張勇，覃鴻妮，謝鈺珍，王倩文

（1.蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院，江蘇蘇州 215123；2.蘇州智享眾創(chuàng)孵化管理有限公司，江蘇蘇州 215123）

程序性死亡受體1（Programmed death 1，PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，屬于免疫球蛋白超家族[1]。PD-1主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，功能是抑制細(xì)胞的激活，這是免疫系統(tǒng)的一種正常的自穩(wěn)機(jī)制，因?yàn)檫^度的T/B細(xì)胞激活會(huì)引起自身免疫病，所以PD-1是人體的一道護(hù)身符[2-4]。但是，腫瘤微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)浸潤的T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，腫瘤細(xì)胞會(huì)高表達(dá)PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)激活，T細(xì)胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細(xì)胞[5-7]。PD-1的抗體可以阻斷這一通路，部分恢復(fù)T細(xì)胞的功能，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞。以PD-1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義。其配體PD-L1也可作為靶點(diǎn)，相應(yīng)的抗體也可以起到相同的作用[2]。本研究以PD-1分子為靶點(diǎn)，以中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞為宿主，構(gòu)建高表達(dá)抗PD-1單克隆抗體的細(xì)胞株，優(yōu)化細(xì)胞株篩選工藝，得到穩(wěn)定高表達(dá)PD-1細(xì)胞株，且蛋白質(zhì)量與原研藥一致。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組工程細(xì)胞株的構(gòu)建，采用自Invitrogen購入的FreedomTMCHO-STM kit。該試劑盒包含表達(dá)載體pFreedomTM CHO1.0和宿主細(xì)胞CHO-S。細(xì)胞生長過程中使用化學(xué)限定培養(yǎng)基CD FortiCHO 培養(yǎng)基，呈懸浮態(tài)生長。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的合成

根據(jù)信號(hào)肽氨基酸序列得出目的基因序列，設(shè)計(jì)引物通過PCR方法合成目的基因。

（1）目的信號(hào)肽序列及引物序列。

Heavy chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信號(hào)肽）

Light chain METDTLLLWVLLLWVPGSTG（信號(hào)肽）

（2）擴(kuò)增引物序列。

重鏈 01-H-F：5’-CTTCCTAGGGCCACCATGGGCTG GAGCCTGATCCT-3’

01-H-R：5’-attGTATACTCACTTGCCCAGGGAGAG GCTCA-3’

輕鏈 01-L-F：5’-CTTGATATCGCCACCATGGATTTT CAGGTGCAAAT-3’

01-L-R：5’-ATTTTAATTAATCAGCATTCGCCCCGA TTAAAGGACTTGG-3’

1.2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

由Primer軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（本實(shí)驗(yàn)所有引物均由蘇州金維智生物科技有限公司合成），引物經(jīng)過1輪PCR擴(kuò)增，得到H鏈目的片段，將H鏈目的片段通過T4連接的方法克隆到經(jīng)過AvrII和BstZ17I雙酶切過的 Freedom ?pCHO 1.0載體上，命名為pCHO1.0-H。引物經(jīng)過第2輪PCR擴(kuò)增，得到L鏈目的片段，將L鏈目的片段通過T4連接的方法克隆到經(jīng)過EcoRV 和PacI雙酶切過的pCHO1.0-H載體上，命名為pCHO1.0-PD-1。

1.2.3 重組工程細(xì)胞株的構(gòu)建

電轉(zhuǎn)染的方法將抗體表達(dá)質(zhì)粒pCHO1.0-PD-1轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，利用Puromycin和MTX篩選系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選和克隆化，從而得到高表達(dá)PD-1抗體的克隆。通過比較克隆的生長特征及所表達(dá)蛋白的性質(zhì)，最終確定細(xì)胞株。重組工程細(xì)胞株的構(gòu)建采用自Invitrogen購入的FreedomTMCHO-STM kit，將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞懸液過濾后傳代至T75方瓶。所用篩選培養(yǎng)基分別為含有 10 μg/ml Puro、100 nmol/L MTX。將方瓶置于37℃，8% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。7天后開始每3～4天檢測(cè)細(xì)胞活率，當(dāng)細(xì)胞活率大于30%或細(xì)胞活率較最近一次檢測(cè)有所增加時(shí)，將細(xì)胞以1×106個(gè)/ml的密度傳代至125 ml搖瓶。當(dāng)細(xì)胞活率大于85%，細(xì)胞密度大于1×106個(gè)/ml時(shí)，第一階段篩選完成。對(duì)第一階段加壓放大得到的3個(gè)細(xì)胞群和第二階段加壓放大得到的3個(gè)細(xì)胞群采用6孔板5天靜止培養(yǎng)的方法進(jìn)行高產(chǎn)細(xì)胞群的篩選。6孔板5天靜止培養(yǎng)方法：以0.3×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種至6孔板，接種體積為3 ml，第5天結(jié)束，收獲上清液。利用生物膜干涉技術(shù)檢測(cè)抗體表達(dá)量，篩選出抗體表達(dá)量最高的細(xì)胞群。

1.2.4 細(xì)胞株的鑒定

對(duì)表達(dá)量最高的2個(gè)克隆進(jìn)行基因組目的基因測(cè)序及支原體、無菌檢測(cè)。并對(duì)2個(gè)克隆所表達(dá)抗體進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.2.4.1 目的基因測(cè)序

用 TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒、按照廠家提供的方法，分別提取初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中連續(xù)傳代至第9代的細(xì)胞的基因組DNA，以基因組DNA作為模板，用表中位于目的基因側(cè)翼區(qū)的引物進(jìn)行PCR，分別獲得攜帶全長IBI308重鏈基因及輕鏈基因的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.4.2 支原體檢測(cè)及無菌檢測(cè)

使用支原體PCR檢測(cè)試劑盒，對(duì)2個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行初步支原體檢測(cè)。檢測(cè)方法詳見試劑盒說明書。若待測(cè)樣品存在支原體污染，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)獲得290 bp的PCR條帶。

1.2.4.3 LC/MS法產(chǎn)品分子量檢測(cè)

切糖樣品處理：樣品用 New England Biolabs公司的 PNGase F（P0704S）切糖，取 50 μg樣品用超純水稀釋至90 μL，加入10×G7緩沖液（隨酶提供）10 μL、PNGase F 2 μL，37 ℃孵育 24 h。孵育后的樣品轉(zhuǎn)移至離心濃縮柱中，以13 000 r/min速度離心15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白 3 min 后加 8 mol/L 的鹽酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以還原二硫鍵。然后脫鹽并稀釋至1 mg/mL，上LC-MS分析。處理的樣品采用LC-MS檢測(cè)。

不切糖輕重鏈分子量檢測(cè)樣品處理：取樣品50 μg至離心濃縮柱中，加水至 500 μL，以 13 000 r/min速度離心 15 min，再以 1 000×g的速度回收蛋白3 min 后加 8 mol/L 的鹽酸胍 100 μL 和 1 mol/L DTT 3 μL，37 ℃孵育1 h以還原二硫鍵。然后脫鹽并稀釋至 1 mg/mL，上 LC-MS 分析。

1.2.4.4 蛋白SEC純度（SEC-HPLC法）

用超純水將樣品稀釋至2 mg/mL，置于進(jìn)樣瓶中，接上分析柱，設(shè)置方法參數(shù)為：流速0.5 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 50 μL，即蛋白 100 μg，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣2次，檢測(cè)波長280 nm，分析時(shí)間30 min。檢測(cè)完成后，采用峰面積歸一化法計(jì)算各樣品主成分的百分比。

1.2.4.5 初步傳代穩(wěn)定性檢測(cè)

復(fù)蘇原始細(xì)胞株進(jìn)行初步傳代穩(wěn)定性研究。將復(fù)蘇后細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)59天（約60個(gè)細(xì)胞世代）。傳代過程中使用添加1% Anti-Clumping Agent、1 000 nmol/L MTX的生長培養(yǎng)基，接種密度為0.3×106～ 0.8×106個(gè) /mL，接種體積為 30 mL。每周一、三、五傳代。觀察傳代過程中2個(gè)細(xì)胞株的細(xì)胞密度、細(xì)胞活率和倍增時(shí)間。

1.2.4.6 抗體表達(dá)量檢測(cè)

2個(gè)原始細(xì)胞株連續(xù)傳代約60世代后，分別對(duì)M0（原始細(xì)胞）、M1（連續(xù)傳代一個(gè)月）、M2（連續(xù)傳代兩個(gè)月）的細(xì)胞進(jìn)行14天流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體表達(dá)質(zhì)粒pCHO1.0-PD-1的構(gòu)建

采 用AvrII/BstZ17I和EcoRV/PacI對(duì) 質(zhì) 粒pCHO1.0-PD-1進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)酶切位點(diǎn)及質(zhì)粒片段大小正確。如圖1所示，用AvrII/BstZ17I進(jìn)行雙酶切，目的片段大小為 1 400 bp，用 EcoRV/PacI進(jìn)行雙酶切，目的片段大小為750 bp，目的片段大小正確，所以酶切位點(diǎn)及質(zhì)粒片段大小正確。對(duì)最終表達(dá)質(zhì)粒pCHO1.0-PD-1進(jìn)行目的基因測(cè)序分析，對(duì)比結(jié)果顯示與理論序列一致。

圖1 Lbcpf1片段PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 高表達(dá)PD-1的重組工程細(xì)胞株構(gòu)建

2.2.1 篩選高表達(dá)細(xì)胞群

對(duì)第一階段加壓放大得到的3個(gè)細(xì)胞群和第二階段加壓放大得到的3個(gè)細(xì)胞群采用6孔板5天靜止培養(yǎng)，收獲上清液，利用生物膜干涉技術(shù)檢測(cè)抗體表達(dá)量。結(jié)果表明：以1（第二輪加壓）、2（第二輪加壓）二個(gè)細(xì)胞群抗體表達(dá)量較高，分別為20.3 mg/L、25.5 mg/L。

2.2.2 篩選陽性單克隆

利用有限稀釋法對(duì)表達(dá)量最高的細(xì)胞群18（10/100～50/1000）進(jìn)行單克隆篩選，在培養(yǎng)第20天時(shí)用利用生物膜干涉技術(shù)檢測(cè)上清內(nèi)的抗體表達(dá)量，表達(dá)量最高的分別為19.38 mg/L和18.27 mg/L，最低的為5.76 mg/L。篩選出表達(dá)量最高的48個(gè)克隆，24孔板培養(yǎng)5天后，最高的表達(dá)量分別為19.14 mg/L和 17.75 mg/ L，最低的為 10.72 mg/L。篩選出表達(dá)量最高的24個(gè)克隆，6孔板培養(yǎng)5天后，將表達(dá)量高的前18個(gè)克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，進(jìn)行14天流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其中的蛋白量，結(jié)果如圖2，從圖中可以看出克隆01C90和01C42的表達(dá)量是最高的兩個(gè)，分別為2 091 mg/L 和 2 028 mg/L。

表1 細(xì)胞群靜止表達(dá)量

圖2 14天流加培養(yǎng)蛋白量

2.3 細(xì)胞庫的鑒定

2.3.1 支原體檢測(cè)及無菌檢測(cè)

如圖3所示，樣品1和樣品2在290 bp處無條帶出現(xiàn)，而3號(hào)陽性對(duì)照在290 bp處有明顯的條帶，所以支原體檢測(cè)結(jié)果為陰性。用濾膜過濾法檢測(cè)細(xì)胞庫，無菌檢測(cè)結(jié)果為陰性。

圖3 支原體檢測(cè)

2.3.2 LC/MS法產(chǎn)品分子量檢測(cè)

采用LC-MS法測(cè)定了克隆01C42和01C90的切糖輕重鏈分子量和不切糖輕重鏈分子量。檢測(cè)結(jié)果表明：兩個(gè)克隆的實(shí)測(cè)分子量無明顯差異，均為23 745.0，與理論分子量差異在方法誤差范圍內(nèi)。重鏈未切糖實(shí)測(cè)分子量無明顯差異，均為507 166.2，與含有G0F糖型的理論分子量差異在方法誤差范圍內(nèi)，重鏈切糖實(shí)測(cè)分子量48 270.9，與理論分子量差異在方法誤差范圍內(nèi)。因此認(rèn)為兩個(gè)克隆的輕重鏈分子量相同，且與理論值一致。

2.3.3 蛋白SEC純度（SEC-HPLC法）

原始細(xì)胞庫2個(gè)原始細(xì)胞株所表達(dá)抗體的SEC檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，經(jīng)Protein A親和柱純化后，2個(gè)原始細(xì)胞株所表達(dá)的抗體的SEC純度均高于98%。說明這2個(gè)原始細(xì)胞株在抗體SEC純度上均表現(xiàn)優(yōu)異。

2.3.4 初步傳代穩(wěn)定性

將復(fù)蘇后細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)59天（約60個(gè)細(xì)胞世代）。60個(gè)世代的初步傳代過程中2個(gè)克隆01C42和01C90的抗體表達(dá)量均未降低，倍增時(shí)間維持在20～30 h，細(xì)胞活率均高于95%。

2個(gè)原始細(xì)胞株連續(xù)傳代約60世代后，分別對(duì)M0（原始細(xì)胞）、M1（連續(xù)傳代一個(gè)月）、M2（連續(xù)傳代兩個(gè)月）的細(xì)胞進(jìn)行14天流加實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)量。表2所示為不同世代的2個(gè)細(xì)胞株14天累積的抗體表達(dá)量。圖4為不同世代的2個(gè)細(xì)胞株在14天流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的抗體表達(dá)量。

表2 不同世代的原始細(xì)胞株抗體表達(dá)量

圖4 不同世代的原始細(xì)胞株抗體表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

運(yùn)用懸浮細(xì)胞CHO表達(dá)抗PD-1的抗體，無論從表達(dá)上還是穩(wěn)定性都有著比較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，首先在質(zhì)粒構(gòu)建中，將重鏈和輕鏈插到同一個(gè)載體上，保證了重鏈和輕鏈的比例為1∶1，可以實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，輕重鏈在一個(gè)載體上，再同PD-1基因共轉(zhuǎn)染，對(duì)后面的基因擴(kuò)增篩選提供基礎(chǔ)。采用懸浮培養(yǎng)，使用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基CD培養(yǎng)基化學(xué)成分簡(jiǎn)單，制備方便，能很好的支持重組CHO細(xì)胞的生長，進(jìn)而可以達(dá)到高密度培養(yǎng)，可達(dá)8×106～10×106vc/mL，批次培養(yǎng)的總細(xì)胞密度可達(dá) 100×106～ 150×106vc/mL，高密度的生長優(yōu)勢(shì)促使細(xì)胞粉筆的產(chǎn)量達(dá)到一個(gè)較高的水平，單純的批次培養(yǎng)最高表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)1g/L，為后續(xù)的工藝降低生產(chǎn)成本，減少下游工藝開發(fā)的復(fù)雜性，另外懸浮培養(yǎng)對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)有很大優(yōu)勢(shì)，如可連續(xù)擴(kuò)大生產(chǎn)量，有利于細(xì)胞與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氣體充分接觸，而且易于控制培養(yǎng)條件（溫度、pH、氧氣分壓和二氧化碳等），培養(yǎng)條件穩(wěn)定，趨于均一，便于進(jìn)行定量研究，于在連續(xù)密封的系統(tǒng)中進(jìn)行，減少了操作步驟和污染的機(jī)會(huì)，可以長期連續(xù)培養(yǎng)，既可節(jié)省人力，又使細(xì)胞能持續(xù)維持在對(duì)數(shù)生長期。單克隆抗體是特異性很強(qiáng)的藥物，如果可以很好的解決免疫原性的問題，它應(yīng)用于腫瘤或其他疾病應(yīng)比其他藥物的副作用低得多。從長遠(yuǎn)來看，作為治療用品，有著廣闊的前景，從商業(yè)的角度來講，治療性抗體的市場(chǎng)也將是巨大的，隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，越來越多的基因及其相關(guān)蛋白的發(fā)掘，與腫瘤和其他疾病相關(guān)的抗原就成為了治療性抗體研究的主要靶標(biāo)，治療性單抗將在人類疾病治療中扮演重要角色[8-10]。

3.2 結(jié)論

通過構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PD-1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、加壓篩選、有限稀釋獲得高表達(dá)PD-1抗體的單克隆。14天流加培養(yǎng)抗體表達(dá)量最高的2個(gè)克隆01C42和01C90抗體表達(dá)量為2.03 g/L和2.09 g/L。2個(gè)亞克隆所攜帶的目的基因序列與理論序列完全相同，所表達(dá)抗體的分子量與理論分子量一致。經(jīng)protein A親和柱純化后的抗體純度均高于98%，60個(gè)世代的初步傳代過程中2個(gè)克隆的抗體表達(dá)量均未降低，倍增時(shí)間維持在20～30 h，細(xì)胞活率均高于98%。