戴迪 靳貴林 崔治家 楊扶德 邵士俊

摘要：目的? 通過(guò)研究枸杞子水提部位的熒光特性，為枸杞子鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法? 采用紫外吸收光譜、熒光激發(fā)譜、熒光發(fā)射譜、三維熒光光譜的多維光譜結(jié)合方法得到枸杞子水提取部位的全方位光譜特征信息，并對(duì)特征熒光峰進(jìn)行表征。結(jié)果? 枸杞子水提部位有2個(gè)明顯的特征熒光峰，分別在激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）280 nm/發(fā)射波長(zhǎng)（Em）340 nm與Ex 340 nm/Em 450 nm處，且熒光強(qiáng)度與濃度有關(guān)，受溫度、酸堿度、共存離子影響;對(duì)照品東莨菪內(nèi)酯、色氨酸的三維熒光光譜峰位置與之相似。結(jié)論? 采用水提部位熒光光譜圖可對(duì)枸杞子進(jìn)行定性鑒別，特征熒光峰初步推斷為以色氨酸為代表的氨基酸類組分和東莨菪內(nèi)酯類組分。

關(guān)鍵詞：枸杞子;熒光特性;三維熒光光譜;中藥鑒定

中圖分類號(hào)：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）07-0079-05

Abstract： Objective To study the fluorescence characteristics of the water extracting parts of Lycii Fructus; To provide a basis for the identification and quality evaluation of Lycii Fructus. Methods Multi-dimensional spectroscopy including ultraviolet absorption spectroscopy， fluorescence excitation spectroscopy， fluorescence emission spectroscopy and three-dimensional fluorescence spectroscopy were used to obtain the omnidirectional spectral characteristics of the water extracting part of Lycii Fructus， and the characteristic fluorescence peaks were characterized. Results There were two distinct characteristic fluorescence peaks in the water extracting parts of Lycii Fructus， which were at Ex 280 nm/Em 340 nm and Ex 340 nm/Em 450 nm， respectively. The fluorescence intensity was related to concentration， affected by temperature， pH value and coexisting ions; the three-dimensional fluorescence peak positions of scopoletin and tryptophan were similar to Lycii Fructus. Conclusion The fluorescence spectrum of the water extracting parts can be used to qualitatively identify Lycii Fructus. It is preliminarily concluded that the characteristic fluorescent peaks were the amino acid component represented by tryptophan and scopoletin component.

Keywords： Lycii Fructus; fluorescence characteristics; three-dimensional fluorescence spectroscopy; identification of TCM

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)，其味甘性平，有滋補(bǔ)肝腎、益精明目功效[1]。研究表明，枸杞子具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗疲勞等多種藥理作用[2-8]。枸杞的某些化學(xué)成分具有發(fā)射熒光的特性，如黃酮類、生物堿類、酚酸類、氨基酸與蛋白質(zhì)等，目前枸杞的定性定量鑒別主要采用紫外光譜、紅外光譜、液相色譜等方法[9-12]，但對(duì)其熒光光譜特性鮮有報(bào)道。中藥傳統(tǒng)用藥為水煎劑，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枸杞子水提液具有良好的熒光性質(zhì)，故有必要深入研究其全譜信息。本研究采用多維光譜方法得到枸杞子水提取部位的全面光譜信息，對(duì)影響熒光的因素進(jìn)行考察，并初步研究其特有的熒光組分，對(duì)熒光峰的歸屬進(jìn)行表征，為枸杞子的快速鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1? 儀器與試藥

Lambda35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer公司），F(xiàn)luorolog-3熒光光譜儀（美國(guó)HORIBA公司），PB-10/C標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)（Sartorius），JB-040S潔盟牌超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

枸杞子樣品采集于寧夏自治區(qū)中寧縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)。色氨酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10024582）、苯丙氨酸（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20141211）、酪氨酸（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20150208）、東莨菪內(nèi)酯（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS1345-0025）、葡萄糖（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)10010518）、果糖（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111504-200001），水為超純水，其他試劑為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 熒光光譜測(cè)定條件優(yōu)化

參數(shù)設(shè)置會(huì)影響圖譜結(jié)果，測(cè)試范圍需要包含熒光特征峰波段。狹縫越窄，靈敏度越低;狹縫太大則分辨率隨之降低，同時(shí)狹縫雜散光更容易進(jìn)入。激發(fā)狹縫（Ex Slit）越大熒光強(qiáng)度越弱，發(fā)射狹縫（Em Slit）越大熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。最終選擇三維熒光光譜測(cè)試條件為：激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）范圍250～450 nm，采樣間隔10 nm，Ex Slit 2 nm;發(fā)射波長(zhǎng)（Em）范圍250～600 nm，采樣間隔10 nm，Em Slit 2 nm;積分時(shí)間0.2 s。

2.2? 溶液的制備

枸杞子樣品于60 ℃烘干至恒重，粉碎后過(guò)65目篩，準(zhǔn)確稱取0.4 g粉末置于試管中，加入20 mL蒸餾水，40 ℃超聲（功率240 W，頻率40 kHz）30 min，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以超純水定容，得到每毫升相當(dāng)于4 mg藥材的水提液，作為母液（濃度4.00 mg/mL），用時(shí)適當(dāng)稀釋。

將0.04 mol/L磷酸、硼酸和醋酸的混合液，加入0.2 mol/L NaOH溶液，在酸度計(jì)上調(diào)至所需pH值，配制成pH 2～12的系列Britton-Robinson緩沖溶液。

2.3? 枸杞子水提部位光譜信息

枸杞子水提部位的三維熒光等高線光譜見(jiàn)圖1，圖中等高線表示熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，枸杞子水提部位在Ex 280 nm/Em 340 nm與Ex 340 nm/Em 450 nm處有2個(gè)熒光峰，分別標(biāo)記為Peak1、Peak2。枸杞子水提部位紫外吸收光譜見(jiàn)圖2，在200～350 nm范圍內(nèi)均有吸收，在波長(zhǎng)260 nm處有吸收峰值。

通過(guò)選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，分別繪制Peak1、Peak2對(duì)應(yīng)的枸杞子水提部位2種主要熒光組分的二維熒光光譜。組分A和組分B的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別見(jiàn)圖3、圖4。

2.4? 影響因素考察

2.4.1? 濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

根據(jù)熒光分析的一般規(guī)律，稀溶液中熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)的濃度成正比，熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)會(huì)發(fā)生自猝滅，使熒光強(qiáng)度降低。將新制的枸杞子母液配制成不同濃度（0、0.004、0.008、0.012、0.04、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg /mL），在Ex 340 nm/Em 450 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，考察濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。不同濃度枸杞子水提液三維熒光等高線光譜見(jiàn)圖5?？梢钥闯?，在一定濃度范圍內(nèi)，Peak1、Peak2熒光強(qiáng)度隨濃度升高而升高，濃度較小時(shí)水拉曼峰明顯干擾Peak1，濃度為0.4 mg/mL時(shí)2個(gè)熒光峰強(qiáng)度相當(dāng)、等高線疏密適中，故選擇0.4 mg/mL作為考察濃度。不同濃度枸杞子水提液紫外吸收光譜見(jiàn)圖6。紫外吸收隨濃度升高而增大，很多物質(zhì)在此波段有吸收，波長(zhǎng)260 nm處吸收峰特征性不強(qiáng)。對(duì)比圖5和圖6可以看出，三維熒光光譜可以提供更多特征性的光譜信息。在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，Peak1、Peak2對(duì)應(yīng)的熒光組分A、組分B的熒光強(qiáng)度隨濃度升高而升高，見(jiàn)圖7、圖8。

2.4.2? 放置時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

新配制枸杞子水提液，考察放置時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超純水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在48 h內(nèi)間隔一定時(shí)間測(cè)試，記錄Ex 340 nm/Em 450 nm的熒光強(qiáng)度，結(jié)果枸杞子水提液熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，在48 h內(nèi)變化很小，見(jiàn)表1。

2.4.3? 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

通常溫度對(duì)溶液的熒光強(qiáng)度有顯著影響。由于分子運(yùn)動(dòng)和能量轉(zhuǎn)換，一般規(guī)律是，隨著溫度升高，溶液的熒光強(qiáng)度會(huì)降低。于4 mL比色管中加入0.4 mL母液，用超純水配制成0.4 mg/mL溶液，平行配制3份，在不同溫度進(jìn)行測(cè)試，記錄Ex 340 nm/Em 450 nm的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖9。

2.4.4? pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

熒光組分大多數(shù)是含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物，溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度有很大影響。于10 mL容量瓶中加入1 mL母液，然后用pH 2～12的Britton- Robinson緩沖溶液定容，平行配制3份，考察溶液pH值對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。

2.4.5? 共存物對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

在枸杞子水提液中加入高濃度葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+、Pb2+、Hg+后定容到枸杞子水提液濃度為0.4 mg/mL，考察共存物對(duì)體系熒光的影響。結(jié)果表明，葡萄糖、果糖、HSO3-、Cd2+、Cu2+等離子均對(duì)枸杞子水提液三維熒光光譜熒光峰無(wú)明顯影響，不干擾測(cè)定。含Pb2+枸杞子水提液的三維熒光光譜熒光峰紅移，熒光強(qiáng)度減弱;含Hg+枸杞子水提液的三維熒光光譜熒光強(qiáng)度減弱，峰形不變。

2.5? 熒光峰初步推斷

已有文獻(xiàn)報(bào)道東莨菪內(nèi)酯、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸熒光峰值[13-15]，故測(cè)試這些對(duì)照品的三維熒光光譜，見(jiàn)圖11。氨酸類在Ex 250～300 nm/Em 300～350 nm左右出峰，與水提部位特征熒光峰Peak1接近;東莨菪內(nèi)酯光譜峰在Ex 340 nm/Em 450 nm左右，與水提部位特征熒光峰Peak2相似。東莨菪內(nèi)酯和色氨酸混合三維熒光光譜峰與枸杞子水提部位特征熒光峰相似，見(jiàn)圖12。

3? 討論

枸杞子藥用歷史悠久，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別以色紅、粒大、籽小、肉厚、質(zhì)柔、味甜者為佳，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)可對(duì)枸杞子進(jìn)行更全面評(píng)價(jià)。枸杞子化學(xué)成分復(fù)雜，本研究結(jié)合多維光譜的方法，發(fā)現(xiàn)其三維熒光光譜圖中只出現(xiàn)2種組分的熒光峰，可用于枸杞子的定性鑒別，初步推測(cè)其中一組為以色氨酸為代表的氨基酸類組分的特征熒光峰，另一組為東莨菪內(nèi)酯類組分的特征熒光峰。枸杞子水提部位熒光穩(wěn)定性好，不易受離子干擾，2種組分的熒光發(fā)射峰相距110 nm，選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)可以分別繪制2種組分的二維熒光光譜。在實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，2種組分的熒光強(qiáng)度均與濃度呈良好的線性關(guān)系，可作為2種組分定量分析的基礎(chǔ)。

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