楊學芳 李波 鄭紅

摘要[目的]鑒定樹鼩的腸道菌群，分析樹鼩腸道菌群多樣性和豐度，并進行菌群功能預測。[方法]隨機采集3份雄性樹鼩糞便樣品，提取樹鼩糞便中細菌基因組DNA，通過PCR擴增獲得16S rRNA V3～V4片段，采用高通量Illumina PE300 平臺進行測序，利用BIPES以及QIIME分析并比較菌群結構及多樣性。最后，通過PICRUS t軟件對腸道菌群的功能進行預測。[結果]樹鼩腸道糞便細菌有9門20綱33目53屬122種208個OTU。門水平上，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；

屬水平上，埃希氏桿菌屬（Escherichia）、乳酸菌屬（Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterocossus）為優(yōu)勢菌群。PICRUS t功能預測結果表明，腸道細菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關，其次是基因信息加工、環(huán)境信息加工。COG功能分類分析表明腸道微生物基因在“氨基酸的運輸和代謝”和“碳水化合物運輸與代謝”功能類群的相對豐度較高。[結論]PICRUS t功能預測到樹鼩腸道菌群主要與代謝相關，樹鼩腸道菌群是研究腸道菌群與代謝類疾病的一種良好試驗材料。

關鍵詞樹鼩；腸道菌群；16S rRNA；菌株功能

中圖分類號S852.21文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0101-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.026

Abstract[Objective]To identify the intestinal flora of Tupaia belangeri，analyze the diversity and abundance，and predict the function of the flora.[Method]Three male feces samples of T.belangeri were randomly collected，bacterial genomic DNA were extracted from the feces samples of T.belangeri to make PCR amplification.16S rRNA V3V4 fragments were obtained.The highthroughput Illumina PE300 platform was used for sequencing，and the structure and diversity of the bacterial flora were analyzed by BIPES and QIIME.The function of intestinal flora was predicted through PICRUS t.[Result]There were 9 phyla，20 phyla，33 orders，53 genera，122 species，208 OTU in the intestinal fecal flora of T.belangeri.Firmicutes and Proteobacteria dominated at the level of phylum.

At the level of genus，Escherichia，Lactobacillus and Enterocossus were the dominant flora.The functional prediction results by PICRUS t showed that most genes encoded by gut bacteria were associated with metabolic "metabolism"，followed by genetic information processing "based information processing"，environmental information processing "environmental information processing".COG gene function classification statistics showed that the relative abundance of intestinal flora in "amino acid transport and metabolism" and "carbohydrate transport and metabolism" were higher.[Conclusion]The function of PICRUS t predicted that the intestinal flora of T.belangeri was mainly related with the metabolism，and the intestinal flora of T.belangeri was a good experimental material for studying intestinal flora and metabolic diseases.

Key wordsTupaia belangeri；Intestinal flora；16S rRNA；Function of strain

樹鼩隸屬攀緣目（Scandentia）樹鼩科（Tupaiidae），是靈長類動物的近親[1]。研究表明，樹鼩在進化關系、解剖結構、新陳代謝等方面比大鼠、小鼠更接近于人類[2]，常用于替代或減少一些非人靈長類動物的使用，在腫瘤學、內(nèi)分泌學、神經(jīng)生物學、生殖生物學、免疫學等方面對樹鼩已有廣泛和深入的研究[3]。

腸道是人體最大的消化和排泄器官，存在數(shù)以億計的微生物與宿主共生，腸道菌群是宿主不可或缺的一部分。正常腸道菌群在宿主營養(yǎng)代謝、藥物代謝、免疫調節(jié)等方面起著重要作用[4]。腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用是彼此多方向的、交互式的化學交流傳遞通道[5]。腸道菌群產(chǎn)生的膽汁酸、膽堿、短鏈脂肪酸是宿主健康所必需的物質[6]。機體的正常活動以及消化食物、機體免疫功能及抗病能力、排便功能等都離不開菌群的參與，并需要它們發(fā)揮應有的作用，正常菌群的失調可能導致諸多疾病[7]。

以前采用傳統(tǒng)的分離與培養(yǎng)、構建克隆文庫、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）、熒光原位雜交（FISH）等方法揭示腸道微生物的多樣性[8]，但這些方法有很大的局限性。高通量測序技術作為新一代的測序方法，具有較高的準確性和靈敏度，極大地提高了對樣品中微生物多樣性分析的深度和廣度，加深人們對腸道微生物菌群的結構和功能的了解?；诩毦?6S rRNA 的高通量基因測序分析已成為研究腸道菌群與疾病間關系的重要工具。筆者通過高通量測序細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)測序，鑒定樹鼩的腸道菌群，對樹鼩腸道菌群多樣性、豐度和菌群功能代謝進行了預測。

1材料與方法

1.1試驗動物

3只健康成年雄性樹鼩，體重140～160 g，來源于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部[SCXK（滇） K2013-0002]，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學普通級實驗室，單籠飼養(yǎng)，飲用城市供應的自來水，每日定時飼喂全價顆粒飼料，動物飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，濕度 40%～60%，明暗交替照明12 h。

1.2方法

1.2.1樹鼩糞便的收集。抓取并保定樹鼩，多數(shù)樹鼩在抓取過程中因緊張而主動排出糞便，對無糞便者輕輕按摩其腹部，使其排便，每只樹鼩采集豌豆粒大小的新鮮糞便標本。

1.2.2糞便樣品的混懸與稀釋。將糞便樣品混懸到無菌生理鹽水中后，以10倍遞增梯度進行稀釋。

1.2.3DNA的提取與檢測。

使用糞便基因組提取試劑盒E.Z.N.A. soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），從樹鼩糞便樣品中提取細菌DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行定性檢測。

1.2.4PCR擴增。按照指定測序區(qū)域，擴增的目標區(qū)域為16S rRNA基因的V3和V4區(qū)域，引物名稱為338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） ，合成帶有barcode的特異引物。

1.2.5熒光定量。

參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用Quanti FluorTM -ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，此后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.2.6Miseq文庫構建和Miseq測序。文庫的制備和上機測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3生物信息學分析Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，按照97%相似性對非重復序列進行OTU（operational taxonomic unit）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格?；赟ilva數(shù)據(jù)庫，應用RDP classifier 2.2對每個OTU的最長16S rRNA序列片段進行相似性比對，統(tǒng)計每個樣本中細菌在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上的構成[9]。在上述分析的基礎上，對樹鼩腸道菌群代謝功能預測等進行分析。

PICRUS t對OTU豐度表進行標準化，去除16S marker gene在物種基因組中的拷貝數(shù)目的影響；然后，通過每個OTU 對應的green gene id，比對到COG和KEGG庫，獲得OTU對應的COG家族信息和KO信息；計算各COG的豐度和KO豐度。根據(jù)比對到COG庫的COG編號，可以從基因的進化譜系（egg NOG）數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息及其功能信息，從而得到功能豐度譜；根據(jù)比對到KEGG數(shù)據(jù)庫的信息，獲得KO、Pathway、EC信息，并根據(jù)OTU豐度計算各功能類別的豐度。

2結果與分析

2.1測序結果物種注釋與評估

從3只成年雄性樹鼩的糞便樣品中共得到高質量質控序列58 328條，序列長度主要分布在441～460 bp，其他少量分布在421～440 bp。

2.1.1樹鼩腸道菌群α-多樣性指數(shù)分析。從圖1可以看出，3個樹鼩樣品的α-多樣性相差不大。

2.1.2OTUs稀釋曲線。從圖2可以看出，隨著測序深度的逐漸增加，OTUs稀釋曲線趨于平坦，說明更多的測序數(shù)量對于OTU的邊際貢獻較小，測序的數(shù)據(jù)量較為合理。3個樣品的稀釋曲線趨于平緩（圖2），說明樣品測序量是足夠的，足以覆蓋所有微生物的組成。

2.2樹鼩腸道菌群的物種組成分析

在97%的相似水平上進行OTU序列分類，共聚成208個可操作分類單元（OUT）。腸道細菌隸屬9門20綱33目53屬122種。這9個門分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬 桿 菌 門 （Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、 柔膜菌門（Tenericutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）。從圖3可以看出，門水平上優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria，占61.22%）和厚壁菌門（Firmicutes，占36.65%）。從圖4可以看出，屬水平上埃希氏桿菌屬（Escherichia）占59.72%，乳酸菌屬（Lactobacillus）占26.86%，腸球菌屬（Enterocossus）占6.36%，這3個屬為優(yōu)勢菌群。

2.3PICRUS t軟件預測

腸道細菌菌群功能基因和代謝途徑分布表明，KEGG代謝通路中樹鼩腸道細菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關（表1）。COG功能分類統(tǒng)計結果表明，微生物基因在“氨基酸的運輸和代謝”和“碳水化合物運輸與代謝”功能類群的相對豐度較高（圖5）。

3討論

筆者通過16S rRNA高通量測序分析樹鼩腸道菌群，共得到9門20綱33目53屬122種208個OUT。該試驗覆蓋率為0.99，說明樹鼩大腸細菌99.9%多樣性情況得到體現(xiàn)。每個樣本的稀釋曲線都趨于平緩，表明該試驗的測序量能夠覆蓋各樣本的大多數(shù)微生物。樹鼩腸道細菌門水平上豐度較高的是變形菌門和厚壁菌門。其他菌群為放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門、柔壁菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍細菌門、螺旋體菌門。在門水平上，樹鼩腸道菌群比嚙齒類動物（大鼠、小鼠）更接近于人類。研究表明，小鼠腸道菌群在門水平上主要為放線菌門、擬桿菌門、脫鐵桿菌門（Deferribactcres）、廣古菌門（Euryarchaeota）、壁厚菌門、變形菌門、柔壁菌門、疣微菌門9個門[10]。大鼠糞便菌群主要為厚壁菌門、擬桿菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門[11]。人體腸道中的菌群主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門，這3門細菌占總細菌量的80%以上，其他細菌主要有藍藻菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門、 疣微菌門、螺旋體菌門。在健康人類和樹鼩腸道菌群被鑒定到的螺旋體菌門，在大小鼠腸道菌群中未被發(fā)現(xiàn)。

使用PICRUS t軟件計算方法[12-13]預測微生物16S rRNA文庫，對其功能基因和類群進行了探索，進而將菌群結構與宿主代謝相聯(lián)系。研究表明，PICRUS t軟件對腸道菌群功能基因預測的準確度為85%～90%[14]。該軟件在 KEGG通路水平輸出預測的代謝功能豐度，得到的通路譜用于下游比較分析。通過與KEGG的比對搜索，筆者發(fā)現(xiàn)腸道細菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關，其次是基因信息加工、環(huán)境信息加工。

COG功能分類統(tǒng)計表明，腸道微生物基因在“氨基酸的運輸和代謝”和“碳水化合物運輸與代謝”功能類群的相對豐度較高，說明這些腸道細菌的主要功能是維持正常狀態(tài)下細胞的基本生理活動。功能基因主要與代謝相關，推測樹鼩腸道菌群可能是研究代謝類相關疾病的良好動物模型。

腸道菌群與宿主的營養(yǎng)、疾病的發(fā)生發(fā)展等密切相關[15]。宿主為腸道菌群的生長繁殖提供必要條件，菌群在腸道內(nèi)代謝活動產(chǎn)生物質作用于宿主，影響宿主整個生命過程。腸道微生物在宿主體內(nèi)具有抵御病原菌侵襲、促進免疫器官成熟、激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用等功能，例如微生物可以與腸道黏膜上皮細胞結合，產(chǎn)生一些抑菌物質，發(fā)動非特異性防御功能[16]。厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發(fā)酵，厚壁菌門和擬桿菌門可協(xié)助宿主從本身無法消化的食物成分中提取更多的能量，維持動物腸道的健康[17]。因而，研究腸道菌群多樣性及菌株對宿主的功能對于探討人類疾病的發(fā)生機制具有重要意義。

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