賀茂芳，張 博，苗延青，王春陽，韓 祿

（1．西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，西安醫(yī)學(xué)院藥物研究所，陜西西安710021；2．西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西西安710021）

糖蛋白／糖肽的分離純化和鑒定在疾病診斷及糖蛋白組學(xué)研究方面具有重要意義。然而，生物體內(nèi)糖蛋白的豐度較低且基體復(fù)雜，鑒定難度較大［1－4］。目前，對糖蛋白的分離富集主要有酰肼化學(xué)法［5］、凝集素親和色譜法［6］、親水色譜法［7］和硼酸親和法［8－10］等?；谂鹩H和磁性吸附劑的磁性分散固相萃取具有選擇性好、條件溫和、操作簡便等優(yōu)點，成為糖蛋白分離純化的常用方法。但由于基體材料表面的活性基團(tuán)密度低，使直接鍵合的硼酸功能團(tuán)數(shù)目較少，因此傳統(tǒng)硼親和吸附劑實際應(yīng)用價值有限［11］。表面引發(fā)－原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（SI－ATRP）因具有活性可控的優(yōu)點，已經(jīng)成為材料表面構(gòu)建三維聚合物的常用方法［12］。目前，基于SI－ATRP制備的硼親和材料有硅膠［13］、石墨烯［14－15］和整體柱［16］等。例如，Ye等［17］通過SI－ATRP將聚3－（2－疊氮基－乙酰氨基）苯基硼酸接枝在硅膠表面，詳細(xì)研究了其熒光響應(yīng)，但并未關(guān)注材料的吸附容量。Wang等［13］和Li等［18］采用SI－ATRP技術(shù)制備了苯硼酸功能化硅膠吸附劑并用于鄰羥基生物分子的分離富集，雖然獲得了較高的吸附容量，但是高速離心過程導(dǎo)致樣品損失，并且操作繁瑣，不利于快速、高效地樣品前處理。

近年來，磁性納米材料因具有制備簡單、生物相容性好、非特異性吸附小等優(yōu)點而被廣泛用于生物樣品的前處理［19－21］。本研究以Fe3O4＠SiO2磁性納米粒子為基體，采用SI－ATRP技術(shù)，將3－丙烯?；脚鹚幔ˋAPBA）原位聚合在磁性納米粒子表面，制備了一種含有苯硼酸聚合物鏈的硼親和磁性納米吸附劑（Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA）。將該吸附劑用于對糖蛋白的分離純化，不僅具有較高的吸附容量和選擇性，而且有效地提高了樣品前處理效率，具有實際應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1．1 儀器及試劑

Cary 60紫外－可見分光光度計（美國，安捷倫）；H600透射電鏡（日本，日立）；STA600熱分析儀（美國，Perkin－Elmer儀器公司）；TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀（德國，布魯克）；TS－211BQ恒溫振蕩器（上海島析實業(yè)有限公司）；SB－5200DT超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

分析純的FeCl3、正硅酸乙酯、2，2－聯(lián)吡啶（bpy）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3－氨基苯硼酸（99%）、丙烯酰氯（98%）、4－（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷（4－CPTS）（99%）購自上海純晶實業(yè)有限公司；卵清蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶（HRP）、牛血清蛋白（BSA）、β－酪蛋白（β－casein）、溶菌酶（Lys），純度均大于98%，購自美國Sigma－Aldrich公司。水為二次蒸餾水。

1．2 Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的制備

（1）Fe3O4＠SiO2參照文獻(xiàn)報道［22］按以下方法制備。Fe3O4的制備：1．3g FeCl3，0．4g檸檬酸酸鈉，2．0g無水NaAc溶于30mL乙二醇中，攪拌30min后，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，200℃反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，磁分離傾去上層溶液，所得產(chǎn)物用水、乙醇依次洗滌，即得Fe3O4磁性納米粒子。SiO2的包覆：0．5g Fe3O4依次用45mL 0．1mol·L－1HCl洗滌5min，90mL水洗滌10min后，分散于45mL 20%檸檬酸酸鈉溶液中靜置2h，隨后將Fe3O4微球超聲分散于720mL乙醇－水（576∶144，V／V）中，依次向其中加入15mL氨水、1．2mL正硅酸乙酯，攪拌下反應(yīng)12h，磁分離傾去上層溶液，所得產(chǎn)物用水、乙醇依次洗滌，即得Fe3O4＠SiO2。

（2）AAPBA的制備參照文獻(xiàn)方法［23］。具體過程如下：5．0g（36．5mmol）3－氨基苯硼酸溶于0℃的73 mL的2mol·L－1NaOH溶液中；在冰浴、攪拌下向其中緩慢滴加5．9mL（73mmol）丙烯酰氯，在室溫下攪拌反應(yīng)2h后，再向其中緩慢滴加1mol·L－1HCl直至溶液的pH為1，此時會析出白色固體；過濾后用冷水多次洗滌固體并向濾液中加入NaCl直至飽和；用乙酸乙酯分3次萃取濾液（60mL×3），合并有機相、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到白色固體，與上述白色析出物合并后，用60℃的水重結(jié)晶并用冷水沖洗產(chǎn)物，即得到灰色針狀晶體AAPBA。

（3）采用SI－ATRP法制備Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA。具體過程如下：首先將0．5g Fe3O4＠SiO2分散于50mL干燥甲苯中，向其中加入0．5mL 4－CPTS，110℃反應(yīng)8h，得到固體引發(fā)劑Fe3O4＠SiO2＠Cl；然后進(jìn)行SI－ATRP反應(yīng)：0．5g Fe3O4＠SiO2＠Cl超聲分散于20mL DMF中，并向其中加入0．8g AAPBA，0．2g bpy，體系經(jīng)過冷凍－抽真空－解凍循環(huán)3次后，在 N2保護(hù)下迅速加入0．1g CuBr，于95℃反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，用甲醇和水依次洗滌粒子，再用20%EDTA－2Na溶液浸泡4h以上以除去殘余的Cu2＋，最后用水洗滌，40℃真空干燥，即得到Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA。

1．3 吸附容量的測定

用靜態(tài)吸附法測定了Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對蛋白質(zhì)的吸附容量。將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品配制于50mmol·L－1NH3－NH4Cl緩沖溶液（pH＝8．5）中，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱量5．0mg吸附劑分散于2．0mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中，置于恒溫振蕩器中，于25℃、150r·min－1振蕩30min后，用磁鐵分離，用紫外分光光度計，在280nm波長處測定吸附后蛋白質(zhì)溶液的平衡濃度。計算吸附劑對蛋白質(zhì)的吸附量（Q）：Q ＝ （c0－ce）×V0／m 。其中，c0和ce（mg·mL－1）分別是蛋白質(zhì)溶液的初始濃度和吸附后的平衡濃度，V0（mL）是蛋白質(zhì)溶液的體積，m（mg）是吸附劑的質(zhì)量。

1．4 吸附動力學(xué)

以O(shè)VA、HRP為模型蛋白，通過靜態(tài)吸附法研究了吸附容量隨吸附時間的變化。準(zhǔn)確稱量磁性納米吸附劑5．0mg，分散于2．0mL 0．5mg·mL－1的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中，置于恒溫振蕩器上，設(shè)定振蕩時間分別為5、10、20、30、60min。振蕩結(jié)束后測定并計算吸附容量，方法同上。

1．5 吸附選擇性

用競爭吸附法考察了Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對混合樣品中糖蛋白的吸附選擇性。將100mg Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA分散于5．0mL含有1．0mg·mL－1BSA、Lys、β－casein和 OVA 的混合溶液中，吸附30min。吸附完成后，用磁鐵分離出上層清液，將吸附劑用緩沖液淋洗3次，最后用5%HAc溶液洗脫。將吸附前后的蛋白質(zhì)溶液、淋洗液和洗脫液進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析。

1．6 實際樣品分析

將鮮雞蛋清用50mmol·L－1NH3－NH4Cl緩沖溶液（pH＝8．5）稀釋20倍，室溫下攪拌30min，在4℃、10 000r·min－1下離心20min，上層清液即為雞蛋清樣品。將100mg Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA分散于5．0mL雞蛋清樣品中，吸附30min。吸附完成后，用磁鐵分離出上層清液，將吸附劑用緩沖液洗滌3次，最后用5%HAc溶液進(jìn)行洗脫。將吸附前后的蛋清樣品溶液、洗滌液和洗脫液進(jìn)行SDS－PAGE分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的制備與表征

SI－ATRP作為一種活性可控的聚合方法，被廣泛應(yīng)用于各種基質(zhì)表面聚合物的接枝，以提高材料表面功能基團(tuán)的密度。本研究選用4－CPTS為引發(fā)劑，通過硅烷化反應(yīng)將其鍵合在Fe3O4＠SiO2表面，得到固定引發(fā)劑Fe3O4＠SiO2＠Cl；然后以AAPBA為單體，在CuBr／bpy的催化下進(jìn)行聚合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后即在Fe3O4＠SiO2表面生成了含有苯硼酸的聚合物鏈（圖1）。

圖1 SI－ATRP法制備Fe3O4＠SiO2＠pAAPBAFig．1 The preparation process of Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA via SI－ATRP

通過傅里葉變換紅外（FT－IR）光譜和X射線光電子能譜（XPS）對Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA表面化學(xué)組成進(jìn)行表征（圖2）。在Fe3O4＠SiO2的FT－IR光譜圖譜中（圖2A曲線a），631、1 095cm－1處的吸收峰分別歸屬于Fe－O－Fe和Si－O－Si的伸縮振動，1 625、1 408cm－1的吸收峰分別歸屬于Fe3O4＠SiO2表面殘留檸檬酸酸鈉中COO－的對稱振動和非對稱振動；在Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的FT－IR圖中（圖2A曲線b），1 350cm－1處出現(xiàn)了B－O鍵的特征吸收，同時1 625、1 580、1 450cm－1處出現(xiàn)了新的吸收峰，屬于苯環(huán)的骨架振動。在XPS圖譜中（圖2B），196．5eV和400．8eV的結(jié)合能分別歸屬于B 1s和N 1s。對各元素含量進(jìn)行積分計算，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA表面的N元素含量為4．2%，B元素含量為3．6%。

圖2 （A）Fe3O4＠SiO2（a）和Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA（b）傅立葉變換紅外（FT－IR）光譜圖；（B）Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的X射線光電子能譜（XPS）圖Fig．2 （A）FT－IR spectra of Fe3O4＠SiO2（curve a）and Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA（curve b）；（B）XPS spectra of Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA

采用透射電鏡（TEM）觀察了吸附劑的形貌和尺寸（圖3A、3B）。可以明顯地觀察到Fe3O4＠SiO2的“核殼”結(jié)構(gòu)，且SiO2層包裹密實，厚度約為30nm；經(jīng)過聚合反應(yīng)后，得到的Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA表面粗糙，聚合物層厚度增大。最后，利用熱重分析（TGA）表征了Fe3O4＠SiO2表面聚合物的含量（圖3C）。當(dāng)溫度由25℃升高到200℃時，F(xiàn)e3O4＠SiO2和Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的質(zhì)量均有所下降，可能是材料中殘余溶劑的揮發(fā)所致。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，由于SiO2具有良好的熱穩(wěn)定性，F(xiàn)e3O4＠SiO2在200～750℃間質(zhì)量下降僅為5%；Fe3O4＠SiO2＠Cl在300～500℃間的質(zhì)量損失率為6%，是4－CPTS的分解所致；相比之下，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA在200～600℃間的質(zhì)量損失率高達(dá)17%，說明Fe3O4＠SiO2表面AAPBA聚合物的相對含量為17%。以上結(jié)果證明Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的制備是成功的。

圖3 （A）Fe3O4＠SiO2的透射電鏡（TEM）圖；（B）Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA的TEM 圖；（C）Fe3O4＠SiO2（a）、Fe3O4－＠SiO2＠Cl（b）、Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA（c）的熱重分析（TGA）曲線Fig．3 （A）TEM image of Fe3O4＠SiO2；（B）TEM image of Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA；（C）TGA curves of Fe3O4＠SiO2（a），F(xiàn)e3O4＠SiO2＠Cl（b）and Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA（c）

2．2 吸附容量

采用靜態(tài)吸附法測定了Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對4種不同蛋白質(zhì)的吸附容量，并繪制了等溫吸附線（圖4）。由圖可以看出，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA對蛋白質(zhì)的吸附容量隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的增大而逐漸增大，最后達(dá)到平衡。但是Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對OVA和HRP的吸附容量要遠(yuǎn)高于BSA和Lys，這是由于OVA和HRP為糖蛋白，其分子表面的鄰羥基能與Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA表面的硼酸基發(fā)生共價結(jié)合，因此Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對糖蛋白具有特異性吸附。Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對OVA和 HPR的吸附容量分別為373．9μg·mg－1和471．3μg·mg－1。

2．3 吸附動力學(xué)

改變吸附時間，研究Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對糖蛋白的吸附容量隨時間的變化，結(jié)果如圖5。可見，在5min到30min內(nèi)，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA對OVA和HPR的吸附容量迅速增大，30min后不再增大。因此，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA對糖蛋白的吸附在30min內(nèi)達(dá)到平衡。說明該吸附劑對蛋白質(zhì)的吸附具有較快的傳質(zhì)速率，這大大縮短了分析時間，提高了樣品前處理的效率。

圖4 Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對不同蛋白質(zhì)的靜態(tài)吸附等溫線Fig．4 Adsorption isotherms of Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA towards different proteins

圖5 吸附時間對蛋白質(zhì)吸附量的影響Fig．5 Effect of adsorption time on the adsorption capacity for proteins

2．4 吸附選擇性

根據(jù)硼親和原理，在堿性條件下，硼羥基能與順式二羥基形成穩(wěn)定的五元或六元酯環(huán)；而在酸性條件下，酯環(huán)水解，反應(yīng)逆向進(jìn)行，從而釋放出順式二羥基物質(zhì)。因此，硼親和吸附劑特別適合用于順式二羥基物質(zhì)的分離純化。本研究用Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對糖蛋白（OVA）和非糖蛋白（BSA、Lys、β－casein）的混合溶液進(jìn)行磁性分散固相萃取，SDS－PAGE分析結(jié)果如圖6。由于OVA分子表面含有順式二羥基，能與Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA發(fā)生可逆結(jié)合，因此萃取之后的蛋白質(zhì)樣品中（條帶3）OVA的含量明顯降低，而BSA、Lys和β－casein基本沒有變化；在洗滌液中（條帶4），物理吸附的蛋白質(zhì)都被洗滌下來；而在洗脫液中（條帶5），OVA分子被釋放，獲得了較高的純度。因此，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA對糖蛋白具有特異性識別，可用于復(fù)雜樣品中糖蛋白的分離純化。

2．5 實際樣品分析

雞蛋清中含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括OVA（45kDa）、卵蛋白抑制物（Ovoinhibitor，49kDa）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF，77kDa）和Lys（14kDa），它們的相對含量分別為54%、11%、13%和3．5%。其中，OVA、卵蛋白抑制物、轉(zhuǎn)鐵蛋白都是糖蛋白［24］。因此，本研究以雞蛋清為生物樣本，考察了Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA對實際樣品中糖蛋白的分離純化能力，SDS－PAGE結(jié)果如圖7。對比條帶2和3可以發(fā)現(xiàn)，雞蛋清樣品中OVA、卵蛋白抑制物和轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)過固相萃取之后含量明顯降低，表明這3種蛋白被選擇性吸附；而在洗滌液中（條帶4），物理吸附的蛋白質(zhì)被洗脫下來，出現(xiàn)了淺顯的條帶；在洗脫液中，被吸附OVA、卵蛋白抑制物和轉(zhuǎn)鐵蛋白被洗脫下來，從而出現(xiàn)了明顯的條帶且純度較高，說明它們從雞蛋清中被分離提取出來。因此，F(xiàn)e3O4＠SiO2＠pAAPBA可用于實際樣品中糖蛋白的分離純化，具有良好的實際應(yīng)用前景。

圖6 蛋白質(zhì)的SDS－PAGE分析圖Fig．6 SDS－PAGE analysis of proteinslane 1：protein marker；lane 2：protein mixture before the solid phase extraction；lane 3：protein mixture after the solid phase extraction；lane 4：the washing fraction，lane 5：the elution fraction．

圖7 實際樣品中蛋白質(zhì)的SDS－PAGE分析圖Fig．7 SDS－PAGE analysis of proteins in real samplelane 1：protein marker，lane 2：egg white before the solid phase extraction；lane 3：egg white after the solid phase extraction；lane 4：the washing fraction，lane 5：the elution fraction．

2．6 重復(fù)利用性能

將50．0mg Fe3O4＠SiO2＠pAAPBA吸附劑重復(fù)進(jìn)行吸附－洗脫－吸附實驗，重復(fù)10次，測定其吸附容量。重復(fù)利用7次以后，吸附容量雖然有所下降，但仍保持在初始吸附容量的81%左右。因此，該吸附劑具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性能。

3 結(jié)論

本研究以AAPBA為單體，采用SI－ATRP技術(shù)在Fe3O4＠SiO2表面接枝含有苯硼酸基團(tuán)的聚合物鏈，制備了一種新型硼親和磁性納米吸附劑。聚合物鏈的接枝有效地提高了微球表面苯硼酸基團(tuán)的密度，從而增大了吸附劑對糖蛋白的吸附容量。同時，該吸附劑對糖蛋白具有吸附選擇性，將其用于雞蛋清樣品的分離純化，能夠選擇性吸附糖蛋白并有效排除干擾。因此，此吸附劑可用于實際樣品中糖蛋白的分離純化，在生物樣品前處理方面具有良好的應(yīng)用前景。