孫藝航，羅寧，葛金文

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208)

在不同病理?xiàng)l件下生物體會(huì)發(fā)生一系列改變，細(xì)胞通過(guò)感知外界變化整合、傳輸信息并做出相應(yīng)調(diào)整，這種動(dòng)態(tài)變化由多種復(fù)雜機(jī)制(包括翻譯后蛋白質(zhì)修飾)共同參與，可動(dòng)態(tài)的規(guī)劃蛋白的特性和功能，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡[1]。翻譯后蛋白質(zhì)修飾的種類較多，包括小的化學(xué)基團(tuán)修飾(如氨基酸側(cè)鏈磷酸化、乙?；蚣谆?和小蛋白質(zhì)修飾，其中對(duì)泛素激活的研究最廣泛，泛素激活通過(guò)3種酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白共價(jià)結(jié)合影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定、定位和相互作用[2-3]。泛素化對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的影響至關(guān)重要，據(jù)估計(jì)，細(xì)胞中任何時(shí)間的蛋白質(zhì)泛素化均超過(guò)5 000種，約占已編碼人類蛋白質(zhì)組的25%[4]；此外，泛素化還參與了多種細(xì)胞程序，包括細(xì)胞周期控制、免疫反應(yīng)、炎癥以及凋亡[5]。

缺血性卒中后，缺血區(qū)及其周圍未壞死區(qū)域的神經(jīng)元會(huì)立即發(fā)生泛素化反應(yīng)，并可在其中檢測(cè)到泛素蛋白結(jié)合物，研究表明，泛素化蛋白結(jié)合物水平的增加在神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮了重要作用[6]。但目前缺血性卒中后蛋白泛素化升高與神經(jīng)元損傷之間的關(guān)系仍不清楚。現(xiàn)對(duì)泛素化的調(diào)控過(guò)程、神經(jīng)元內(nèi)泛素化修飾以及缺血性卒中后泛素化與神經(jīng)元的潛在聯(lián)系予以綜述。

1 泛素化的調(diào)控過(guò)程

1.1泛素標(biāo)記底物蛋白 幾乎所有泛素與底物蛋白結(jié)合都需要泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的連續(xù)作用。目前只鑒定出泛素活化酶1和泛素活化酶6兩種哺乳動(dòng)物泛素活化酶，它們可特異性地激活人體內(nèi)泛素[7]；泛素活化酶E1的作用呈ATP依賴性，泛素活化酶E1催化泛素C端甘氨酸殘基發(fā)生腺苷化，隨后將其轉(zhuǎn)移到泛素活化酶E1活性中心的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，并形成硫酯鍵[8]。有報(bào)道，已鑒定出哺乳動(dòng)物細(xì)胞中超過(guò)30種泛素結(jié)合酶E2[9]，當(dāng)泛素結(jié)合酶E2與泛素活化酶E1反應(yīng)后，泛素結(jié)合酶E2的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域攻擊泛素活化酶E1與泛素間的硫酯鍵，使其形成新的泛素結(jié)合酶E2與泛素間的硫酯鍵[10]。此時(shí)，泛素連接酶E3與底物蛋白連接，并作為支架協(xié)助泛素結(jié)合酶E2與泛素間硫酯鍵接近底物，從而使泛素與底物形成蛋白共價(jià)結(jié)合。目前對(duì)泛素連接酶E3的研究較廣泛，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)600多種泛素連接酶E3，其與泛素結(jié)合酶E2以約25 000種方式配對(duì)，以保證泛素與底物蛋白的識(shí)別具有特異性[7]。

1.2泛素修飾底物蛋白 泛素修飾底物蛋白的方式很多，如單泛素化、多位點(diǎn)單泛素化、形成泛素鏈。泛素包含1個(gè)N端甲硫氨酸殘基(M1)和7個(gè)內(nèi)部的賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)[5]。根據(jù)不同連接方式，可將泛素鏈分為同源多聚泛素鏈和異源多聚泛素鏈；同源多聚泛素鏈的形成是泛素分子內(nèi)部的賴氨酸殘基依次相互連接；而異源多聚泛素鏈中包含超過(guò)兩種及以上的連接方式[4]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多聚泛素鏈還可以被甲基化、泛素樣物質(zhì)、磷酸化等修飾[11]。不同泛素結(jié)合域可以多樣的泛素修飾方式與目標(biāo)蛋白結(jié)合，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮不同調(diào)控作用，可見(jiàn)泛素鏈的功能與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[2]。K48鏈?zhǔn)悄壳把芯孔顝V泛的泛素鏈，占泛素修飾50%，始終被蛋白酶體識(shí)別并作為降解信號(hào)[7]；K63鏈和M1鏈主要構(gòu)建和拆卸信號(hào)復(fù)合物，參與信號(hào)免疫和核因子κB通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而單泛素化和多位點(diǎn)單泛素化是完全不同的修飾方式[12]。由此可見(jiàn)，區(qū)分不同泛素鏈連接的泛素連接酶E3對(duì)于判斷其參與的下游通路及其介導(dǎo)的反應(yīng)至關(guān)重要。

1.3泛素化蛋白的降解和去泛素化 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以清除錯(cuò)誤折疊和損傷的蛋白，目前預(yù)測(cè)超過(guò)50%被標(biāo)記的泛素化蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑被降解。26S蛋白酶體由一個(gè)具有蛋白水解功能的20S核心顆粒組成，呈筒狀結(jié)構(gòu)，是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)降解的超大分子機(jī)器[11]。20S顆粒的一端或兩端包裹19S/PA700調(diào)節(jié)激活復(fù)合物，對(duì)進(jìn)入20S核心顆粒的通路進(jìn)行特異性調(diào)控，該復(fù)合物通過(guò)與泛素鏈結(jié)合，發(fā)生去泛素化、去折疊成線性多肽鏈后，進(jìn)入20S核心顆粒，因此蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白的降解具有特異性[7，13]。

泛素化是一種可逆性修飾，去泛素化是泛素化的逆過(guò)程，由去泛素酶完成。去泛素酶通過(guò)水解泛素C端與底物蛋白之間的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，防止泛素進(jìn)入蛋白酶體而被降解，維持游離泛素的水平[14]。泛素酶種類繁多，目前人類基因組編碼發(fā)現(xiàn)了100多種去泛素酶，它們參與調(diào)控神經(jīng)退行性疾病、免疫、炎癥和腫瘤等疾病的發(fā)生與進(jìn)展[4]。根據(jù)酶的活性中心將泛素酶分為泛素特異性蛋白酶家族、泛素C端水解酶家族、 Machado-Josephin結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶家族和MPN(+)/JAMM蛋白酶家族五大類，前四類被統(tǒng)稱為半胱氨酸蛋白酶，MPN(+)/JAMM蛋白酶家族屬于金屬蛋白酶[7]。泛素化和去泛素化相互協(xié)調(diào)，在維持細(xì)胞內(nèi)泛素水平、信號(hào)傳遞以及精確調(diào)控蛋白質(zhì)泛素化類型和程度過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

2 缺血性卒中后的泛素化修飾

2.1泛素化修飾在神經(jīng)元內(nèi)的作用 泛素化修飾對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程非常重要。首先，神經(jīng)元細(xì)胞體生成泛素后，轉(zhuǎn)運(yùn)至軸突和樹(shù)突等遠(yuǎn)處突起，但運(yùn)輸速度非常緩慢，在不同神經(jīng)中可能需要數(shù)天甚至數(shù)周；而氧化應(yīng)激反應(yīng)伴隨泛素升高的運(yùn)輸速度緩慢可能使遠(yuǎn)端軸突和樹(shù)突易受到缺血性卒中后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[15]。神經(jīng)元中泛素活化酶E1或蛋白酶體亞基的功能缺失等突變會(huì)阻礙軸突修剪，提示泛素化修飾可能對(duì)某些軸突修剪的發(fā)育過(guò)程中起作用[16]。其次，神經(jīng)元活動(dòng)的增加和減少與樹(shù)突棘中泛素化蛋白的數(shù)量有關(guān)，許多參與突觸功能的關(guān)鍵分子受泛素化調(diào)控，包括許多突觸后密度的結(jié)構(gòu)成分和受體[17-18]。蛋白酶體途徑是神經(jīng)元清除異常蛋白的主要機(jī)制之一，如果蛋白酶體途徑不能持續(xù)有效的發(fā)揮作用，神經(jīng)元內(nèi)毒性的積累可能會(huì)威脅神經(jīng)元的生存[19-20]。

泛素可作為神經(jīng)元內(nèi)游離單體結(jié)合底物而被降解，雖然去泛素酶可以使泛素循環(huán)使用，但體內(nèi)泛素仍被蛋白酶體持續(xù)破壞。泛素C端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1，UCHL1)在神經(jīng)元內(nèi)高度表達(dá)，與泛素的親和力很高，對(duì)維持神經(jīng)元內(nèi)的泛素水平起重要作用[21]。研究表明，UCHL1基因突變小鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生改變，且泛素水平降低，提示UCHL1可防止泛素降解[22]，但具體機(jī)制尚不明確。

泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一種與蛋白酶體動(dòng)態(tài)結(jié)合的去泛素酶，剪切蛋白質(zhì)底物上的泛素鏈，避免了被蛋白酶體識(shí)別降解而穩(wěn)定泛素水平，屬于泛素特異性蛋白酶家族[23]。USP14的功能受到蛋白酶體的嚴(yán)格調(diào)控，USP14與蛋白酶體結(jié)合會(huì)刺激USP14的泛素水解酶活性[24]。研究證實(shí)，通過(guò)控制USP14與蛋白酶體的結(jié)合，細(xì)胞能將USP14的作用限制在與蛋白酶體結(jié)合的底物上；USP14的缺失導(dǎo)致蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白的作用增強(qiáng)[25]。USP14對(duì)于神經(jīng)元內(nèi)的泛素穩(wěn)定同樣重要，對(duì)共濟(jì)失調(diào)小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，USP14缺乏小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)肌肉連接處的突觸發(fā)育和功能障礙以及神經(jīng)末梢腫脹[26]。

2.2缺血性卒中后的泛素化及蛋白酶體改變 缺血性卒中可誘導(dǎo)不同類型的泛素修飾，目前，K6、K11、K48和K63泛素鏈均在全腦缺血中被發(fā)現(xiàn)[27]；K48和K63鏈在局灶性腦缺血后被發(fā)現(xiàn)[28]，可見(jiàn)，不同泛素鏈對(duì)于區(qū)分不同下游通路介導(dǎo)的底物蛋白十分重要。

缺血性卒中對(duì)相應(yīng)腦區(qū)細(xì)胞的影響較大，再灌注損傷也是引起泛素聚集的關(guān)鍵因素之一[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦海馬區(qū)局灶性腦缺血后的泛素免疫活性升高，出現(xiàn)大量泛素蛋白結(jié)合物[26]；電鏡下，短暫性腦缺血引起海馬神經(jīng)元的泛素嚴(yán)重聚集，腦缺血4 h后神經(jīng)元內(nèi)泛素聚集，并在缺血再灌注24 h和48 h的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)泛素逐漸積累；再灌注4 h時(shí)，泛素聚集部位主要集中在胞體、樹(shù)突和核膜的胞內(nèi)小泡；再灌注24 h時(shí)，神經(jīng)元的線粒體、高爾基體和樹(shù)突質(zhì)膜也出現(xiàn)了泛素聚集[31]。因此，缺血后的海馬神經(jīng)元胞體和胞突都受到應(yīng)激后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷，故神經(jīng)元被認(rèn)為是缺血后泛素化增加的主要場(chǎng)所[32]。此外，缺血性卒中后還可降低蛋白酶體活性，對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血模型的研究顯示，腦缺血后最初數(shù)小時(shí)內(nèi)的廣泛蛋白酶體抑制具有神經(jīng)保護(hù)作用；但是缺血后期蛋白酶體的活性下降，不能及時(shí)清除被泛素標(biāo)記的蛋白，故引起泛素化蛋白的沉積，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)泛素結(jié)合物水平升高，游離泛素減少，提示可能存在泛素功能障礙和繼發(fā)于缺血性損傷蛋白的錯(cuò)誤折疊[33-34]。

2.3泛素連接酶E3介導(dǎo)的缺血性卒中后神經(jīng)元保護(hù) 一些特定的泛素連接酶活性和水平的增加與腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)有關(guān)。熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白作為具有泛素連接酶活性的蛋白質(zhì)，在腦內(nèi)高表達(dá)，是蛋白質(zhì)穩(wěn)定機(jī)制的主要組成部分，通過(guò)熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白在C端U-box功能域的泛素連接酶活性防止氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠全腦缺血后海馬腦片和體內(nèi)過(guò)表達(dá)的神經(jīng)元死亡；而熱激蛋白70羧基端反應(yīng)蛋白過(guò)表達(dá)可阻止神經(jīng)元死亡，阻斷激活蛋白激酶B和真核細(xì)胞起始因子-2α的磷酸化，并阻止腦缺血及再灌注后泛素化蛋白比例的降低[35-37]。

神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育下調(diào)蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，Nedd4)蛋白家族屬于E3泛素連接酶，包括Nedd4-1/2、Itch等；Nedd4家族相互作用蛋白1(Nedd4 family-interacting protein 1，Ndfip1)是Nedd4家族E3的銜接蛋白，可與Nedd4蛋白家族特異性結(jié)合，參與泛素化過(guò)程[38-39]。研究顯示，大腦中動(dòng)脈短暫缺血后，皮質(zhì)中Nedd4-2、Itch和Ndfip1顯著上調(diào)；而在存活的皮質(zhì)神經(jīng)元中，只有Nedd4-2與Ndfip1上調(diào)，而非Nedd4-1或Itch，提示Nedd4家族蛋白對(duì)缺血的調(diào)節(jié)呈特異性和差異性。Ndfip1和Nedd4-2在大腦缺血后皮質(zhì)區(qū)存活神經(jīng)元中的共定位和相互作用表明，Ndfip1可能通過(guò)促進(jìn)Nedd4-2介導(dǎo)的泛素化降解毒性蛋白，從而改善皮質(zhì)神經(jīng)元的存活[40]。Ndfip1敲除小鼠單側(cè)腦缺血后的梗死面積更大，提示Ndfip1對(duì)腦缺血后神經(jīng)元具有保護(hù)作用[41]。

帕金蛋白在體內(nèi)廣泛表達(dá)，在神經(jīng)元中發(fā)揮著多種作用，它的基因突變和缺失是帕金森病最常見(jiàn)的原因，帕金蛋白的N端為類泛素結(jié)構(gòu)區(qū)，具有E3泛素連接酶活性[42]。動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是帕金蛋白的底物蛋白，主要作用于線粒體的分離，同時(shí)可以控制神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移和神經(jīng)元分化[43-44]。線粒體功能障礙是造成缺血性卒中神經(jīng)元損傷以及缺血再灌注損傷的主要原因之一。研究表明，對(duì)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行氧葡萄糖剝奪以及氧葡萄糖剝奪再灌注損傷后，出現(xiàn)線粒體斷裂，Drp1蛋白表達(dá)增加，帕金蛋白表達(dá)降低，提示帕金蛋白通過(guò)泛素化介導(dǎo)的Drp1缺失對(duì)氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體損傷和凋亡具有保護(hù)作用[45-46]。

線粒體E3泛素連接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1，Mul1)是一種多功能線粒體膜蛋白，它的泛素連接酶結(jié)構(gòu)域可以泛素化多種信號(hào)分子，如Drp1和線粒體融合蛋白2、激活蛋白激酶B等[47]；在腦缺血大鼠模型中，Mul1上調(diào)；而抑制Mul1表達(dá)后，大鼠大腦梗死面積明顯減少，且Drp1和線粒體融合蛋白2的泛素化受到抑制?？梢?jiàn)，Mul1通過(guò)恢復(fù)線粒體功能達(dá)到了保護(hù)神經(jīng)元的作用[30]。綜上所述，缺血后泛素水平的升高可能由泛素結(jié)合機(jī)制成分的上調(diào)引起，而泛素結(jié)合機(jī)制的識(shí)別至今仍未知。

2.4缺血性卒中后小類泛素修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)介導(dǎo)泛素化修飾 SUMO屬于泛素樣蛋白家族成員，擁有與泛素類似的空間三維分子結(jié)構(gòu)域，在泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的連續(xù)作用下，通過(guò)C端甘氨酸殘基結(jié)合底物蛋白，參與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾[48]。與泛素過(guò)程不同，SUMO不直接作用于蛋白質(zhì)降解，通常通過(guò)加強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保護(hù)目標(biāo)蛋白[49]。目前，人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的SUMO有SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4，SUMO2和SUMO3的N端三個(gè)氨基酸不同，但功能無(wú)差異，故被認(rèn)為是相同的物質(zhì)，稱為SUMO2/3；而SUMO1和SUMO2/3有50%的相同之處[50]。受到缺血、低氧、氧化應(yīng)激等刺激誘導(dǎo)后，SUMO2/3結(jié)合蛋白的能力顯著升高[27]。大鼠腦缺血后6 h和24 h，皮質(zhì)和海馬梗死區(qū)的SUMO-2/3表達(dá)增加，而抑制SUMO-2/3表達(dá)后，類缺血等條件下的神經(jīng)元耐受力在短時(shí)間內(nèi)降低，提示短暫腦缺血后會(huì)激活SUMO-2/3結(jié)合蛋白的能力，故認(rèn)為SUMO是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)途徑的關(guān)鍵因子，SUMO-2/3是一類作用肯定的神經(jīng)元保護(hù)性小分子蛋白物質(zhì)[51-52]。

缺血性卒中后的SUMO與泛素亦相關(guān)，SUMO與泛素會(huì)在缺血后大腦的同一區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)，且泛素存在于SUMO2/3免疫沉淀物中；抑制泛素蛋白酶體可導(dǎo)致SUMO2/3結(jié)合物積累；SUMO本身可以泛素化，SUMO的E3連接酶可以調(diào)節(jié)泛素的結(jié)合水平，SUMO和泛素可以競(jìng)爭(zhēng)相同的賴氨酸殘基[53]。體外實(shí)驗(yàn)證明，在氧葡萄糖剝奪細(xì)胞內(nèi)，SUMO-2/3是誘導(dǎo)蛋白泛素化的必需分子，提示缺血性卒中后SUMO是對(duì)泛素保護(hù)作用的延伸；泛素和SUMO可能協(xié)同作用，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血損傷[54]。

3 小 結(jié)

泛素化可調(diào)控神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育和功能活動(dòng)，缺血性卒中后的缺血損傷及蛋白酶體功能的抑制與神經(jīng)元內(nèi)泛素水平的升高相關(guān)，部分泛素連接酶E3對(duì)腦缺血后神經(jīng)元起保護(hù)作用。泛素的復(fù)雜性限制了人們對(duì)其他去泛素酶和泛素連接酶E3在缺血性卒中中作用的認(rèn)識(shí)，對(duì)于缺血性卒中與泛素關(guān)聯(lián)靶蛋白數(shù)量的了解有助于對(duì)泛素化的進(jìn)一步探索。由于SUMO對(duì)缺血性卒中的神經(jīng)元和泛素具有保護(hù)作用，因此，誘導(dǎo)SUMO表達(dá)可能成為缺血后神經(jīng)元存活的藥物靶點(diǎn)。雖然目前已有針對(duì)泛素連接酶E3的靶向藥物，但由于缺乏泛素和缺血性卒中關(guān)系的直接證據(jù)，導(dǎo)致無(wú)法預(yù)測(cè)藥物干預(yù)的走向，因此需要對(duì)泛素與缺血的相互聯(lián)系進(jìn)行深入研究。