宋重陽，康亞峰，李誠(chéng)予，龐代文，唐宏武

（生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430072）

自1986年Ashkin發(fā)明光鑷以來［1］，這一操縱微粒的工具得到了廣泛的應(yīng)用。一些研究者應(yīng)用光鑷捕獲各種各樣的納米顆粒，例如金納米粒子（AuNPs）［2］、量子點(diǎn)（QDs）［3］、上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）［4－5］、DNA納米復(fù)合物［6］等，用來研究納米材料和結(jié)構(gòu)的光物理和光化學(xué)性質(zhì)等問題［3，5］。UCNPs具有近紅外激發(fā)、可見光發(fā)射的特點(diǎn)，在生物分子檢測(cè)［7］、細(xì)胞標(biāo)記［8］、活體成像［9］等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。Jaque等人基于光鑷捕獲UCNPs，研究了UCNPs的發(fā)光性質(zhì)［5］，以及尺寸和表面電荷對(duì)光阱力的影響［10］，并操縱單顆UCNPs考察了單細(xì)胞光熱效應(yīng)［11］。

鏈置換反應(yīng)（Strand Displacement Reaction）是動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)（Dynamic DNA Nanotechnology）研究的核心。其中Toehold，即進(jìn)攻鏈（Invader strand）與之結(jié)合后引發(fā)分支遷移的單鏈DNA片段，可用于改變鏈置換反應(yīng)的速率，進(jìn)而構(gòu)建具有復(fù)雜動(dòng)力學(xué)行為的無酶DNA反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)［12－13］。一些研究者利用Toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，結(jié)合生物功能化納米材料，構(gòu)建納米生物傳感器用于DNA／RNA的傳感和檢測(cè)。Sun等人［14］利用金納米棒、金納米十字架構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移－表面熒光增強(qiáng)類型的納米傳感器，實(shí)現(xiàn)miRNA－34a的靈敏檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)成像。Li等人［15］構(gòu)建衛(wèi)星式納米金復(fù)合物，探究Toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)行為，并將其應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)miRNA－21的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

我們?cè)Y(jié)合光鑷技術(shù)和微球懸液分析方法，實(shí)現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物分子的體外檢測(cè)［7］。在此基礎(chǔ)上，本文結(jié)合核酸鏈置換反應(yīng)和發(fā)光穩(wěn)定的UCNPs，構(gòu)建可以對(duì)DNA進(jìn)行響應(yīng)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光的微納復(fù)合物（Micro－Nano Composites，MNCs），并采用光鑷輔助的顯微成像平臺(tái)實(shí)時(shí)探測(cè)單顆MNCs的解組裝過程，希望未來本方法能夠應(yīng)用于生物體系中生物分子的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

IX70型倒置熒光顯微鏡（日本，Olympus Ltd）；Evolve 512Delta型電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）（加拿大，Photometrics Ltd）；980nm連續(xù)激光器（上?？颇颂丶す饪萍加邢薰荆?；ZS90型動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（英國(guó)，Malvern Instruments Ltd．）；JEM－2010型透射電子顯微鏡鏡（日本，JEOL Ltd）；SIGMA FESEM型掃描電子顯微鏡（德國(guó)，Zeiss）。

稀土氯化物（LnCl3·6H2O）、Y（NO3）3·6H2O、NH4F、油酸（OA）、十八烯、2－（N－嗎啡啉）乙磺酸（Mes）、4－羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes），均購于上海阿拉丁公司；聚丙烯酸（PAA）、馬來酸酐十八碳烯共聚物（PMAO）、三羥甲基氨基甲烷（Tris），均購于Sigma－Aldrich（中國(guó)上海）；雙（6－氨基己基）胺（BHMT）購于上海TCI；NaOH、NaF、NaCl、氯仿、乙醇、正己烷、甲醇、一縮二乙二醇等購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購于上海共價(jià)化學(xué)；羥基－PEG2000－氨基、生物素－PEG2000－氨基購于上海芃碩生物科技有限公司；色譜純鏈酶親和素（SA）和DNA購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，見表1。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

表1 實(shí)驗(yàn)所用核酸序列Table 1 DNA Sequences used in this study

1．2 PMAO－UCNPs的制備

采用高溫?zé)崃呀夥ㄖ苽溆腿苄?UCNPs［16］。將1mmol稀土氯化物（Y／Yb／Er，78%／20%／2%）置于100mL三口燒瓶中，加入6mL OA和15mL十八烯，磁力攪拌和真空環(huán)境下升溫至120℃，保持120℃一段時(shí)間直至氯化物溶解。降溫至50℃以下，加入10mL NH4F（148mg）和NaOH（100mg）的甲醇溶液并攪拌30min，然后升溫至110℃將甲醇蒸出，隨后氬氣保護(hù)下升溫至320℃并保持此溫度反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，用水和乙醇的混合溶液（1∶1，V／V）、乙醇和正己烷（5∶11，V／V）的混合溶液分別洗滌3次，最后將得到的固體物質(zhì)分散于8mL氯仿中，即得OA包覆的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（OA－UCNPs）。

OA－UCNPs的水溶性修飾采用兩親性聚合物PMAO包覆的方法［17］。稱取500mg的PMAO，置于100mL單口圓底燒瓶中，加入20mL氯仿攪拌溶解。加入1mL上述制備的OA－UCNPs，超聲5min，室溫下攪拌2h后，減壓旋蒸除去氯仿。再加入10mL氯仿溶解分散，磁力攪拌下逐滴加入1mL的BHMT（30mg）的氯仿溶液，水浴超聲30min后，減壓旋蒸除去氯仿。加入12mL Na3BO3溶液（50mmol／L，pH＝9），于65℃水浴超聲將凝膠狀聚合物溶解。將所得的溶液于8 000r／min離心3min，棄去離心下來的團(tuán)聚物，上清液用0．45μm濾膜過濾后，于16 000r／min離心30min，將離心下來的固體用水洗滌3次，最后分散于1mL水中，即得水溶性上轉(zhuǎn)換納米顆粒PMAO－UCNPs。

1．3 PAA－MPs的制備

采用水熱法制備 NaYF4－MPs［18］。將0．0016mol Y（NO3）3·6H2O 置于50mL水熱反應(yīng)釜中后，用8mL水溶解，加入5mL檸檬酸鈉溶液（0．0016mol），磁力攪拌30min；加入18mL NaF溶液（0．0128mol）繼續(xù)攪拌1h后，將水熱釜加熱至220℃反應(yīng)12h，冷卻至室溫，依次用水、乙醇各洗滌3次后，分散于4mL乙醇中。MPs的表面修飾采用PAA配體交換的方法［19］。將200mg的PAA置于50mL三口燒瓶中，加入10mL一縮二乙二醇溶解，磁力攪拌下，逐滴加入1mL上述制備的MPs乙醇懸浮液，于水浴中超聲分散30min，磁力攪拌下升溫至120℃蒸出乙醇，在氬氣保護(hù)下升溫至240℃并持續(xù)攪拌4h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用乙醇和水各洗滌3次，最后分散于1mL水中，即得PAA－MPs懸浮液。

1．4 Capture－MPs的制備

取20μL上述制備的 MPs懸浮溶液，加入30μL NH2－DNA（10μmol／L），混合均勻后加入10μL新配的EDC溶液（10mg／mL），混勻后置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上反應(yīng)過夜，3 000r／min離心分離，并用Tris－HCl緩沖溶液（50mmol／L，pH＝8．0，200mmol／L NaCl）洗滌3次，再分散于50μL的 Hepes緩沖溶液（10mmol／L，pH＝7．4，200mmol／L NaCl）中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 SA－UCNPs的制備

取100μL制備的水溶性上轉(zhuǎn)換納米顆粒PMAO－UCNPs，依次加入100μL Mes緩沖溶液（10mmol／L，pH＝6．1），10μL羥基－PEG2000－氨基（100mg／mL），10μL生物素－PEG2000－氨基（0．1mg／mL），混合均勻后加入10μL現(xiàn)配的EDC溶液（1mg／mL），室溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，16 000r／min離心30min，用 Hepes緩沖溶液（10mmol／L，pH＝7．4，200mmol／L NaCl）洗滌3次，分散于200μL Hepes緩沖溶液中，加入2μg SA，于25℃孵育12h，用Hepes洗滌3次后，分散于200μL Hepes中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．6 MNCs的制備

取濃度均為10μmol／L的sDNA和cDNA各10μL，于25℃孵育2h，得到20μL的Duplex溶液（5μmol／L），置于4℃下保存?zhèn)溆?。將Capture－MPs和1nmol／L的Duplex孵育4h，Hepes（10mmol／L，pH＝7．4，200mmol／L NaCl，1%BSA）洗滌3次后，加入SA－UCNPs孵育16h，Hepes洗滌3次，再分散于Hepes中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．7 鏈置換反應(yīng)引發(fā)MNCs解組裝

在上述制備的 MNCs懸浮液中加入不同濃度的Invader strand（10nmol／L、1nmol／L、0．1nmol／L、0nmol／L），混勻后于25℃旋轉(zhuǎn)振蕩反應(yīng)12h。取10μL樣品置于顯微成像樣品室中，以100×油鏡觀察，10mW激光形成光鑷捕獲單顆微納復(fù)合物，EMCCD采集顯微照片并記錄上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度（曝光時(shí)間50ms，增益2）。

1．8 實(shí)時(shí)探測(cè)光阱中MNCs的解組裝

將上述制備的MNCs懸浮液稀釋20倍，然后取10μL分別加入10μL不同濃度的Invader strand（2 000nmol／L、200nmol／L、20nmol／L、2nmol／L、0nmol／L），混勻后，立即加入顯微成像樣品室中，光鑷捕獲后觀察發(fā)光強(qiáng)度的變化，每一濃度測(cè)定5個(gè)MNCs。

2 結(jié)果與討論

2．1 實(shí)時(shí)探測(cè)MNCs解組裝的原理

如圖1所示，構(gòu)建的MNCs以鏈置換反應(yīng)的底物為連接單元和分子識(shí)別單元，NaYF4微米顆粒為載體，UCNPs為發(fā)光標(biāo)記材料。Invader strand存在時(shí)，引發(fā)鏈置換反應(yīng)，MNCs發(fā)生解組裝。單顆MNCs被捕獲時(shí)解組裝過程在光阱中進(jìn)行，通過顯微成像平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該過程的實(shí)時(shí)探測(cè)。

圖1 實(shí)時(shí)探測(cè)鏈置換引發(fā)MNCs解組裝的示意圖Fig．1 Schematic illustration of real－time detection of the disassembling process of MNCs induced by strand displacement

2．2 UCNPs的制備

圖2 A（a）為OA－UCNPs的透射電鏡（TEM）圖片，該納米顆粒粒徑均一（22．9±1．5nm）。制備得到的PMAO－UCNPs（圖2A（b））和OA－UCNPs相比，其形貌沒有明顯變化，但是其表面有一層聚合物包覆層，厚度約為2nm。動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試結(jié)果（圖2B、2C）表明，偶聯(lián)PEG之后UCNPs的水合粒徑由27nm增加到30nm，Zeta電勢(shì)由－30mV變?yōu)椋?5mV，證明UCNPs表面偶聯(lián)上PEG分子。然后將SA和PEG末端的生物素結(jié)合，制備得到SA－UCNPs。

圖2 （A）OA－UCNPs（a）和PMAO－UCNPs（b）的透射電鏡（TEM）圖（標(biāo)尺100nm，插入圖中標(biāo)尺25nm）；（B）PMAO－UCNPs和PEG－UCNPs的動(dòng)態(tài)光散射粒徑測(cè)試結(jié)果；（C）PMAO－UCNPs和PEG－UCNPs的動(dòng)態(tài)光散射Zeta電勢(shì)測(cè)試結(jié)果Fig．2 （A）TEM images of OA－UCNPs（a）and PAMO－UCNPs（b）（scale bar 100nm，insert scale bar 25nm）；（B）DLS sizes of PMAO－UCNPs and PEG－UCNPs；（C）DLS zeta potentials of PMAO－UCNPs and PEG－UCNPs

2．3 PAA修飾的NaYF4微米顆粒（PAA－MPs）的制備

圖3 A為MPs的掃描電鏡（SEM）圖，由圖可見MPs為規(guī)則的正六邊型盤狀晶體，尺寸均一，平均直徑為1．17±0．07μm，平均厚度為0．67±0．05μm。我們用PAA對(duì)MPs的表面進(jìn)行修飾，在MPs表面引入羧酸官能團(tuán)，Zeta電勢(shì)測(cè)試結(jié)果證明PAA成功修飾在MPs表面（圖3B）。

圖3 （A）MPs的掃描電鏡（SEM）圖（標(biāo)尺5μm）；（B）MPs和PAA－MPs的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）Zeta電勢(shì)Fig．3 （A）SEM image of MPs（scalebar 5μm）；（B）DLS zeta potentials of MPs and PAA－MPs

2．4 MNCs的制備

UCNPs在MPs表面的組裝通過Duplex的連接實(shí)現(xiàn)，詳細(xì)步驟如圖4A所示。首先PAA－MPs表面偶聯(lián)NH2－DNA，制備得到Capture－MPs，然后通過異相DNA雜交將Duplex固定到MPs表面，最后通過SA與biotin的結(jié)合，將SA－UCNPs組裝在MPs表面，從而得到MNCs。根據(jù)SEM圖（圖4B），UCNPs已成功組裝到MPs表面。

圖4 （A）MNCs的制備流程圖；（B）MNC的SEM圖Fig．4 （A）Schematic illustration of the preparation of MNCs；（B）SEM image of MNCs

2．5 單個(gè)MNCs的光學(xué)捕獲

我們通過對(duì)商品化的倒置熒光顯微鏡進(jìn)行改造來搭建光鑷平臺(tái)，其光路如圖5A所示。圖5B為EMCCD拍攝的單顆MNCs進(jìn)入光阱被捕獲的過程。MNCs在極短時(shí)間內(nèi)即可被穩(wěn)定捕獲，MNCs處于光阱邊緣位置時(shí)發(fā)光微弱，穩(wěn)定捕獲后發(fā)光大大增強(qiáng)。這是因?yàn)楣廒鍍?nèi)的激光功率密度可以達(dá)到106W／cm2，雖然UCNPs量子產(chǎn)率較低，但仍然可以發(fā)出明亮的熒光。

圖5 （A）光鑷輔助的顯微成像平臺(tái)；（B）單顆MNCs的捕獲過程Fig．5 （A）Optical tweezers－assisted imaging plateform；（B）Trapping process of single MNCs

水分子在980nm波長(zhǎng)處有較大吸收［4］，如果產(chǎn)生的熱量過多，將會(huì)造成光阱（激光焦點(diǎn)處）內(nèi)溶液的溫度過高，會(huì)影響微納復(fù)合物中起連接作用的DNA Duplex的穩(wěn)定性，使其解鏈的可能性增加（圖6A）。如圖6B所示，激光功率為50mW時(shí)光阱中單顆MNCs的發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸減弱，以10mW的激光功率捕獲MNCs的同時(shí)連續(xù)激發(fā)30min，MNCs的發(fā)光強(qiáng)度也沒有明顯變化，說明10mW激光不影響MNCs的穩(wěn)定性。為了避免過熱效應(yīng)對(duì)微納復(fù)合物穩(wěn)定性的不利影響，我們采用10mW的激光捕獲MNCs。

圖6 （A）過熱導(dǎo)致MNCs解組裝的示意圖；（B）不同功率激光對(duì)MNCs發(fā)光的影響Fig．6 （A）Scheme of the disassembly process of MNCs caused by overheating；（B）Influence of different powers on the luminescence of MNCs

2．6 鏈置換反應(yīng)引發(fā)微納復(fù)合物解組裝

Invader strand首先與sDNA的Toehold結(jié)合，然后經(jīng)過分支遷移，將cDNA置換下來，cDNA和sDNA分開，與sDNA連接的UCNPs脫離 MPs。如圖7所示，在MNCs懸液中加入不同濃度的Invader strand孵育12h，MNCs的發(fā)光強(qiáng)度有不同程度減弱，濃度越高信號(hào)變化越大。低至100pmol／L的濃度即可產(chǎn)生顯著的信號(hào)變化，因此MNCs可應(yīng)用于DNA的檢測(cè)。

2．7 微納復(fù)合物解組裝的實(shí)時(shí)探測(cè)

圖7 與不同濃度的invader strand孵育12h后單顆MNCs的發(fā)光強(qiáng)度Fig．7 Luminescence intensity of single MNCs after incubating with different concentrations of invader strand for 12h

在證明光阱中MNCs的穩(wěn)定性和解組裝的有效性之后，我們進(jìn)一步實(shí)時(shí)探測(cè)了光阱中MNCs的解組裝過程，如圖8A所示。加入100nmol／L Invader strand，MNCs的發(fā)光強(qiáng)度在數(shù)分鐘之內(nèi)快速減弱，如圖8B和8C所示。Invader strand的濃度越高，如圖8D所示，發(fā)光強(qiáng)度變化速度越快。Invader strand的濃度為1nmol／L時(shí)，可以在10min內(nèi)產(chǎn)生顯著的信號(hào)變化，因此構(gòu)建的MNCs可作為微傳感器用于DNA的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

圖8 （A）光阱中鏈置換引發(fā) MNCs解組裝；（B）100nmol／L invader strand產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度變化（平行測(cè)定5個(gè)MNCs）；（C）圖B中5次結(jié)果的平均值；（D）不同濃度invader strand產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度變化（從上至下：0、1、10、100、1 000nmol／L）Fig．8 （A）Disassembling process of optical－trapped MNCs induced by strand displacement；（B）Luminescence variation caused by 100nmol／L invadet strand（measuring 5MNCs）；（C）Average value of 5measurements in（B）；（D）Luminescence variations caused by invader strand with different concentrations（from top to bottom：0，1，10，100，1 000nmol／L）

3 結(jié)論

本文以微米顆粒作為載體，納米顆粒為發(fā)光標(biāo)記材料，鏈置換反應(yīng)底物Duplex為連接單元構(gòu)建的微納復(fù)合物在Invader strand存在時(shí)順利發(fā)生解組裝。較低功率（10mW）的近紅外激光對(duì)微納復(fù)合物的穩(wěn)定性沒有明顯影響，利用光鑷輔助的顯微成像平臺(tái)可以實(shí)時(shí)探測(cè)鏈置換反應(yīng)引發(fā)的微納復(fù)合物的解組裝過程。光鑷捕獲的微納復(fù)合物可作為一種微傳感器來響應(yīng)DNA濃度的變化，結(jié)合光鑷可以主動(dòng)捕獲并操縱微粒的特點(diǎn)，構(gòu)建的MNCs有望應(yīng)用于生物體系中DNA／RNA的實(shí)時(shí)探測(cè)，為動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)提供一種有效的研究手段。