劉松青 鄭潔 王春臺(tái)

摘要 [目的]建立武陵山區(qū)稻瘟病菌生理小種分子鑒定體系。[方法]選用RAPD、REMAP、Rep-PCR 3種分子標(biāo)記和無(wú)毒基因檢測(cè)，對(duì)武陵山區(qū)稻瘟病菌生理小種文庫(kù)中2013—2015年分離的220個(gè)菌株進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建和聚類分析。[結(jié)果]共統(tǒng)計(jì)26對(duì)引物擴(kuò)增得到的3年樣本中穩(wěn)定出現(xiàn)的97條具有多態(tài)性的條帶。聚類分析結(jié)果顯示，在 0.75的相似性水平上可將220個(gè)菌株分為12個(gè)遺傳譜系，譜系10為優(yōu)勢(shì)譜系，不同年份的稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)存在一定差異，但并未發(fā)生明顯演化。[結(jié)論]建立了新的武陵山區(qū)稻瘟病菌生理小種分子鑒定體系，為該地區(qū)抗稻瘟病菌品種的選育和布局提供參考。

關(guān)鍵詞 稻瘟病菌；遺傳譜系；鑒定體系；武陵山區(qū)

中圖分類號(hào) S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）09-0144-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.043

Abstract [Objective]To establish molecular identification system of Magnaporthe oryzae in the Wuling Mountain Area of China.[Method]Marker system including RAPD，REMAP，RepPCR and Avr genes was developed for fingerprint mapping and cluster analysis of 220 M.oryzae isolates collected from the Wuling Mountain Area during 2013-2015.[Result]A total of 97 polymorphic bands amplified by 26 pairs of primers were counted.The cluster analysis data showed that 220 strains could be divided into 12 genetic lineages at the 75% similarity level，and the lineage 10 was the dominant lineage.There were some differences in the genetic structure of M.oryzae populations in different years，but no significant evolution occurred.[Conclusion]The study established a new molecular identification system for M.oryzae in the Wuling Mountain Area， and provided a reference for the breeding and distribution of the M.oryzae resistant varieties in this area.

Key words Magnaporthe oryzae；Genetic lineage；Identification system；Wuling Mountain Area

稻瘟病是水稻重要的病害之一，可引起水稻大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn) 40% ～ 50%[1]。在防治稻瘟病的幾種手段中，培育抗病品種仍是最經(jīng)濟(jì)有效的方法[2]。然而，稻瘟病菌具有復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)且變異頻繁，可以在抗病品種田間應(yīng)用的短短幾年內(nèi)克服其抗性[3]。因此，分析稻瘟病菌的遺傳結(jié)構(gòu)和變異規(guī)律可為預(yù)測(cè)病害的發(fā)生及指導(dǎo)抗病品種的分布提供重要依據(jù)，可有效預(yù)防宿主抗性喪失引起的疾病流行[4]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被大量運(yùn)用到稻瘟病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中，且取得了巨大進(jìn)展[5]。最常用的分子標(biāo)記包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 - 微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性（REMAP）、Rep-PCR技術(shù)、特異性擴(kuò)增片段（SCAR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）等[6]，其中RAPD、REMAP、Rep-PCR操作簡(jiǎn)單，成本低廉，僅需少量DNA和無(wú)需放射性等優(yōu)點(diǎn)。此外，Huang等[7]、Imam等[8]、Selisand等[9]還開(kāi)發(fā)了基于Avr基因的鑒定手段以確定稻瘟病種群的毒力譜。

武陵山區(qū)是稻瘟病重災(zāi)區(qū)，水稻種植面積超過(guò)70萬(wàn)hm2，最嚴(yán)重時(shí)武平縣稻瘟病病田率達(dá)100%[10]。該地區(qū)地形比較復(fù)雜，山巒呈高低起伏分布，各地方相對(duì)海拔差距較大。水稻作為該地區(qū)的主要農(nóng)作物，稻田主要分布在一些峽谷和溝渠中[11]。由于該地區(qū)全年雨量充沛，霧露多，濕氣重，水稻生長(zhǎng)期的溫度和濕度均很高，非常適合稻瘟病菌的繁殖，導(dǎo)致武陵山區(qū)稻瘟病菌的生理種類豐富，種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，侵略性強(qiáng)。作為國(guó)家防治稻瘟病的重點(diǎn)區(qū)域，鄂西南地區(qū)是研究稻瘟病的理想地區(qū)。

在前期研究中，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從武陵山區(qū)采集了感染稻瘟病的水稻稻稈，構(gòu)建了生理小種文庫(kù)[12]，并對(duì)2012—2014年分離得到的稻瘟病菌生理小種進(jìn)行了致病性分析[13]與遺傳多樣性分析[4]。筆者在沿用李泌等[12]的分子標(biāo)記鑒定體系的基礎(chǔ)上，使用RAPD、REMAP、Rep-PCR及無(wú)毒基因4種鑒定手段，共26對(duì)引物，對(duì)2013—2015年分離的稻瘟病菌進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，統(tǒng)計(jì)了指紋圖譜中具有多態(tài)性的主帶并建立新的分子鑒定體系，旨在為后續(xù)的分子鑒定提供便利，并為該地區(qū)抗稻瘟病菌品種的選育和布局提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。所用稻瘟病菌生理小種均由武漢中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。

燕麥片培養(yǎng)基：取無(wú)糖燕麥片30 g置于鍋內(nèi)，然后加入清水1 000 mL，煮沸約5 min，過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾燕麥殘?jiān)＿^(guò)濾液內(nèi)加入蔗糖15 g，瓊脂7 g，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，3 g酵母提取物，加水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌絲獲取。

從保存菌種的濾紙條[14]上剪下一小片置于燕麥培養(yǎng)基中心，26 ℃培養(yǎng)7 d左右。用接種針挑取菌塊（1 mm×1 mm）于液體培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3～4 d。鑷子夾取菌絲體至2 mL EP管，離心去上清后用真空冷凍干燥機(jī)干燥菌絲，搗碎備用。

1.2.2 DNA提取。用10% SDS和2% CTAB對(duì)約50 mg菌絲粉末進(jìn)行基因組DNA的提取[15]，將提取的基因組DNA直接電泳（0.8% 瓊脂糖凝膠）檢測(cè)質(zhì)量及濃度，條帶清晰的DNA用于后續(xù)PCR的擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增。

選取RAPD、REMAP、rep-pot2-PCR 3種分子標(biāo)記以及無(wú)毒基因?qū)Φ疚敛【蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系見(jiàn)表1～4，引物見(jiàn)表5。擴(kuò)增RAPD擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，35 ℃，40 s，72 ℃，2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

REMAP擴(kuò)增程序（Tm統(tǒng)一代表不同引物的退火溫度）：92 ℃，5 min；92 ℃，45 s，Tm，45 s，72 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

Rep-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃，2.5 min；94 ℃，1 min，62 ℃，1 min，65 ℃，10 min，4個(gè)循環(huán)；94 ℃，30 s；62 ℃，1 min，65 ℃，10 min，26個(gè)循環(huán)；65 ℃，15 min；4 ℃，保存。

無(wú)毒基因擴(kuò)增程序（Tm統(tǒng)一代表不同引物的退火溫度）：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，Tm，45 s，72 ℃，90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。

RAPD及REMAP PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，Rep-PCR和無(wú)毒基因PCR產(chǎn)物分別用0.8%和1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，上樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD電泳檢測(cè)結(jié)果 使用16 對(duì) RAPD 引物對(duì) 2013—2015 年分離的 220 個(gè)稻瘟病菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增（2013年部分結(jié)果見(jiàn)圖1），結(jié)果所有條帶均大于 500 bp，對(duì)照無(wú)條帶產(chǎn)生。對(duì)3年樣本的擴(kuò)增條帶進(jìn)行比較，選擇明顯、穩(wěn)定、清晰的條帶，統(tǒng)計(jì)了 73 個(gè)條帶。

2.2 REMAP電泳檢測(cè)結(jié)果 使用LTR1+ISSR1/4/6這3對(duì)REMAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（2013年擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2），由圖2可知，大部分條帶分布于100～2 000 bp，少量條帶大于2 000 bp，對(duì)照無(wú)條帶。對(duì)比2013—2015年樣本擴(kuò)增結(jié)果，得到了11 個(gè)穩(wěn)定且有多態(tài)性的帶型。

2.3 Rep-PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

用pot2-1+pot2-2對(duì)2013—2015年分離的稻瘟病菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增（2013年菌株擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3），由圖3可知，大部分條帶分布于1 000～10 000 bp，獲得5個(gè)穩(wěn)定帶型。

2.4 無(wú)毒基因擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果

對(duì)220個(gè)稻瘟病菌進(jìn)行了包括Avr-pita、Avr-pizt、Avr-ACE1、Avr1-CO39、Avr-pit、Avr-pia的6個(gè)無(wú)毒基因的檢測(cè)（2013年擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4）。由圖4可知，2013年分離的稻瘟病菌都有無(wú)毒基因Avr-pizt，在是否含有無(wú)毒基因Avr-pia、Avr-pita、Avr1-CO39上具有一定差異，但總體上差異不顯著。

2.5 鑒定體系建立

根據(jù)220個(gè)稻瘟病菌生理小種的PCR擴(kuò)增結(jié)果，由于RAPD具有重復(fù)性差的缺點(diǎn)，從分子標(biāo)記RAPD擴(kuò)增得到的超過(guò)118條帶型中選擇73條穩(wěn)定出現(xiàn)、條帶清晰、且3年間穩(wěn)定存在的帶型，加上REMAP和Rep-PCR中分別得到的11和5條帶型以及對(duì)6對(duì)無(wú)毒基因的檢測(cè)，共得到97條能有效區(qū)分不同生理小種的條帶，將其命名為武陵山區(qū)稻瘟病菌生理小種分子鑒定體系（圖5）。

2.6 聚類分析

根據(jù)鑒定體系中對(duì)應(yīng)條帶擴(kuò)增的有無(wú)，有賦值為“1”，無(wú)則賦值為“0”，構(gòu)建了“0-1”數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用PAST v 3.16對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用未加權(quán)對(duì)組平均（UPGMA）算法和Dice相似性指數(shù)評(píng)估各菌株之間的相似性。聚類結(jié)果顯示，在相似性系數(shù)為0.75時(shí)，220個(gè)菌株被分為12個(gè)遺傳譜系，其中譜系1、2、4、5、7、12為2015年的單個(gè)菌株，譜系3譜系和8包含2個(gè)2015的菌株、譜系6和譜系9分別包含4個(gè)和9個(gè)2015年的菌株。譜系10為優(yōu)勢(shì)譜系，包括33個(gè)2013年菌株，26個(gè)2014年菌株和137個(gè)2015年菌株（圖6）。

3 討論

在SSR、REMAP、RAPD和AFLP等分子標(biāo)記中的運(yùn)用中，通常僅應(yīng)用1種或2種類型的標(biāo)記用于分析，得到的信息較少，特別是當(dāng)群體數(shù)目龐大時(shí)不能有效地將其分離。該研究將4種鑒定手段（RAPD、REMAP、Rep-PCR和Avr基因）組合起來(lái)形成一個(gè)鑒定系統(tǒng)，用于對(duì)該研究中使用的220個(gè)菌株進(jìn)行分離，且這4種標(biāo)記的檢測(cè)僅需要通過(guò)常規(guī)的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳即可完成。因此，該研究建立了一種簡(jiǎn)單、低成本、有效的稻瘟病菌遺傳多樣性分析鑒定系統(tǒng)。基于此鑒定系統(tǒng)，該研究將220個(gè)菌株分成12個(gè)遺傳譜系。結(jié)果顯示，譜系10為優(yōu)勢(shì)譜系，包含97%的2013年菌株、100%的2014年菌株和84%的2015年菌株。表明3年間，武陵山區(qū)稻瘟病菌的遺傳結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著變化，但隨著時(shí)間的推移，菌群的遺傳背景發(fā)生了一定程度的演化，與楊小林等[16]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步證明了該研究所建立的武陵山區(qū)稻瘟病菌生理小種的分子鑒定體系的有效性，可為后續(xù)武陵山區(qū)稻瘟病菌群體演化研究及抗病品種的選育提供極大的便利。

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