曹金博 王耀 李燕虹

摘要對苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等常見“新型瘦肉精”藥物的檢測方法進(jìn)行綜述，主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等儀器檢測方法以及酶聯(lián)免疫法、免疫層析法、電化學(xué)發(fā)光免疫法等免疫分析方法，為保障我國動物性食品安全提供更好的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞新型瘦肉精；危害；檢測方法

中圖分類號TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.001

AbstractThe detection methods of common “new type lean meat” drugs such as phenylethanolamine A，cyheptadine，clonidine and baclofen were summarized，the main detection methods include highperformance liquid chromatography，gas chromatographymass spectrometry，capillary electrophoresis and other instrumentation methods，and immunoassay methods such as enzymelinked immunoassay，immunochromatography，and electrochemiluminescence immunoassay，so as to provide better technical support for ensuring the safety of animal food in China.

Key wordsNew type lean meat powder；Harm；Detection method

瘦肉精是一類國家禁止在禽畜養(yǎng)殖中使用的腎上腺素受體激動劑類藥物的俗稱，將其添加在飼料或動物飲水中能有效促進(jìn)禽畜生長，提高瘦肉率[1]。傳統(tǒng)的瘦肉精藥物一般包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，是目前禽畜養(yǎng)殖中主要監(jiān)控的藥物[2-3]，但近些年，隨著我國食品安全監(jiān)管力度的加大，一些不法分子為逃避監(jiān)控開始使用一些功能類似的“新型瘦肉精”藥物，如苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等[4]。農(nóng)業(yè)部在2010年發(fā)布1519號公告，明確規(guī)定禁止在飼料和動物飲水中添加苯乙醇胺A等物質(zhì)。因此，為加強(qiáng)動物性食品安全監(jiān)控，開展“新型瘦肉精”檢測方法研究尤為必要。

1概述

“新型瘦肉精”的出現(xiàn)給動物性食品安全檢測帶來新的挑戰(zhàn)，尤其針對苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂定、巴氯芬等藥物的檢測[5]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，此類藥物雖結(jié)構(gòu)式各不相同，但卻共同具有促生長、提高瘦肉率的作用[6-8]。研究表明，“新型瘦肉精”類藥物主要通過以下兩個途徑對動物體內(nèi)營養(yǎng)素進(jìn)行再分配。一是與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活G蛋白釋放二磷酸鳥苷（GDP），GDP與三磷酸鳥苷（GTP）結(jié)合從而活化腺苷酸活化酶（AC），進(jìn)而促進(jìn)環(huán)-磷酸腺苷（cAMP）水平升高[9]。cAMP可對多種酶和細(xì)胞代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，一方面活化甘油三酯酶，提高血漿脂肪酸含量，使游離脂肪酸進(jìn)入肌肉組織中加強(qiáng)氧化作用[10]；另一方面使糖原合成酶失活，促進(jìn)糖原分解，進(jìn)而加快脂肪分解和蛋白質(zhì)合成；二是降低脂肪細(xì)胞膜上胰島素受體數(shù)量，使葡萄糖進(jìn)入脂肪細(xì)胞的數(shù)量減少，從而降低脂肪沉積[11]。

“新型瘦肉精”類藥物容易在機(jī)體內(nèi)蓄積，一次性大量攝入或長期攝入將會引起機(jī)體急性中毒或慢性中毒，從而導(dǎo)致機(jī)體系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重影響身體健康。大量研究表明，苯乙醇胺A具有呼吸毒性、心血管毒性以及神經(jīng)毒性，其中毒癥狀主要表現(xiàn)為頭暈、無力、顫抖、心悸等，尤其對高血壓患者和心臟病患者來說，其中毒癥狀更為嚴(yán)重[12]；賽庚啶在體內(nèi)濃度過高會引起疲勞、嗜睡、內(nèi)分泌失調(diào)、抽搐等癥狀[13]；可樂定中毒表現(xiàn)為口干舌燥、心動緩慢等[14-15]；而巴氯芬則會引起惡心、頭疼、嘔吐、腹瀉甚至抑郁等中毒癥狀[16]。

2主要檢測方法

目前，“新型瘦肉精”的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等儀器檢測方法以及酶聯(lián)免疫法、免疫層析法、電化學(xué)發(fā)光免疫法等免疫分析方法。

2.1高效液相色譜法

高效液相色譜法根據(jù)樣品中各成分極性不同，在色譜柱內(nèi)將其分離，分別進(jìn)入檢測器中進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對樣品的分析[17]。Kountourellis等[18]采用高效液相色譜法檢測尿液中鹽酸賽庚啶含量，總回收率為76.16%，檢測線為15 ng/mL，操作簡單，靈敏度高、結(jié)果可靠。吳荷琴等[19]建立一種高效液相色譜法用于檢測動物性食品中鹽酸賽庚啶，檢測線為0.019～0.022 mg/kg，回收率為98%～100%，重復(fù)性RSD為5.5%（n=6），該方法靈敏度高，重復(fù)性好，能準(zhǔn)確檢測出動物性食品中鹽酸賽庚啶藥物殘留。樊宇飛等[20]在高液相色譜法基礎(chǔ)上引入二極管陣列檢測器（PDA），在對飼料中苯乙醇胺A的檢測中，檢測線為0.06 mg/kg，回收率高于90.36%，變異系數(shù)低于5.98%，該法通過對檢測部件和條件的優(yōu)化，極大地降低了檢測限，提高了方法的靈敏度，從而可迅速、準(zhǔn)確檢測出飼料中苯乙醇胺A藥物殘留。

在高效液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法兼具色譜技術(shù)高效的快速分離能力以及質(zhì)譜技術(shù)超高的靈敏度，可在多種物質(zhì)共同存在條件下對特定物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，且能夠?qū)崿F(xiàn)超痕量物質(zhì)的最低檢測。Feás等[21]建立了一種快速檢測藥物樣品中鹽酸賽庚啶的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測限為0.86 ng/mL，定量限為0.98 ng/mL，可用于7種不同藥物制劑中鹽酸賽庚啶檢測分析。Mendes等[22]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中鹽酸賽庚啶含量，將檢測限降低為0.05 ng/mL，檢測靈敏度大大提高。許秀琴等[23]同樣采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬毛中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶，其檢測限均為0.2 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%，該方法檢測限較低，但回收率范圍偏寬，為85%～110%。吳劍平等[24]在基礎(chǔ)方法上建立一種超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測豬尿中鹽酸賽庚啶藥物殘留，檢測限為0.05 μg/kg，回收率范圍為90.2%～109.7%，相比于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法檢測限更低，回收率范圍有所減小，且具有更高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.2氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法是氣相色譜分離組分后，質(zhì)譜再對各組分進(jìn)行定性、定量分析的一種檢測方法。氣相色譜分離效率高，分離能力強(qiáng)，而質(zhì)譜技術(shù)在鑒定化合物方面非常準(zhǔn)確，兩種技術(shù)結(jié)合起來使得檢測效率以及精確度更高，且可控性強(qiáng)，操作方便。楊正慧[25]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對食品中苯乙醇胺A進(jìn)行檢測，檢測限為3.8 ng/mL，但當(dāng)苯乙醇胺A濃度過低時，存在離子碎片相對豐度不穩(wěn)定的現(xiàn)象，影響試驗結(jié)果。Ye等[26]采用直接浸入式固相微萃取技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜法連用來檢測豬肉中的鹽酸賽庚啶，檢測限為3.6 ng/g，回收率為97.4%～105.7%，與傳統(tǒng)的方法相比，該方法檢測限低、回收率范圍小、成本低、檢測速度快，且已經(jīng)成功應(yīng)用于市場上豬肉樣品的分析與檢測。

2.3毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法根據(jù)樣品中各成分之間的淌度以及分配能力，以高壓電場作為驅(qū)動力，以毛細(xì)管作為分離通道，從而實現(xiàn)對樣品的分離和分析鑒定。該方法柱效高，分離速度快，選擇性強(qiáng)，樣品和試劑消耗少。李志業(yè)等[27]建立高效毛細(xì)管電泳法測定鹽酸賽庚啶片中鹽酸賽庚啶含量。該方法采用熔融石英毛細(xì)管柱，醋酸鹽作為運行緩沖液，其檢測限為0.002 g/L，最低定量限為0.007 g/L，該方法重復(fù)性較好且操作簡便。曹麗偉等[28]通過毛細(xì)管電泳法結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)建立一種新的聯(lián)合檢測方法來檢測血清中的巴氯芬含量，檢測限為6×10-10mol/L，回收率為95.8%～101.0%，該方法引入熒光素進(jìn)行標(biāo)記，使得靈敏度和檢測效率大大高。

2.4酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是一種可以進(jìn)行定性和定量分析的免疫分析方法，在食品安全檢測領(lǐng)域占有非常重要的地位[29-30]。利用ELISA方法對小分子危害物進(jìn)行檢測時多采用其間接競爭模式，如圖2所示，它利用抗原對抗體的特異性結(jié)合能力以及酶對底物的催化顯色作用，最后根據(jù)顏色反應(yīng)深淺和酶標(biāo)儀所測吸光度值來進(jìn)行定量或定性分析，操作簡單、靈敏度高、成本低廉且不需要專業(yè)的操作人員以及昂貴的儀器設(shè)備，可實現(xiàn)現(xiàn)場大批量樣品的快速檢測[31]，目前在一些“新型瘦肉精”藥物的快速檢測中已經(jīng)初步用到了此項技術(shù)。Wang等[32]研發(fā)了一種間接競爭ELISA試劑盒用于檢測豬肉樣品中苯乙醇胺A殘留，該試劑盒檢測限低于0.008 μg/kg，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.32 ng/mL，已成功應(yīng)用于屠宰后禽畜肉樣的檢測。顧文龍等[33]采用ELISA方法測定了豬尿中賽庚啶殘留，檢測限為169 ng/L，回收率為85.7%～95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～3.54%，該方法重復(fù)性好，回收率高。萬宇平等[34]同樣采用ELISA方法測定了動物組織中賽庚啶殘留，IC50為0.23 μg/L，檢測限為0.3 μg/L，但回收率范圍偏寬，為85.1%～114.5%。黃士新等[35]基于單克隆抗體建立一種測定動物尿液中賽庚啶留量的間接ELISA檢測試劑盒，該試劑盒檢測限為0.158 μg/L，IC50為0.316 μg/L，回收率在80%～110%，該試劑盒不但操作簡便，而且能夠完成多個樣品的同時檢測。

2.5膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法是基于抗原抗體的特異性結(jié)合和膠體金標(biāo)記技術(shù)建立的一種快速免疫分析檢測方法[36]。膠體金免疫層析試紙主要由樣品墊、膠體金結(jié)合墊、檢測線、質(zhì)控線、吸水墊等組成，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。在對樣品進(jìn)行檢測時，可根據(jù)層析膜上檢測線和質(zhì)控線呈現(xiàn)的特征顏色判定結(jié)果。與ELISA相比，該方法敏度高，對操作人員要求低，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，而且可實現(xiàn)多殘留檢測[37]。聶雯瑩等[38]基于單克隆抗體研制了快速檢測苯乙醇胺A殘留的膠體金免疫層試紙，試紙檢測限為5 μg/L，假陽性率和假陰性率均為0，且在對動物尿樣進(jìn)行檢測時，檢測結(jié)果和ELISA測定結(jié)果沒有差異，但回收率范圍偏大，為75%～105%。Dai等[39]同樣利用單克隆抗體研制了一種膠體金免疫層析試紙，在對豬尿中的苯乙醇胺A進(jìn)行檢測時，該試紙的IC50為0.52 ng/mL，檢測限為0.188 ng/mL，定量限為0.263 ng/mL，該試紙在特異性和靈敏度方面均有所提高。李明心[40]結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜和膠體金免疫層析技術(shù)研發(fā)了一種新型的免疫層析試紙，在對動物組織尿液中苯乙醇胺A進(jìn)行檢測時，IC50為0.06 ng/mL，檢測限為0.32 pg/mL，相對于其他免疫分析方法，靈敏度提高了1～3個數(shù)量級。

2.6電化學(xué)發(fā)光免疫法

電化學(xué)發(fā)光免疫法運用了免疫分析方法和電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)[36]。它與酶聯(lián)免疫吸附實驗的不同之處在于將電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑標(biāo)記在抗原或抗體上，通過與待檢靶標(biāo)物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的前后電化學(xué)發(fā)光信號的變化，并借助相關(guān)儀器放大顯示出來，以此來實現(xiàn)靈敏特異檢測。該方法無放射性污染，操作簡單，特異性強(qiáng)，靈敏度高[41]。與酶聯(lián)免疫吸附實驗相比，其靈敏度有所提高，與膠體金免疫層析法相比，其結(jié)果表現(xiàn)更加直觀，目前，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析等領(lǐng)域[42]。濟(jì)南大學(xué)張勇等[43]研發(fā)了一種無標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，在對動物性食品中苯乙醇胺A殘留進(jìn)行檢測時，回收率為93.5%～105%，結(jié)果相對偏差（RSD）小于3.3%，靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確。湯慶會[44]以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，在水相中合成CdSe量子點，所構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器對樣品中苯乙醇胺A殘留進(jìn)行檢測時，檢測線為0.015 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.997 6，原理如圖4所示。而閆盼盼[45]則以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，所構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器同樣對食品中的苯乙醇胺A殘留進(jìn)行檢測時，最低檢測限為0.008 4 ng/mL，相比湯慶會等所構(gòu)建的方法檢測限降低了一半，并且具有更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

3小結(jié)與展望

“新型瘦肉精”的出現(xiàn)以及在禽畜養(yǎng)殖中的違規(guī)濫用，導(dǎo)致其在動物源性食品中大量的殘留，嚴(yán)重威脅人體健康，因此，相關(guān)監(jiān)管部門必須加大對此類藥物的監(jiān)管力度。同時為提高檢測效率以及檢測的精準(zhǔn)度，建立快速、靈敏、特異的“新型瘦肉精”檢測方法尤為必要。目前，高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等儀器檢測方法已經(jīng)成熟應(yīng)用于“新型瘦肉精”殘留檢測，且因其選擇性強(qiáng)、分辨率高、假陽性低等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，但存在儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、不適合大批量現(xiàn)場篩查等局限，已不能滿足實際現(xiàn)場監(jiān)控的需要。相比之下，免疫分析方法利用高親和力抗體對抗原進(jìn)行特異性識別，靈敏度高、特異性強(qiáng)且可實現(xiàn)現(xiàn)場篩選和大批量樣品快速分析檢測。但免疫分析方法容易出現(xiàn)假陰性與假陽性結(jié)果，因此在特異性抗體的制備方面還需進(jìn)一步優(yōu)化和完善。隨著免疫分析方法的發(fā)展，現(xiàn)已形成包括酶聯(lián)免疫分析、膠體金免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光免疫分析、放射免疫分析等在內(nèi)的免疫分析體系，而今后針對“新型瘦肉精”免疫分析方法的研究也將不斷深入，為我國動物性食品安全提供更好的技術(shù)支撐。

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