/cm3濃度的嘌呤霉素對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選。在篩選壓力下培養(yǎng)7 d，獲得穩(wěn)定表達(dá)WSV403的293T細(xì)胞。

1.4 串聯(lián)親和純化分離多蛋白復(fù)合體以及蛋白的質(zhì)譜鑒定

用胰蛋白酶消化細(xì)胞（2×108cells），于2 300 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用pH為7.4的裂解液（30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Nonidet-P40，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）重懸，并置于冰上裂解1 h。離心去除細(xì)胞碎片，用0.45μm針頭過濾器過濾上清液。將裂解液與0.2 cm3Strep Tactin凝膠（GE Healthcare公司）在4℃下孵育4 h。然后，用pH為7.4的洗滌液（30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Nonidet-P40，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）洗3次，用體積為0.5 cm3脫硫生物素洗脫液（2 mmol/dm3脫硫生物素、30 mmol/dm3Tris-HCl、150 mmol/dm3NaCl，pH為7.4）洗脫結(jié)合的蛋白復(fù)合物。隨后向洗脫液中加入50 mm3anti-FLAG M2親和凝膠珠（Sigma公司），并在4℃孵育1 h。介質(zhì)依次用0.5 cm3洗滌液洗滌1次，用0.5 cm3TBS緩沖液（30 mmol/dm3Tris-HCl，pH為7.4，150 mmol/dm3NaCl）洗滌2次，隨后用0.1 mol/dm3，pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫蛋白復(fù)合物。所得的產(chǎn)物由上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行LC-MSMS質(zhì)譜分析。

1.5 候選蛋白的克隆

從廈門大學(xué)韓家淮教授實(shí)驗(yàn)室獲得包含目標(biāo)基因的質(zhì)粒。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），以菌液為模板PCR擴(kuò)增目的基因，在其兩端插入與載體插入位點(diǎn)兩側(cè)同源的15 bp序列。將pCMV-HA載體用Eco RI和Xho I雙酶切。用瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收目的條帶與酶切載體之后，利用核酸外切酶III將目的基因連接到pCMV-HA載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用載體引物pCMV-R（表1）與目的基因引物進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，送廈門鉑瑞生物公司測序。將驗(yàn)證無誤的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Endo-Free Plasmid Maxi Kit（OMEGA公司）純化重組質(zhì)粒。

1.6 免疫共沉淀和Western blot分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS洗滌1次，用裂解液（體積分?jǐn)?shù)為1%的Nonidet-P40，500 mmol/dm3NaCl，50 mmol/dm3Hepes-KOH，5 mmol/dm3EDTA，pH為7.8，使用前加入2 mmol/dm3PMSF、2.5 mmol/dm3DTT和1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）冰上裂解1 h，于10 200 r/min下離心10 min去除沉淀。保留50 mm3上層清液用于后續(xù)分析。剩余上清液與50 mm3的anti-FLAGM2親和凝膠珠在4℃孵育4 h。收集介質(zhì)，用預(yù)冷的洗滌液（體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Nonidet-P40，TBS緩沖液，2 mmol/dm3PMSF，2.5 mmol/dm3DTT，1 mmol/dm3蛋白酶抑制劑）洗滌4次。用1×SDS loading buffer重懸介質(zhì)，煮沸，并于10 200 r/min離心去除沉淀，獲得蛋白樣品。用SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)移了蛋白的PVDF膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶（BD公司）封閉30 min后，用相應(yīng)的一抗孵育。用TBST緩沖液（TBS緩沖液，含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween 20）洗滌3次之后，孵育AP偶聯(lián)的二抗。最后，用硝基藍(lán)四唑啉/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（NBT/BCIP，Roche公司）試劑顯色。

1.7 免疫熒光分析

細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃蓋玻片上，轉(zhuǎn)染24 h后，取出蓋玻片，細(xì)胞依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定10 min，用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Triton X-100通透1 min，隨后用PBS洗滌1次；細(xì)胞樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA封閉30 min之后，依次用相應(yīng)的一抗和二抗雜交；隨后用1μg/cm3DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚）染細(xì)胞核2 min；在洗滌封片之后，通過共聚焦顯微鏡（Leica Tcs SP5，德國徠卡公司）分析蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與討論

2.1 串聯(lián)親和純化與質(zhì)譜篩選WSV403的相互作用蛋白

研究一個(gè)蛋白的相互作用因子是了解該蛋白功能的一個(gè)重要途徑。在本研究中，我們利用串聯(lián)親和純化以及質(zhì)譜鑒定的技術(shù)對(duì)WSSV極早期蛋白WSV403相互作用因子進(jìn)行了篩選。由于缺乏WSSV宿主動(dòng)物（包括對(duì)蝦和螯蝦）的基因組以及蛋白信息，也沒有能夠高效重組表達(dá)外源基因的細(xì)胞系，本研究利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行蛋白表達(dá)和親和純化實(shí)驗(yàn)。首先將WSV403基因克隆到慢病毒表達(dá)載體中，與2個(gè)Strep以及1個(gè)FLAG標(biāo)簽融合表達(dá)；利用重組慢病毒對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行感染，進(jìn)一步利用嘌呤霉素對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)WSV403的293T細(xì)胞。我們分別將穩(wěn)定表達(dá)WSV403的293T細(xì)胞和表達(dá)空載體的細(xì)胞（陰性對(duì)照）裂解，用親和Strep以及FLAG標(biāo)簽的介質(zhì)純化裂解液中的帶有兩種標(biāo)簽的蛋白及其復(fù)合體，并進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，鑒定復(fù)合物中的蛋白。將來源于WSV403穩(wěn)定表達(dá)株的產(chǎn)物與陰性對(duì)照組比對(duì)，剔除在陰性細(xì)胞中也存在的非特異性粘附蛋白。獲得15個(gè)可能與WSV403結(jié)合的候選蛋白，其中核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KPNA6）、絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 65 kDa（PPP2RIA）、striatin（STRN）、纖維原細(xì)胞生長因子受體致癌基因伴侶（FGFRIOP）和核孔蛋白50（NUP50）等蛋白分值較高，說明它們與WSV403結(jié)合的可能性較大，因此我們將進(jìn)一步克隆這些蛋白的基因并分析它們與WSV403的相互作用。

2.2 候選相互作用蛋白的克隆

從廈門大學(xué)韓家淮教授實(shí)驗(yàn)室獲得包含KPNA6、PPP2RIA、STRN、FGFRIOP和NUP50基因cDNA的重組大腸桿菌，以菌液為模板，利用相應(yīng)的引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了上述基因的cDNA。然后利用LIC克隆法，將目的基因插入pCMV-HA載體，得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用菌落PCR鑒定含有插入片段的克?。▓D1），并進(jìn)一步測序分析。結(jié)果表明我們成功地獲得了FGFRIOP、STRN、PPP2RIA、NUP50和KPNA6基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-FGFRIOP-HA、pCMV-STRN-HA、pCMVPPP2RIA-HA、pCMV-NUP50-HA和pCMV-KPNA6-HA。在這些質(zhì)粒中，候選相互作用蛋白與HA標(biāo)簽融合表達(dá)。

圖1 目的基因重組表達(dá)質(zhì)粒的菌落PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant gene expression plasmid by colony PCR

2.3 候選蛋白與WSV403相互作用分析

為了鑒定WSV403與這些候選蛋白的相互作用，我們將候選蛋白的重組表達(dá)載體分別和pcDNA3.1-WSV403-FLAG共轉(zhuǎn)染。同時(shí)，我們也構(gòu)建了突變了Ring-H2結(jié)構(gòu)域突變體WSV403H348T，以分析這些互作與Ring-H2結(jié)構(gòu)域的關(guān)系。此外，本實(shí)驗(yàn)中我們使用單獨(dú)過表達(dá)候選蛋白的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，用anti-FLAGM2親和凝膠珠免疫沉淀FLAG-WSV403蛋白復(fù)合體，利用anti-HA及anti-FLAG抗體檢測免疫沉淀復(fù)合物中的蛋白。

結(jié)果顯示外源蛋白均可以在293T細(xì)胞中正常表達(dá)（圖2）。候選蛋白中，KPNA6（圖2a）、PPP2RIA（圖2b）和STRN（圖2c）可以與WSV403或者WSV403H348T相互作用，而NUP50（圖2d）與FGFRIOP（圖2e）均不能與WSV403或WSV403H348T相互作用。

2.4 WSV403與候選蛋白的亞細(xì)胞定位

為了進(jìn)一步證實(shí)WSV403與上述蛋白之間的相互作用，我們?cè)?93T細(xì)胞中共表達(dá)目標(biāo)蛋白和WSV403/WSV403H348T（圖3），通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)，分析兩者的亞細(xì)胞定位。

單獨(dú)過表達(dá)WSV403時(shí)，該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布（圖3a）；突變Ring-H2結(jié)構(gòu)域的突變體WSV403H348T，則均勻分布于細(xì)胞質(zhì)（圖3b）。

當(dāng)候選蛋白與WSV403或者WSV403H348T共表達(dá)時(shí)，蛋白在細(xì)胞中定位情況如圖4、5所示。當(dāng)FGFRIOP與WSV403（圖4a）共表達(dá)，兩者共定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核附近；當(dāng)FGFRIOP與WSV403H348T共表達(dá)時(shí)（圖5a），則兩者均勻分布于細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)WSV403或者WSV403H348T分別與KPNA6（圖4b、5b）和NUP50（圖4c、5c）共表達(dá)時(shí)，KPNA6和NUP50均分布于細(xì)胞核，與WSV403和WSV403H348T均不存在共定位。當(dāng)WSV403分別與PPP2RIA（圖4d）以及STRN（圖4e）共表達(dá)時(shí)，它們呈點(diǎn)狀共定位于細(xì)胞質(zhì)。而當(dāng)WSV403H348T分別與PPP2RIA（圖5d）及STRN（圖5e）共表達(dá)時(shí)，它們都均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中。

2.5 討論

泛素化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，主要表現(xiàn)在降解細(xì)胞內(nèi)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白功能［20-23］。病毒可借助泛素化過程調(diào)控宿主細(xì)胞的生理活動(dòng)，使得細(xì)胞內(nèi)環(huán)境利于病毒感染復(fù)制。WSSV的E3連接酶WSSV222參與泛素化過程和腫瘤抑制蛋白的降解，從而抑制細(xì)胞的凋亡，保障病毒復(fù)制的進(jìn)程［24］。同樣，蛋白WSV403也屬于E3連接酶。前期的工作已經(jīng)證明了它具有自泛素化的活性［16］，但是對(duì)于該蛋白作用的底物以及它在病毒感染中所扮演的角色我們?nèi)匀徊磺宄?/p>

了解一個(gè)蛋白的相互作用因子是認(rèn)識(shí)其功能的一個(gè)重要手段。本研究利用串聯(lián)親和純化以及質(zhì)譜鑒定的技術(shù)對(duì)WSSV極早期蛋白WSV403相互作用因子進(jìn)行篩選。由于缺乏WSSV宿主動(dòng)物的基因組以及蛋白信息，也沒有能夠高效重組表達(dá)外源基因的細(xì)胞系，本研究利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行蛋白表達(dá)和親和純化實(shí)驗(yàn)，獲得了15個(gè)候選蛋白。我們進(jìn)一步通過免疫共沉淀及免疫熒光對(duì)其中的5個(gè)蛋白KPNA6、PPP2RIA、STRN、FGFRIOP和NUP50與WSV403的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。證實(shí)KPNA6、STRN和PPP2RIA與WSV403存在相互作用（圖2）。當(dāng)WSV403的Ring-H2結(jié)構(gòu)域被突變之后，雖然蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生了改變，但是它們與這3個(gè)蛋白的相互作用并沒有被破壞，這說明KPNA6、STRN和PPP2RIA與WSV403的結(jié)合與該結(jié)構(gòu)域是無關(guān)的。

圖2 WSV403與重組蛋白關(guān)系的Western-blot檢測結(jié)果Fig.2 Relationship between WSV403 and recombinant protein detected by Western-blot

圖3 WSV403蛋白及其突變體的亞細(xì)胞定位免疫熒光分析結(jié)果Fig.3 Immunofluorescence analysis of WSV403 protein and its mutant subcellular localization

圖4 WSV403蛋白和重組蛋白共表達(dá)時(shí)的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization in the co-expression of WSV403 protein and recombinant protein

對(duì)其他動(dòng)物的研究表明，KPNA6能夠結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中含有核定位信號(hào)的蛋白參與蛋白的入核運(yùn)輸［25］；此外，該蛋白還可參與埃博拉病毒EBOV包涵體的形成和復(fù)制［26］。我們推測WSV403結(jié)合KPNA6以后也可能被運(yùn)輸入核內(nèi)，促進(jìn)WSSV基因組的入核，或者對(duì)宿主基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，幫助WSSV完成基因組復(fù)制。研究證實(shí)STRN是牛瘟病毒RNA聚合酶L蛋白的互作因子［27］，可能參與了該病毒的基因組復(fù)制。而且striatin家族蛋白在細(xì)胞中參與很多生理活動(dòng)如細(xì)胞運(yùn)輸、內(nèi)吞、細(xì)胞分裂。細(xì)胞表達(dá)定位分析表明STRN與WSV403在細(xì)胞質(zhì)存在點(diǎn)狀共定位（圖3e），因此我們推測WSV403結(jié)合STRN蛋白參與細(xì)胞運(yùn)輸，幫助WSSV進(jìn)入宿主細(xì)胞從而促進(jìn)病毒感染。另外，絲/蘇氨酸磷酸酶PPP2RIA，可以與striatin家族形成STRIPAK多蛋白多功能復(fù)合體［28］，在囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、抑制凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。這些研究表明WSV403與PPP2RIA相互作用很可能是將其泛素化，通過改變細(xì)胞磷酸化水平，調(diào)控WSSV的復(fù)制周期，以及抑制宿主細(xì)胞的凋亡為病毒復(fù)制創(chuàng)造條件。

3 結(jié)論

本研究利用串聯(lián)親和純化與質(zhì)譜技術(shù)篩選WSSV極早期蛋白WSV403的相互作用因子，通過免疫共沉淀和免疫熒光分析證明了WSV403與KPNA6、STRN和PPP2RIA存在相互作用，為深入研究WSV403的功能及其在病毒感染過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。在接下來的工作中，我們將克隆蝦的同源基因并進(jìn)一步分析WSV403與它們的相互作用，以及這種相互作用對(duì)病毒感染的重要性。